多肽小分子的药物及其在治疗急性髓系白血病中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010187683.1 (22)申请日 2020.03.17 (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 (72)发明人 张辉于霏张旭 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 段卉 (51)Int.Cl. C07K 7/08(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 一种多肽小分子的药物及其在治疗急性髓 系白血病中的应用 (57。

2、)摘要 本发明公开了一种多肽小分子的药物及其 在治疗急性髓系白血病中的应用， 其氨基酸序列 如SEQ ID NO： 1所示。 其左旋和右旋形式都具有 很好的生物活性， 能够有效诱导急性髓系白血病 细胞分化； 同时， 其没有细胞毒性及体内免疫原 性； 更进一步地， 其左旋和右旋形式具有相同的 诱导急性髓系白血病细胞的潜能， 没有细胞毒性 及体内免疫原性， 且不易于降解， 能够作为靶向 治疗急性髓系白血病的潜在药物。 比之前的药物 更具安全性， 产生成本低廉， 且具有更广泛的适 用范围， 适用于靶向诱导急性髓系白血病细胞分 化， 是更具潜力的新型药物。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图。

3、3页 CN 111848737 A 2020.10.30 CN 111848737 A 1.一种具有治疗急性髓系白血病作用的多肽， 其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示。 2.根据权利要求1所述的多肽， 其特征在于， 所述多肽为左旋和/或右旋形式。 3.氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示的多肽在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 治疗急性髓系白血病为抑制急性髓系白血 病细胞分化。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述多肽为左旋和/或右旋形式。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111848737 A 2 一。

4、种多肽小分子的药物及其在治疗急性髓系白血病中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 更具体地， 涉及一种多肽小分子的药物及其在治 疗急性髓系白血病中的应用。 背景技术 0002 白血病是一种恶性肿瘤， 能够影响血液， 骨髓， 淋巴系统及正常造血细胞的分化。 根据细胞类别转化及临床特征可以分为四大类， 分别是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia， AML)， 慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia， CML)， 急性淋巴白血病 (acute lymphocytic leukemia， ALL)和慢性淋巴白血病(chronic l。

5、ymphocytic leukemia， CLL)。 AML由一群具有侵略性， 并在基因和临床上具有异质性的血液肿瘤细胞组 成的。 其主要的特征表现为髓样前体细胞克隆增殖， 分化为成熟细胞的能力下降， 并且造血 功能受损， 因此经常会导致供血不足(如， 粒细胞减少症， 血小板减少症， 贫血症等)， 并有可 能伴随白细胞增多现象。 AML的临床指征及症状十分多样化且不具有特异性， 但通常可以直 接归因于白血病细胞浸润骨髓， 导致血细胞减少。 0003 AML是一种老年疾病， 患者年龄的中位值为67岁， 有超过三分之一的患者在75 岁 以上。 随着人口老龄化， AML成为更严峻且普遍的问题， 迄今。

6、每10万人中就有3.6 人罹患 AML。 AML的标准治疗方案是早期进行强诱导化疗， 达到完全缓解(complete remission， CR) 后根据患者复发的风险进行巩固化疗或异体造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation， allo-HSCT)。 不适合强烈化疗(intense chemotherapy， IC) 的老年患者只能使用缓解剂(如， 去甲基化药物)进行降低强度的治疗。 但不幸的是， 现有治 疗的方案预后均相对较低， 60岁以内的患者CR率约为 6070， 但是整体治愈率只有 35至40。 老年患者及不。

7、良核型患者的CR率为 3550， 而治愈仅有10甚至更低。 如果患者复发， 通过再诱导化疗达到二次清除 (CR2)后， 再利用allo-HSCT进行治疗， 其治 愈率为3040。 但是， 在复发的患者中， 只有及少数可以达到CR2， 有资格进行allo- HSCT， 并且第一次复发后的5年生存率仅有11。 0004 天然左旋氨基酸是蛋白质组成的基础， 自然界中存在的蛋白质基本均由左旋氨基 酸构成。 左旋氨基酸的镜像对映体为右旋氨基酸， 互为对映体的两种氨基酸具有相同的物 理及化学性质， 但是它们旋转平面偏振光的方向是相反的。 尽管右旋蛋白合成成本较高， 但 因其具有独特的立体化学特性， 很少作。

8、为内原蛋白酶的底物， 因而能够抵抗大多数内源酶 的降解作用。 利用这种立体化学构象的优势， 可以提高生物活性分子的蛋白水解稳定性， 使 其在体内循环的半衰期增长， 使右旋肽段基础的药物传递系统比对应的左旋肽段构型更有 效。 0005 目前， 几乎没有特效药物可以治愈急性髓系白血病， 因此， 临床上迫切需要能够诱 导急性髓性白血病细胞分化的有效药物。 说明书 1/5 页 3 CN 111848737 A 3 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种多肽小分子的药物及其在治疗急性髓系白血病中的 应用。 0007 本发明的第一个目的在于提供一种具有治疗急性髓系白血病作用的多肽。 0008 本发明。

9、的另一个目的在于提供氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示的多肽在制备治疗 急性髓系白血病药物中的应用。 0009 本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的： 0010 一种具有治疗急性髓系白血病作用的多肽， 其氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示 (QDVTLLLNFGAL)。 0011 优选地， 所述多肽为左旋和/或右旋形式。 0012 氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示的多肽在制备治疗急性髓系白血病药物中的应 用。 0013 优选地， 治疗急性髓系白血病为抑制急性髓系白血病细胞分化。 0014 优选地， 所述多肽为左旋和/或右旋形式。 0015 与现有技术相比， 本发明具有以。

10、下有益效果： 0016 本发明提出了一种用以诱导急性髓系白血病细胞分化的多肽， 其左旋和右旋形式 都具有很好的生物活性， 能够有效诱导急性髓系白血病细胞分化； 同时， 其没有细胞毒性及 体内免疫原性； 更进一步地， 其左旋和右旋形式具有相同的诱导急性髓系白血病细胞的潜 能， 没有细胞毒性及体内免疫原性， 且不易于降解， 能够作为靶向治疗急性髓系白血病的潜 在药物。 比之前的药物更具安全性， 产生成本低廉， 且具有更广泛的适用范围， 适用于靶向 诱导急性髓系白血病细胞分化， 是更具潜力的新型药物。 附图说明 0017 图1为功能性噬菌体展示流程图； 利用噬菌体展示技术诱导THP-1细胞系分化， 。

11、将 分化的贴壁细胞上结合的噬菌体单克隆洗脱并富集， 经过三轮诱导后进行单克隆测序， 筛 选出具有诱导THP-1细胞细分化潜力的噬菌体单克隆。 0018 图2为经过3轮噬菌体展示诱导， THP-1细胞系的黏附比逐渐升高； A： 通过光镜观察 经过噬菌体展示技术诱导的THP-1细胞系， M13噬菌体空载(Empty Vector) 诱导组为阴性 对照， PMA诱导组为阳性对照， 在3轮噬菌体展示诱导中， THP-1细胞的黏附比逐渐上升； B： 定 量分析THP-1黏附比的方法流程图， 分别收集细胞培养上清中的细胞及贴壁细胞， 在其中加 入等量的FITC-beads， 经过流失分析检测确定其比例； 。

12、C： 定量分析， 经过多轮噬菌体展示诱 导的THP-1细胞系的黏附比逐渐升高。 0019 图3为筛选可以诱导THP-1细胞系分化的单克隆受体； A： 经过3轮噬菌体展示筛选， 4种不同的噬菌体单克隆逐渐富集占据主导地位； B： 分别利用4种噬菌体单克隆对THP-1细 胞系进行诱导， 其中PHD 3-9能够诱导细胞产生较高的黏附比。 0020 图4为多肽能够诱导THP-1细胞系发生分化； A： 目标多肽能够诱导THP-1细胞系发 生形态学变化； B： 目标多肽能够诱导THP-1细胞系核质比及染色质凝聚程度降低。 0021 图5为THP-1经目标多肽诱导后细胞表面受体的表达； A： 目标多肽能够诱。

13、导 CD11b 的表达上升； B： 目标多肽能够诱导CD14的表达上升。 说明书 2/5 页 4 CN 111848737 A 4 0022 图6为目标多肽在急性髓系白血病小鼠模型中的应用； A： 对照组及多肽治疗组荷 瘤小鼠生存曲线。 多肽治疗组小鼠的生存时间显著高于对照组， 灰色为对照组生存曲线， 通 过尾静脉注射对照多肽， 蓝色为多肽治疗组的生存曲线， 通过尾静脉注射目标多肽； B： 目标 多肽能够抑制荷瘤小鼠模型肿瘤体积增长， 多肽治疗组小鼠的肿瘤大小显著小于对照组， 灰色为对照组生存曲线， 通过尾静脉注射对照多肽， 蓝色为多肽治疗组的生存曲线， 通过尾 静脉注射目标多肽； C： 目标。

14、多肽不影响荷瘤小鼠模型的体重， 多肽治疗组小鼠的体重与对 照组无显著差异， 灰色为对照组生存曲线， 通过尾静脉注射对照多肽， 蓝色为多肽治疗组的 生存曲线， 通过尾静脉注射目标多肽； D： 多肽治疗组与野生型(WT)对照组小鼠肝肾功能指 标检测， 多肽治疗组小鼠无肝肾功能损伤。 ALT， 谷丙转氨酶； AST， 谷草转氨酶； Urea， 尿素； CR， 肌酐； L-SEQ NO:1 为SEQ NO:1左旋多肽； D-SEQ NO:1为SEQ NO:1右旋多肽。 具体实施方式 0023 下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述， 所述实施例只用于解释本 发明， 并非用于限定本发明的范围。 。

15、下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明， 均为常 规方法； 所使用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 为可从商业途径得到的试剂和材料。 0024 实施例1功能性噬菌体筛选技术 0025 一、 实验方法 0026 THP-1细胞系是一种常用的模拟AML5的实验细胞系， 它是一种成熟的人单核细胞 模型， 可以经过诱导分化为巨噬细胞形态。 其分化最直观的特点是细胞黏附比例升高， 同时 由于细胞质体积的增大而导致核质比减小。 因此， 利用M13噬菌体展示文库对THP1细胞进行 诱导， 并富集与黏附细胞结合的噬菌体单克隆， 经过3轮噬菌体展示， 筛选出可能诱导THP-1 细胞系分化的单克隆噬菌体(图1。

16、)。 0027 具体操作方法如下： 0028 1.用含有胎牛血清的RPMI1640培养基将THP-1细胞系以105个细胞/毫升的密度重 选， 并与至少1011pfu的噬菌体文库共孵育， 培养72小时后轻微震荡， 用PBS溶液洗去悬浮细 胞， 用含有2EDTA的PBS将分化后贴壁的THP-1细胞系洗脱离心。 0029 2.用含有1mg/ml的0.2M甘氨酸-HCl溶液(pH 2.2)重悬步骤1中获得的细胞， 室温 轻柔震荡1020分钟后， 每毫升用150 l的1M Tris-HCl溶液(pH 9.1)中和， 获得洗脱的目 的噬菌体。 0030 3.将步骤2中获得的目的噬菌体进行扩增及滴度测定， 。

17、当滴度达到1011pfu/ml后， 重复步骤1。 0031 4.反复筛选3次后将获得的目的噬菌体进行后续单克隆测序。 0032 二、 实验结果 0033 经过3轮噬菌体筛选， 在光镜下进行观察， 发现THP-1细胞系经过诱导后的黏附率 逐渐上升(图2A)。 为了更准确地定量检测THP-1细胞系黏附率上升的比例， 分别收集了培养 上清中的悬浮状态细胞与洗脱下来的黏附状态细胞， 并分别加入等量的 FITC-beads， 经过 流式分析检测， 确定THP-1细胞系经过诱导后的黏附比例(图2B)。 以PMA(佛波醇12-十四酸 酯13-乙酸酯CAS#:16561-29-8)刺激的THP-1细胞系为阳性。

18、对照， M13空载噬菌体诱导组为 阴性对照。 经检测发现， 经过三轮噬菌体筛选富集及诱导， THP-1细胞系的黏附率显著上升 说明书 3/5 页 5 CN 111848737 A 5 (图2C)。 结果显示， 在噬菌体文库中存在能够诱导THP-1细胞系分化的多肽。 0034 实施例2噬菌体单克隆的分离测序及筛选 0035 一、 实验方法 0036 分别对实施例1的三轮噬菌体展示筛选中与贴壁THP-1细胞相结合的噬菌体进行 洗脱分离， 并分别进行单克隆噬菌体扩增及测序。 此方法下所筛选出的目标噬菌体单克隆， 其具有的氨基酸序列是对目的细胞具有最高诱导功能的多肽。 0037 二、 实验结果 003。

19、8 发现其中4种噬菌体单克隆在第三轮筛选后占据主导地位(表1)， 并随着噬菌体展 示轮数的增加而富集(图3A)。 分别将这四种噬菌体单克隆命名为PHD 3-1， PHD 3-2， PHD 3- 6及PHD 3-9， 并利用这四种噬菌体单克隆对THP-1细胞进行诱导， 结果发现PHD 3-9(其氨基 酸序列如SEQ ID NO： 1所示)能够诱导THP-1细胞系产生较好的黏附比(图3B)。 0039 表1： 噬菌体单克隆序列。 0040 Peptide ID Amino acid Sequence PHD 3-1 CCQSYATLYTPL PHD 3-2 QFCGTSGEAPSP PHD 3-6。

20、 QFPGFGTELPSS PHD 3-9 QDVTLLLNFGAL(SEQ ID NO： 1) 0041 实施例3多肽PHD 3-6的左旋和右旋形式的诱导功能鉴定 0042 一、 细胞形态学检测 0043 1、 实验方法 0044 细胞形态改变是判断单核细胞系发生分化的重要标志。 通过光学显微镜及 Wright-Giemsa染色可以直观地观测到细胞形态及核型发生改变。 分别合成了实施例2 中 筛选出的噬菌体单克隆PHD 3-9(其氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示)的左旋和右旋形式。 合 成多肽诱导的THP-1细胞系作为实验组， PMA诱导组为阳性对照， 随机多肽诱导组为阴性对 照组，。

21、 经过5天培养后检测THP-1细胞系的形态变化。 0045 2、 实验结果 0046 通过光镜观察可以发现， 在多肽PHD 3-9的左旋和右旋形式的分别诱导下THP-1 细胞系的形态发生了明显的变化， 粘附性增强。 细胞形态由未分化的圆球状， 成为梭状或具 有巨噬细胞伪足的圆盘状(图4)。 随后， 对经过诱导的THP-1细胞进行了 Wright-Giemsa染 色， 发现多肽PHD 3-9的左旋和右旋形式诱导组的THP-1细胞与PMA 诱导组相似， 相较于阴 性对照组具有明显的分化特征， 表现出较低的核质比及染色质凝聚程度(图4)。 0047 二、 细胞表面标记检测 0048 1、 实验方法 。

22、0049 除此之外， CD11b与CD14是主要的单核细胞分化标志。 CD14能够作为检测细菌脂多 糖(bacterial lipopolysaccharide， LPS)的共受体， 而CD11b则与细胞黏附现象相关， 同时 CD11b也是整合素家族的一员， 与CD18共同构成CR3异源二聚体， 并直接参与细胞运动现象。 因此， 利用流式细胞分析技术对经过诱导的THP-1表面标记 CD14及CD11b进行检测， 以判断 细胞是否产生明显的分化标记。 0050 2、 实验结果 说明书 4/5 页 6 CN 111848737 A 6 0051 经过检测发现， 经多肽PHD 3-9的左旋和右旋形式。

23、或PMA分别诱导的THP-1细胞 CD11b(图5)及CD14(图5)的表达均有显著上升， 这一现象进一步说明了多肽 PHD 3-6的左 旋和右旋形式确实能够诱导THP-1细胞系发生分化。 0052 实施例4多肽PHD 3-6的体内诱导功能、 细胞毒性及体内免疫原性鉴定 0053 一、 实验方法 0054 为了确定目标多肽体外诱导THP-1细胞系的研究成果是否适用于体内， 构建了 THP-1体内肿瘤模型。 在NOD/SCID小鼠的皮下接种了2105THP-1细胞， 接种肿瘤后12天， 每 3天通过尾静脉注射药品， 50天50mg/kg： 对照组使用非靶标随机序列多肽； 治疗组分别使用 多肽PH。

24、D 3-6的左旋和右旋形式。 0055 二、 实验结果 0056 实验结果证明， 对照组(n15)的中位生存时间约为36天， 多肽治疗组(n20) 的 中位生存时间约为48天， 进行多肽治疗可以显著延长动物的生存时间(P0.0001) (图6A)。 多肽治疗同样对于皮下移植肿瘤体积大小具有显著影响， 在第一次给药 15天后， 多肽处理 组与对照组之间肿瘤的大小具有显著差异(*P0.05)。 这一现象在18天后更加明显(P 0.005)(图6B)。 0057 同时， 多肽治疗组与对照组组间小鼠重量没有显著差异(图6C)。 多肽治疗组小鼠 没有表现出任何毒性迹象， 如激越， 运动障碍或姿势， 消化。

25、不良或腹泻， 红肿或肿胀， 肝肾各 功能在10倍药量时也未受到功能损伤(图6D)。 这说明多肽在抑制肿瘤生长的同时， 不会对 小鼠产生严重的毒副作用， 是一种具有潜力的新型药物。 0058 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制， 对于本领域的普通技术人员来说， 在上述说明及思路的基础上还可以做出 其它不同形式的变化或变动， 这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。 凡在本发明的 精神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明权利要求的保护 范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 111848737 A 7 序列表 中山大学 一种多肽小分子的药物及其在治疗急性髓系白血病中的应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 12 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 1 Gln Asp Val Thr Leu Leu Leu Asn Phe Gly Ala Leu 1 5 10 序列表 1/1 页 8 CN 111848737 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 111848737 A 9 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 10 CN 111848737 A 10 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 111848737 A 11 。