猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位嵌合蛋白及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010669038.3 (22)申请日 2020.07.13 (71)申请人 上海健康医学院 地址 201318 上海市浦东新区周祝公路279 号 (72)发明人 孟继鸿艾丁 (74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 31225 代理人 褚明伟 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C07K 14/09(2006.01) C07K 14/08(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C12N 15/70(2006.01)。

2、 C12N 1/21(2006.01) A61K 39/295(2006.01) A61K 39/135(2006.01) A61K 39/12(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病 毒中和抗原表位嵌合蛋白及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明涉及含有戊型肝炎基因4型病毒和猪 口蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌合蛋白及其制 备方法与应用。 这种嵌合蛋白同时含有口蹄疫O 型病毒中和抗原表位多肽Seq8和戊型肝炎基因4 型病毒的融合蛋白P166、 P216或P222。 该嵌合蛋 白的制。

3、备方法： 通过PCR扩增目的蛋白的DNA序 列， 构建表达嵌合蛋白的重组质粒， 在大肠杆菌 中表达重组质粒获得嵌合蛋白。 电镜下观察嵌合 蛋白证实其具有良好的抗原性和免疫原性。 该嵌 合蛋白可用于联合疫苗的研发， 是戊型肝炎和口 蹄疫联合疫苗的优选蛋白。 与现有技术相比， 本 发明具有能够同时预防猪戊型肝炎和口蹄疫两 种疾病， 加强了对戊型肝炎基因4型病毒的免疫 范围， 减少甚至消除戊型肝炎对人的传播， 具有 更好的经济性和实用性。 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图9页 CN 111848815 A 2020.10.30 CN 111848815 A 1.一种猪戊型肝炎基因4型病毒。

4、和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌合蛋白， 其特征 在于， 该嵌合蛋白为Seq8-P166、 Seq8-P216或Seq8-P222， 其中Seq8为口蹄疫O型病毒优势中 和抗原表位多肽， P166、 P216或P222为戊型肝炎基因4型病毒的融合蛋白， Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216和Seq8-P222的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.8所示。 2.根据权利要求1所述的一种猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表 位的嵌合蛋白， 其特征在于， 表达Seq8、 Seq8-P166、。

5、 Seq8-P216和Seq8-P222蛋白的核苷酸序 列分别如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.7所示。 3.单独口蹄疫O型病毒优势中和抗原表位重组蛋白， 其特征在于， 该蛋白为Seq8， Seq8 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。 4.一种重组质粒， 其特征在于， 包含如权利要求1所述猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口 蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌合蛋白的核苷酸序列， 或包含如权利要求3所述单独口蹄疫 O型病毒优势中和抗原表位重组蛋白的核苷酸序列。 5.根据权利要求4所述重组质粒， 其特征在于， 所述的重组质粒分别为pET28。

6、a/Seq8、 pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216和pET28a/Seq8-P222。 6.一种基因工程菌株， 其特征在于， 它含有如权利要求4或5所述的重组质粒。 7.根据权利要求6所述基因工程菌株， 其特征在于， 该基因工程菌株为大肠杆菌BL21菌 株。 8.一种如权利要求1所述猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位嵌 合蛋白的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)PCR扩增获得Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8-P222的目的基因； 2)构建重组质粒pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8-P1。

7、66、 pET28a/Seq8-P216、 pET28a/Seq8- P222； 3)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中； 4)将重组工程菌利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达重组蛋白并通过亲和层析法纯化 获得目的蛋白。 9.根据权利要求1所述含有猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位 的嵌合蛋白在猪戊型肝炎和猪口蹄疫联合疫苗的应用。 10.如权利要求3所述单独口蹄疫O型病毒优势中和抗原表位重组蛋白在猪戊型肝炎和 猪口蹄疫联合疫苗的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111848815 A 2 猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位嵌 合蛋白及其制备方法与。

8、应用 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学和医学领域的基因工程技术， 尤其是涉及一种猪戊型肝炎 基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位嵌合蛋及其制备方法与应用。 背景技术 0002 戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus， HEV)是一种无包膜、 单股正链的RNA病毒。 该 病毒基因组全长约7.2kb， 包含3个开放读码框(Open Reading Frames， ORFs)， ORF1、 ORF2、 ORF3。 其中ORF2编码一个由660个氨基酸(amino acid， aa)组成的结构蛋白， 该蛋白构成病 毒衣壳， 与细胞受体结合， 刺激机体免疫系统产生中和抗体， 是涉。

9、及HEV感染和免疫的主要 蛋白。 根据HEV全基因序列的差异， HEV毒株主要分为4个基因型(基因1型， 基因2型， 基因3型 和基因4型)， 其中基因1型和基因2型病毒只感染人， 又称为H型(Human)， 基因3型和基因4型 病毒既可感染人又可感染动物， 其中又以感染猪最为常见， 又称为Z型(Zonosis)。 HEV早年 在中国主要以基因1型感染为主， 但近20年研究发现HEV基因1型感染显著下降， 而HEV基因4 型感染显著升高。 HEV基因4型已经成为我国戊型肝炎的流行基因型， 而猪是HEV基因4型的 主要宿主。 对南京市戊型肝炎患者携带的HEV的基因型进行连续10年(2001-20。

10、11)的研究， 发现所有患者的HEV与猪HEV属于同种基因4型病毒。 0003 口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus， FMDV)属微小RNA病毒科口蹄疫病 毒属， 形态呈六角形或球形， 病毒粒子直径为2325nm， 由60个结构单位构成20面体， 由中 央的核糖核酸和周围的蛋白壳体组成， 无囊膜， 完整病毒含有单股正链RNA及衣壳蛋白， 基 因组RNA全长8.5kb。 口蹄疫病毒的衣壳蛋白包括4种结构多肽(VP1VP4)。 VP1、 VP2和VP3组 成衣壳蛋白亚单位， 在衣壳表面； VP4与RNA紧密结合， 是病毒粒子的内部成分。 目前， 已知该 病毒有7个。

11、血清型， 即O型、 A型、 C型、 南非1型、 南非2型、 南非3型和亚洲1型。 我国目前流行的 毒株主要以O型为主， 其次为A型和亚洲1型。 O型口蹄疫病毒在中国和周边国家有3种拓扑 型， 即东南亚型(SEA topotype)， 泛亚型(PanAsia topotype)和CATHAY型(CATHAY topotype)。 2011年东南亚O/Mya/98株的侵袭导致东亚国家大规模的口蹄疫爆发， 其中包括 中国、 日本、 蒙古、 俄罗斯和韩国。 O型口蹄疫病毒的porcinophilic株(Cathay型)仍然存在 中国的一些地区和周边国家存在。 这些数据表明O型口蹄疫病毒的东南亚型、 泛。

12、亚型和 CATHAY型毒株是造成中国动物健康的主要威胁。 这三种拓扑型病毒的重要中和抗原表位互 不相同， 当动物接种单一全病毒灭活疫苗后仅表现出有限的交叉保护性。 0004 口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease， FMD)是由FMDV引发的一种造成偶蹄类动物产 生急性、 热性和高度接触性的传染病。 FMD具有传播迅速、 感染和发病率高的特点， 可引起动 物的规模性死亡， 导致严重经济损失， 被世界动物卫生组织(Office international des pizooties， OIE)列为A类重要传染病。 0005 目前， 预防HEV感染仍旧是防治戊型肝炎(Hepatiti。

13、s E， HE)的最有效方法。 猪对于 HE具有一定的自愈性， 有时没有表现出明显症状， 不会造成养殖户的严重经济损失。 在一些 说明书 1/9 页 3 CN 111848815 A 3 流行型和散发型的戊型肝炎地区， HEV疫苗免疫没有列入国家免疫规划中。 0006 联合疫苗是指含有两种或多种抗原， 用于预防两种或多种疾病的疫苗。 联合疫苗 具有方便、 多效、 低成本的优势， 受到广大学者的关注， 是新一代疫苗研究的热点。 与单一疫 苗相比， 联合疫苗显著降低了预防接种次数， 提高疫苗覆盖率和接种率， 避免因漏种而不能 得到全程免疫。 迄今为止， 同时针对口蹄疫病毒和戊型肝炎病毒的联合疫苗在。

14、国内外尚未 见报道。 发明内容 0007 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种猪戊型肝炎基 因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位嵌合蛋白及其制备方法与应用。 0008 本发明的第一个目的是提供一种方便、 多效、 低成本、 并具有良好抗原性和免疫原 性的猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒优势中和抗原表位的嵌合蛋白。 0009 本发明的第二个目的是提供一种表达猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病 毒优势中和抗原表位的嵌合蛋白重组质粒。 0010 本发明第三个目的是提供一种相应的基因工程菌株。 0011 本发明的第四个目的是提供一种猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型。

15、病毒优 势中和抗原表位的嵌合蛋白的制备方法。 0012 本发明的第五个目的是提供一种可用于预防戊型肝炎和猪口蹄疫两种疾病的联 合疫苗。 0013 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 0014 本发明提供一种猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌 合蛋白， 该嵌合蛋白为Seq8-P166、 Seq8-P216或Seq8-P222， 其中Seq8为口蹄疫O型病毒中和 抗原表位多肽， P166、 P216或P222为戊型肝炎基因4型病毒的融合蛋白。 0015 本发明所述的口蹄疫O型病毒中和抗原表位多肽Seq8的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示， 猪戊型肝炎基因4型病毒和。

16、猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌合蛋白Seq8- P166、 Seq8-P216和Seq8-P2228的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示。 0016 本发明所述的表达口蹄疫O型病毒中和抗原表位多肽Seq8的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 表达猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌合蛋白 Seq8-P166、 Seq8-P216和Seq8-P222的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示。 0017 本发明还提供一种表达猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型。

17、病毒优势中和抗 原表位的嵌合蛋白重组质粒， 将表达猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原 表位的嵌合蛋白Seq8-P166、 Seq8-P216和Seq8-P222的核苷酸序列分别整合在质粒pET28a 上， 得到重组质粒pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216和pET28a/Seq8-P222。 0018 本发明所述的表达口蹄疫O型病毒中和抗原表位多肽Seq8的核苷酸序列整合在质 粒pET28a得到重组质粒pET28a/Seq8， 表达猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中 和抗原表位的嵌合蛋白Seq8-P166、 Seq8-P216和Seq8-P2。

18、22的核苷酸序列分别整合在重组 质粒pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216和pET28a/Seq8-P222上。 说明书 2/9 页 4 CN 111848815 A 4 0019 本发明还提供一种相应的基因工程菌株， 为大肠杆菌BL21菌株， 它包含有上述的 重组质粒。 0020 本发明所述的重组质粒pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216和 pET28a/Seq8-P222分别转化到大肠杆菌BL21中， 筛选验证得到分别含有4个不同重组质粒 的基因工程重组菌株。 0021 本发明还提供一种猪戊型肝炎基因4型。

19、病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位的 嵌合蛋白的制备方法， 包括以下步骤： 0022 1)PCR扩增获得Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8-P222的目的基因； 0023 2)构建重组质粒pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216、 pET28a/ Seq8-P222； 0024 3)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中， 得到基因工程菌株； 0025 4)将重组工程菌利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白并通过亲和 层析法纯化获得目的蛋白。 0026 本发明中所述的口蹄疫O型病毒中和抗原表位。

20、多肽Seq8来源于猪O型口蹄疫病毒 的三个毒株， 即O/Mya/98株(东南亚拓扑型)， O/HN/CHA/09株(Cathay拓扑型)和O/IRN/2010 株(泛亚拓扑型)。 将3个拓扑型毒株的整个G-H环(从每个O型拓扑型选一个G-H环)由两个甘 氨酸(G)残基连接在一起， 即为SEQ ID NO.2序列。 0027 Seq8相对应的核苷酸序列SEQ ID NO.1采用常规生物学技术， 可以通过专业生物 公司合成， 并以此为模板， 设计上游引物和下游引物， 然后经过PCR扩增获得Seq8的目的基 因。 经NcoI和XhoI双酶切后克隆至表达质粒pET28a(+)， 构建重组质粒pET28。

21、a/Seq8； 将重组 质粒转化至大肠杆菌BL21菌株获得重组工程菌； 将重组工程菌利用IPTG诱导表达重组蛋白 并通过亲和层析法纯化获得目的蛋白， 表达产物用SDS-PAGE鉴定， 最终获得单独口蹄疫O型 病毒结构蛋白Seq8。 0028 本发明中所述的戊型肝炎病毒抗原的基因序列来源于戊型肝炎病毒基因4型(中 国株， 序列号AY789228)。 戊型肝炎基因4型病毒的融合蛋白P166、 P216或P222是从5个融合 蛋白p166(452-617aa)， p179(439-617aa)， p216(aa 422-637)， p222(aa 439-660)和p231 (aa 430-660)。

22、中分别进行生物信息学分析和筛选得到的， 融合蛋白P166、 P216或P222为可 以结合FMDV抗原的最佳HEV候选抗原。 0029 本发明设计联合抗原时， 将口蹄疫病毒Seq8连接到戊型肝炎病毒重组蛋白(五个 蛋白)的N端或C端， 组合生成10个联合蛋白。 为了决定最佳免疫原的HEV-FMDV联合抗原， 对 这10个联合蛋白进行生物信息学工具分析来选择最佳的免疫原性组合， 首先要预测这10个 联合蛋白的三维结构， 然后进行分析它们的抗原性和抗原表位显示。 0030 戊型肝炎病毒抗原的基因将通过戊型肝炎病毒基因4型进行PCR扩增， 口蹄疫病毒 抗原经公司体外合成后也进行PCR扩增， PCR扩。

23、增之后， 此HEV和FMDV两种基因片段通过酶切 和连接获得联合基因。 经NcoI和XhoI双酶切后克隆至表达质粒pET28a(+)， 构建重组质粒 pET28a/HEV-FMDV； 将重组质粒转化至大肠杆菌BL21菌株获得重组工程菌； 之后挑取单个克 隆接种于新鲜配置的， 含有40mg/l卡那霉素的LB液体培养基， 当培养液中细菌的OD600 0.8时， 用终浓度为0.5mM的IPTG进行联合蛋白的诱导表达。 诱导3h以后取培养液， 用12的 SDS-PAGE进行分析。 说明书 3/9 页 5 CN 111848815 A 5 0031 本发明对猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒优势中。

24、和抗原表位的嵌合 蛋白进行抗原性和免疫原性分析。 0032 本发明还提供猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒优势中和抗原表位的 嵌合蛋白在制备联合疫苗方面的应用。 0033 本发明还提供可用于预防戊型肝炎和猪口蹄疫两种疾病的联合疫苗， 通过猪戊型 肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒优势中和抗原表位的嵌合蛋白制备得到。 0034 与现有技术相比， 本发明具有以下优点和有益效果： 0035 1)本发明构建戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位的嵌合蛋 白， 能够同时预防猪戊型肝炎和口蹄疫两种疾病， 该二价重组疫苗将会增加收益/成本比。 对猪进行HEV和FMDV联合疫苗的接种具有必要。

25、性和经济性。 0036 2)本发明将戊型肝炎基因4型病毒和属于国家强制免疫范围的猪口蹄疫O型病毒 疫苗进行联合， 可以加强对戊型肝炎基因4型病毒的免疫， 从源头上减少甚至消除戊型肝炎 对人的传播。 0037 3)本发明采用基因工程技术在大肠杆菌表达戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O 型病毒中和抗原表位的嵌合蛋白， 可用于联合疫苗的研发以及使用过程中的免疫效果评 价， 是新一代高效廉价的戊型肝炎和口蹄疫联合疫苗的优选蛋白。 附图说明 0038 图1为表达质粒pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216、 pET28a/ Seq8-P222的构建流程。

26、图。 0039 图2为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳； 图2A为PCR扩增Seq8、 Seq8-P166、 Seq8- P216、 Seq8-P222基因； 图2B为大肠杆菌菌落PCR扩增Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8- P222基因， 对于每种靶基因， 选择两个克隆(C1和C2)， (C-)为阴性对照。 0040 图3为SDS-PAGE分析Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8-P222重组蛋白IPTG诱导前 后表达情况， M表示分子量标记， C(-)为IPTG诱导前的阴性对照， C(+)为诱导P222表达的阳 性对照。 0041 。

27、图4为SDS-PAGE分析Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8-P222重组蛋白纯化后的情 况， M表示分子量标记， CL表示Ni-NTA琼脂糖柱的传过液， E1和E2分别为洗脱液1和洗脱液2。 0042 图5为重组蛋白Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8-P222作为候选疫苗的稳定性检 测情况； 图5a和图5b为2周后嵌合蛋白的SDS-PAGE分析图； 图5c和图5d为6周后嵌合蛋白的 SDS-PAGE分析图； 图5e为10周后嵌合蛋白的SDS-PAGE分析图。 0043 图6为Seq8、 Seq8-P216、 Seq8-P222透射电。

28、镜观察的病毒样颗粒形态结果。 0044 图7为Seq8、 Seq8-P216、 Seq8-P222重组蛋白的抗原性分析； 图7a-7d为嵌合蛋白抗 原表位与口蹄疫猪阳性血清的反应情况； 图7e为嵌合蛋白抗原表位与戊型肝炎单克隆抗体 4C5的反应情况。 0045 图8为Seq8、 Seq8-P216、 Seq8-P222免疫Balb/C小鼠后不同时间点血清中抗体的检 测情况； 图8A为检测口蹄疫抗体IgG的结果； 图8B为检测戊型肝炎抗体IgG的结果。 说明书 4/9 页 6 CN 111848815 A 6 具体实施方式 0046 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。 0047 实施。

29、例1 0048 目的基因的获得： 0049 1)生物信息学分析： 对5种HEV基因4型的融合蛋白分别进行生物信息学分析和筛 选， 选择可以结合FMDV抗原的最佳HEV候选抗原。 5种HEV基因4型的融合蛋白包括p166(452- 617aa)， p179(439-617aa)， p216(aa 422-637)， p222(aa 439-660)和p231(aa 430-660)。 0050 2)目的基因的扩增： 将O型口蹄疫病毒的三个毒株， 即O/Mya/98株(东南亚拓扑 型)， O/HN/CHA/09株(Cathay拓扑型)和O/IRN/2010株(泛亚拓扑型)VP1中整个G-H环(13。

30、2- 160aa)由两个甘氨酸残基连接在一起， 进行串联组合为新的基因序列， 由Applied Biological Materials Inc.公司合成该基因序列， 并以此序列为模板， 设计上游引物和下 游引物， 经过PCR扩增获得Seq8的目的基因； HEV抗原的DNA序列采用HEV基因4型同样采用相 应的引物经PCR扩增获得。 此外， 运用基因工程技术联合编码HEV和FMDV抗原的两个DNA片 段。 利用适当的限制性内切酶SacII将其酶切并用T4连接酶将两个DNA片段连接。 随后运用 DNA凝胶电泳和DNA测序证实编码HEV和FMDV联合抗原DNA序列长度与序列正确性。 PCR条件 为。

31、： 94-30秒， 58-30秒， 72-90秒， 35个循环。 其中各个引物分别含有NcoI和XhoI的酶 切位点。 PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化。 结果见图2A。 不同DNA片段的引物如表1所示： 0051 表1.不同DNA片段的上游引物和下游引物 0052 0053 PCR反应体系如下表2： 0054 表2.PCR反应系统 说明书 5/9 页 7 CN 111848815 A 7 0055 0056 实施例2 0057 重组质粒的构建： 0058 1)联合抗原设计： 将口蹄疫病毒Seq8分别连接到5种HEV重组蛋白的N端或C端， 组 合生成10个联合蛋白。 对10个联合蛋白进行生物信息。

32、学工具分析来选择最佳的免疫原性组 合。 预测这10个联合蛋白的三维结构， 分析它们的抗原性和抗原表位显示。 具体如下： a)设 计10个HEV-FMDV联合抗原。 将口蹄疫病毒抗原(Seq8)附加到不同戊型肝炎病毒抗原N-端或 C-端。 然后用Phyre 2server预测这10个HEV-FMDV联合抗原的三维结构； 用Ramachandran Plot 2.0和PROSA软件证实预测的3D模型质量。 b)为了高度模仿原蛋白的抗原性和免疫原 性， 嵌合蛋白必须有正确的三维结构折叠。 使用Ellipro程序来分析预测的三维结构模型抗 原性以及HEV和FMDV联合蛋白中关键抗原表位的存在， 选择具。

33、有最佳免疫原性HEV-FMDV联 合抗原作为下一步的实验候选。 0059 2)重组质粒的构建： 本实施例中， 采用Qiagen公司的琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒 QIAprepR Spin Miniprep Kit(250)， 按照说明书操作即可。 PCR产物经琼脂糖凝胶回收 纯化， 用NcoI和XhoI双酶切， 酶切反应条件为3730min。 酶切产物再经琼脂糖凝胶回收纯 化。 将酶切纯化的PCR片段和质粒载体pET28a(+)按摩尔比3:1混匀， 在T4 DNA连接酶作用下 4进行连接15h， 最后转化到E.coli BL21(DE3)， pET28a(+)载体含有卡那霉素的抗药基 因， 在卡。

34、那霉素的固体培养基中筛选阳性克隆。 0060 表达质粒pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216、 pET28a/Seq8- P222的构建流程图如图1所示。 0061 DNA片段NcoI和XhoI双酶切反应体系如下表3： 0062 表3.酶切反应体系 0063 说明书 6/9 页 8 CN 111848815 A 8 0064 重组菌DNA目的基因与质粒载体pET28a(+)的连接反应体系如下表4： 0065 表4.连接反应体系 0066 0067 实施例3 0068 基因工程重组菌株的构建： 0069 1)大肠杆菌转化过程如下： 取50 。

35、l感受态细菌， 加入连接产物5 l， 充分混匀后冰 浴30min； 42水浴90s， 立即冰浴2min； 加入500 l 37预热的LB液体培养基， 混匀后37、 100rpm轻摇12h； 取100 l涂布于含抗生素的LB琼脂平板上， 37培养过夜。 设置感受态细 菌对照、 阳性对照(未切开的质粒载体)和阴性对照(切开的质粒载体)。 筛选目的克隆的方 法： 挑取平皿上若干个单克隆， 用各个基因片段的引物进行PCR扩增验证， PCR反应条件为94 预变性2min； 94变性30s， 52退火30s， 72延伸60s， 35个循环， 末次循环结束后72 延伸10min。 根据PCR产物电泳筛选阳性。

36、目的克隆。 结果见图2B。 0070 2)重组蛋白表达情况分析： 将4种重组菌BL21(DE3)-pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8- P166、 pET28a/Seq8-P216和pET28a/Seq8-P222在37培育， 之后加IPTG诱导目的蛋白表达 2h， 将诱导前和诱导后的菌体分别在412000rpm条件离心15min收集菌体， 将菌体重悬于 PBS(pH7.4)缓冲液中， 冻融3次后加入终浓度为0.5mg/ml的溶菌酶， 置冰上30min并不时搅 拌， 待菌液变得十分粘稠后加入1 l Benzonase核酸酶至终浓度25U/ml， 室温孵育直至溶液 不再粘稠， 于4。

37、10000rpm离心20min， 收集上清， 需要说明的是4个重组蛋白均为可溶性蛋 白。 提取全菌体蛋白后进行SDS-PAGE电泳， 诱导前与诱导后的结果显示pET28a/Seq8、 pET28a/Seq8-P166、 pET28a/Seq8-P216、 pET28a/Seq8-P222蛋白均成功表达。 结果见图3。 0071 3)重组蛋白的Ni-NTA金属螯合层析法纯化： 利用不同咪唑浓度的缓冲液纯化 EV71-VP1重组蛋白， 方法如下： 0072 平衡： 取适量Ni-NTA， 用含10mM咪唑的裂解缓冲液室温平衡； 0073 结合： 将细菌裂解上清与Ni-NTA匀浆混合， 置于冰上250。

38、rpm摇动1h； 0074 上样： 将混合物装入层析柱， 调整流速， 收集穿过液； 0075 洗涤： 以10倍柱床体积的预冷的洗涤缓冲液(含20mM咪唑)洗涤3次， 保留洗涤液； 0076 洗脱： 用适量洗脱液(含250mM咪唑)反复洗柱， 收集洗脱液， 直到无蛋白洗出为止。 0077 分析： SDS-PAGE分析各组分(上样前、 穿过液、 洗涤液、 洗脱液)蛋白含量及纯度。 结 果见图4。 0078 4)重组蛋白Seq8、 Seq8-P166、 Seq8-P216、 Seq8-P222稳定性检测： 将4种重组蛋白 说明书 7/9 页 9 CN 111848815 A 9 分别放在37、 4、。

39、 -20和-80条件下， 分别于2周后、 6周后和10周后检测蛋白降解情 况， 用SDS-PAGE电泳分析。 结果见图5。 0079 5)重组蛋白病毒样颗粒的形态学检测： 对4种蛋白病毒样颗粒进行透射电镜观察。 仪器为透射式电子显微镜(H-7650,HITACHI,Japan)。 重组蛋白病毒颗粒浓度调整为0.1mg/ ml， 然后吸附于300目的铜网上， 用2的醋酸双氧铀染色10min， 置于透射电镜下观察。 结果 如图6， 可见Seq8-P216和Seq8-P222样品的直径约为40nm左右的病毒样颗粒， 大小均匀， 数 目较多。 而Seq8在体外病毒颗粒较少， 基本为多聚体形态。 008。

40、0 6)两个联合疫苗重组蛋白Seq8-P216和Seq8-P222抗原反应性检测： 用间接ELISA 法检测上述重组蛋白的抗原性特征。 首先用包含中和抗原表位的口蹄疫O型重组蛋白Seq8 和戊肝重组蛋白p166作为包板抗原， 用免疫过JSM和Asia I FMDV毒株以及Mya98和Cathy FMDV毒株的猪血清作为口蹄疫抗原的一抗， 猪的空白血清作为阴性对照， HEV单克隆抗体作 为戊型肝炎的一抗， 用于检测口蹄疫和戊型肝炎联合疫苗Seq8-P216和Seq8-P222的FMDV和 HEV的抗原反应性。 结果见图7a-图7e。 0081 7)重组蛋白Seq8、 Seq8-P216、 Seq。

41、8-P222病毒样颗粒免疫动物的免疫保护性评价： 0082 选用6-8周雌性Balb/C小鼠， 分为6组， 每组6只。 0083 A组： 空白组， 注射为ISA-206油佐剂。 0084 B组： 戊型肝炎组， 注射p222 10ug。 0085 C组： FMD灭活疫苗组， 注射FMD灭活疫苗100ul。 0086 D组： 重组蛋白组， 注射重组蛋白Seq8 50ug。 0087 E组： 重组蛋白组， 注射重组蛋白Seq8-P216 50ug。 0088 F组： 重组蛋白组， 注射重组蛋白Seq8-P222 50ug。 0089 所有的重组蛋白均用ISA-206油佐剂按照质量比1:1进行充分乳化。

42、， 直至成为水/ 油/水乳状物， 对小鼠后腿内侧肌肉注射。 此后分别间隔2周进行加强免疫， 免疫剂量同第一 次， 自免疫后每隔2周各组小鼠进行采血， 连续采集12周， 分离血清， -80保存待测HEV抗体 IgG和FMDV抗体IgG。 0090 间接ELISA分析HEV抗体IgG和FMDV抗体IgG产生情况， 结果见图8A和8B。 0091 试剂配制： 0092 (1)PBS缓冲液(0.01M， pH7.4)： NaCl 8.0g， KCl 0.2g， Na2HPO412H2O 2.9g， KH2PO4 0.2g， 加去离子水定容至1000ml， 调节至pH 7.4， 室温保存。 0093 (。

43、2)包被稀释液(1M尿素PBS)： 尿素60.06g加PBS缓冲液定容至1000ml， 调至pH 9.6， 4保存。 0094 (3)血清标本、 酶标二抗稀释液： 1casein PBS(1g casein溶解于100ml PBS缓冲 液中， 4保存)； 10乙二醇(尿素30g， NaCl 23.4g， casein 1.25g， 乙二醇50ml， 定容至 500mL， 4保存)。 0095 (4)ELISA洗涤液(PBST)： 1000mL PBS缓冲液加0.5mLTween-20， 室温保存。 0096 (5)底物液A(TMB-过氧化氢尿素溶液)： 取Na2HPO4.12H2O 9.205。

44、g、 柠檬酸2.55g、 过氧化氢尿素0.3g， 加去离子水至500ml， 充分溶解后4避光保存； 0097 (6)底物液B： 取TMB 0.1g溶于5ml无水乙醇中； 取EDTA-Na2 0.073g、 柠檬酸0.525g 溶于400ml去离子水中， 加热至90充分溶解， 待冷后逐滴加入TMB乙醇溶液， 定容至500ml， 说明书 8/9 页 10 CN 111848815 A 10 4避光保存； 0098 (7)终止液(2mol/L H2SO4溶液)： 浓硫酸100mL缓慢滴加到600mL去离子水中并不 断搅拌， 加去离子水定容至900mL， 室温保存。 0099 操作步骤： 0100 (。

45、1)包被： 将重组蛋白不同片段以1M尿素PBS缓冲液稀释后， 包被聚苯乙烯塑料微 孔板， 100 l每孔， 37孵育2h后PBST洗涤2次， 拍干； 0101 (2)加样： 将待检血清标本及阴性、 阳性对照血清用1:100稀释后加入酶标孔， 每孔 100 l； 0102 (3)孵育： 置于37孵育50min； 0103 (4)洗板： PBST洗涤5次， 拍干； 0104 (5)加酶标二抗： 用1： 10000稀释HRP-羊抗鼠IgG， 每孔加100 l； 0105 (6)孵育： 置于37孵育45min； 0106 (7)洗板： PBST洗涤5次， 拍干； 0107 (8)显色： 加入TMB底物。

46、， 底物A和底物B各50 l， 37避光放置10min。 0108 (9)终止： 每孔加入2M H2SO4 50 l终止反应 0109 (10)显色： 酶标仪以空白对照孔调零， 双波长450nm/630nm测定各孔OD值。 0110 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改， 并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。 因此， 本发明不限于上述实施例， 本领 域技术人员根据本发明的揭示， 不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。 说明书 9/9 页 11 。

47、CN 111848815 A 11 序列表 上海健康医学院 猪戊型肝炎基因4型病毒和猪口蹄疫O型病毒中和抗原表位嵌合蛋白及其制备 方法与应用 8 SIPOSequenceListing 1.0 1 273 DNA O/Mya/98 O/HN/CHA/09 O/IRN/2010 1 gggagcagca agtacggtga caccagcact aacaacgtga gaggcgacct tcaagtgttg 60 gctaagaagg cagaaagagc tctgcctggg gggggggact gcaagtacgg cgagagccgc 120 acaaccaacg tgagaggtg。

48、a cctgcaagtg ttggcccaaa aggcggcgag gacgctgccc 180 ggggggggga actgcaaata cgccgggggc tcactgacca acgtgagagg cgatctccaa 240 gtgctggctc agaaggcggc gaggccgctg cct 273 2 91 PRT O/Mya/98 O/HN/CHA/09 O/IRN/2010 2 Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val Arg Gly Asp 1 5 10 15 Leu Gln Val Leu Ala Ly。

49、s Lys Ala Glu Arg Ala Leu Pro Gly Gly Gly 20 25 30 Asp Cys Lys Tyr Gly Glu Ser Arg Thr Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu 35 40 45 Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Thr Thr Leu Pro Gly Gly Gly Asn 50 55 60 Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln 65 70 75 80 Val Leu Asp Gln Lys Ala Ala。

50、 Arg Pro Leu Pro 85 90 3 777 DNA O/Mya/98 O/HN/CHA/09 O/IRN/2010 AY789228 3 序列表 1/6 页 12 CN 111848815 A 12 gggagcagca agtacggtga caccagcact aacaacgtga gaggcgacct tcaagtgttg 60 gctaagaagg cagaaagagc tctgcctggg gggggggact gcaagtacgg cgagagccgc 120 acaaccaacg tgagaggtga cctgcaagtg ttggcccaaa aggcggcgag。