传染性脾肾坏死病毒、大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光PCR检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010351189.4 (22)申请日 2020.04.28 (71)申请人 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 地址 511400 广东省广州市番禺区沙头街 小平工业区福平路八街5号 (72)发明人 张钰薇伍建敏李中圣曹梦蕊 罗律王凤求 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 景鹏何爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名。

2、称 传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜 弹状病毒的三重荧光PCR检测试剂盒 (57)摘要 本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及传 染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病 毒的三重荧光PCR检测试剂盒。 本发明的试剂盒 包括病毒特异性扩增引物和探针、 阳性标准品、 阴性标准品、 Taq酶、 反转录酶、 RNA酶抑制剂、 反 应缓冲液、 dNTP、 无核酸酶水和冻干保护剂。 本发 明试剂盒利用三重荧光PCR可以多个通道同时检 测， 使用不同荧光标记的探针， 做到可以一个反 应体系同时检测三种病毒， 降低了检测难度， 缩 短了检测时间， 可以帮助养户准确及时的拿到检 测结果。 本发明试。

3、剂盒检测灵敏度高、 稳定性高， 特异性强， 与其他水产病毒没有交叉反应， 可以 用于疫病的早期监测和防控。 权利要求书1页 说明书12页 序列表2页 附图4页 CN 111733283 A 2020.10.02 CN 111733283 A 1.一种引物组， 包括： 检测传染性脾肾坏死病毒的第一引物， 所述第一引物包括核苷酸 序列如SEQ ID NO:12所示的引物对； 检测鳜弹状病毒的第二引物， 所述第二引物包括核 苷酸序列如SEQ ID NO:45所示的引物对； 检测大口黑鲈鱼病毒的第三引物， 所述第三引 物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:78所示的引物对。 2.一种探针， 包括： 检。

4、测传染性脾肾坏死病毒的第一探针， 所述第一探针包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； 检测鳜弹状病毒的第二探针， 所述第二探针包括如SEQ ID NO:6所 示的核苷酸序列； 检测大口黑鲈鱼病毒的第三探针， 所述第三探针包括如SEQ ID NO:9所示 的核苷酸序列。 3.根据权利要求2所述的探针， 其特征在于， 所述探针为自身猝灭探针， 其5 端标记有 荧光发射基团， 3 端标记有荧光猝灭基团。 4.根据权利要求3所述的探针， 其特征在于， 所述荧光发射基团选自FAM、 HEX、 ROX、 CY5、 VIC和JOE； 所述荧光猝灭基团选自BQ1、 BQ2、 TAMRA和MGB。 5.。

5、一种组合物， 包括如权利要求1所述的引物组和如权利要求2至4任一项所述的探针。 6.一种试剂盒， 包含如权利要求1所述的引物组和/或如权利要求2至4任一项所述的探 针。 7.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包含阳性标准品、 阴性标 准品、 Taq酶、 反转录酶、 RNA酶抑制剂、 反应缓冲液、 dNTP、 无核酸酶水和冻干保护剂。 8.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述Taq酶浓度为： 1-10U/反应体系； 所 述反转录酶浓度为： 5-20U/反应体系； 所述RNA酶抑制剂浓度为： 20-80U/反应体系； 所述 dNTP浓度为： 0.5-5mM； 所述。

6、引物和所述探针浓度为： 0.2-1 M； 所述冻干保护剂的浓度为 5-10m/v； 其中， 所述反应体系的体积为25 L。 9.根据权利要求6至8任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， 除阴性标准品 外， 其它组分均为冻干形式。 10.根据权利要求6至8任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒为三重荧光PCR 反应试剂盒； 所述三重荧光PCR反应的反应程序为： 反转录： 50， 15min； 预变性： 95， 30s； 扩增循环： 95， 10s； 60， 30s； 45个循环， 在60退火步骤时读取荧光。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111733283 A 2 传染性。

7、脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重 荧光PCR检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒 和鳜弹状病毒的三重荧光PCR检测试剂盒。 背景技术 0002 传染性脾肾坏死病又称鳜爆发性传染病。 1994年， 广东鳜鱼养殖区爆发了高死亡 率的传染性疾病； 从患病鳜鱼中提取出了主要病原并将其命名为传染性脾肾坏死病毒 (Infectious spleen and kidney necrosis virus， ISKNV)， 主要感染脾肾， 表现为发病器 官肿大， 感染后鳜鱼在712d内死亡率达100； 除此之外还可感染50多种。

8、海、 淡水养殖鱼 类。 ISKNV属虹彩病毒、 细胞肿大病毒属； 病原基因为双链DNA， 约111362kb， 含有124个潜在 的开放阅读框(ORF)， 其中主衣壳蛋白(MCP)基因高度保守。 0003 大口黑鲈病毒(Largemouth bass ranavirus， LMBV)最早于1991年分离自美国的 野生大口黑鲈， 1996年被正式命名为大口黑鲈病毒， 属虹彩病毒科， 蛙病毒属。 LMBV不仅仅 感染大口黑鲈， 对太阳鱼、 鳜鱼也有一定的致病力； 在两栖类、 禽类， 甚至鱼饵中均能存活， 且存在多种传播途径， 鱼鳔、 鳃、 和后肾是易受感染的器官。 LMBV目前研究较多的是MCP蛋。

9、白 基因。 0004 鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus， SCRV)是造成鳜鱼病毒性病害的 一种主要病原， 最早于1999年在广东收集的病鳜中发现； 寄主广泛， 乌鳢、 加州鲈、 黄鳝等淡 水鱼均能分离出该病原。 SCRV属弹状病毒科， 是一种单股负链RNA病毒。 弹状病毒的基因组 在1115kb之间， 都编码5个共同的结构蛋白， 其中核衣壳蛋白基因较为保守。 受弹状病毒 感染的鱼类有共同的临床症状， 如造血器官坏死， 导致从体表到内部器官出血。 0005 传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、 大口黑鲈病毒(LMBV)、 鳜弹状病毒 (SCRV)是三种 常见。

10、且易发的淡水养殖鱼传染性病原， 每种疾病都能导致大规模爆发与流行， 造成严重经 济损失。 0006 由于现在淡水鱼普遍采用规模化养殖的方式， 且目前还没有针对三种病毒的疫苗 或治疗方法， 如果不能在苗种阶段发现病毒感染， 或是在养殖过程中及早发现， 并采取相应 的防治措施， 将会对养殖渔场造成巨大的经济损失； 三种病毒在发病期都有比较相似的出 血症状， 从外观上很难判断是什么病毒感染； 而在病毒感染早期， 没有明显临床症状时， 用 传统的观察法或普通PCR法是很难提前鉴别出病原的。 发明内容 0007 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一， 为此， 本发明提供了一种 三重荧光PCR法。

11、实时、 准确、 快速， 同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状 病毒的试剂盒。 0008 因此， 本发明的第一个目的在于提供一种同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑 说明书 1/12 页 3 CN 111733283 A 3 鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的的引物。 0009 本发明的第二个目的在于提供一种同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病 毒和鳜弹状病毒的探针。 0010 本发明的第三个目的在于提供一种同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病 毒和鳜弹状病毒的试剂盒。 0011 本发明的第四个目的在于提供一种三重荧光PCR法快速检测传染性脾肾坏死病 毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状。

12、病毒的方法。 0012 本发明所采用的技术方案如下文所述。 0013 本发明的一方面涉及一种引物组， 包括： 0014 检测传染性脾肾坏死病毒的第一引物， 所述第一引物包括核苷酸序列如 SEQ ID NO:12所示的引物对； 0015 检测鳜弹状病毒的第二引物， 所述第二引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO: 45 所示的引物对； 0016 检测大口黑鲈鱼病毒的第三引物， 所述第三引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7 8所示的引物对。 0017 本发明可以同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒三种病 毒， 针对每个病毒， 设计一对扩增片段较短的引物， 用于实际检测， 。

13、灵敏度高、 特异性好。 0018 根据本发明的一些实施方式， 如上所述引物可以由本领域常规技术手段合成。 0019 本发明的另一方面涉及一种探针， 包括： 0020 检测传染性脾肾坏死病毒的第一探针， 所述第一探针包括如SEQ ID NO:3 所示的 核苷酸序列； 0021 检测鳜弹状病毒的第二探针， 所述第二探针包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序 列； 0022 检测大口黑鲈鱼病毒的第三探针， 所述第三探针包括如SEQ ID NO:9所示的核苷 酸序列。 0023 本发明的探针能够用于检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病 毒。 0024 根据本发明的一些实施方式， 所述。

14、探针带有可检测的标记。 0025 根据本发明的一些实施方式， 所述探针为自身猝灭探针。 0026 根据本发明的一些实施方式， 所述探针的5 端标记有荧光发射基团， 3 端标记有 荧光猝灭基团。 0027 根据本发明的一些实施方式， 所述荧光发射基团选自FAM、 HEX、 ROX、 CY5、 VIC和 JOE； 所述荧光猝灭基团选自BQ1、 BQ2、 TAMRA和MGB。 优选地， 所述荧光发射基团选自FAM、 HEX 和ROX； 所述荧光猝灭基团选自BQ1 和BQ2。 0028 根据本发明的一些实施方式， 如上所述探针可以由本领域常规技术手段合成。 0029 本发明的另一方面还涉及一种组合物，。

15、 其含有如上所述的引物组和/或如上所述 的探针。 0030 本发明的组合物可用于同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状 病毒， 灵敏度高、 特异性好。 说明书 2/12 页 4 CN 111733283 A 4 0031 本发明的另一方面还提供一种试剂盒， 包含如上所述的引物对和/或如上所述的 探针。 0032 根据本发明的一些实施方式， 所述试剂盒还包含阳性标准品、 阴性标准品、 反应液 和冻干保护剂。 0033 根据本发明的一些实施方式， 所述反应液包括Taq酶、 反转录酶、 RNA酶抑制剂、 反 应缓冲液、 dNTP和无核酸酶水。 0034 根据本发明的一些实施方式， 所述。

16、Taq酶浓度为： 1-10U/反应体系； 0035 反转录酶浓度为： 5-20U/反应体系； 0036 RNA酶抑制剂浓度为： 20-80U/反应体系； 0037 dNTP浓度为： 0.5-5mM； 0038 所述引物和所述探针浓度为： 0.2-1 M； 0039 冻干保护剂的浓度为5-10m/v； 0040 其中， 反应体系体积为25 L。 0041 根据本发明的一些实施方式， 所述Taq酶终浓度为0.16U/ L， 反转录酶终浓度为 0.4U/ L， RNA酶抑制剂终浓度为2.4U/ L， 反应缓冲液浓度为购买的商品化反转录酶缓冲液 推荐使用的浓度， dNTP终浓度为0.4mM， 所述引物。

17、浓度为0.2 M和所述探针浓度为0.1 M。 0042 根据本发明的一些实施方式， 所述阳性标准品为含有待测毒株基因组的质粒。 0043 根据本发明的一些实施方式， 所述阴性标准品为无核酸酶水。 0044 根据本发明的一些实施方式， 所述试剂盒中各组分按最佳比例配制为冻干形式。 0045 根据本发明的一些实施方式， 所述试剂盒中阳性标准品和反应液在-40预冻3小 时， -40真空冻干8小时， -20真空冻干3小时， 0真空2小时， 25真空2小时进行冻干处 理。 0046 根据本发明的一些实施方式， 所述冻干处理时使用的冻干保护剂选自海藻糖、 蜜 三糖、 甘露醇、 甘氨酸中的至少一种。 004。

18、7 本发明对qPCR反应体系中的Taq酶、 反转录酶、 RNA酶抑制剂、 dNTP、 三种病毒对应 的引物和探针、 无核酸酶水以及冻干保护剂均进行了优化， 以扩增效率和扩增灵敏度得到 了最佳的反应体系及反应条件。 0048 在本发明的另一方面， 本发明提供用于三重荧光PCR快速检测传染性脾肾坏死病 毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的方法， 包括： 样品制备、 配制反应体系、 样品检测、 数据 分析和结果判定。 0049 根据本发明的一些实施方式， 所述样品制备包括： 参照病毒DNA/RNA小量提取试剂 盒说明书提取鳜鱼、 鲈鱼发病组织中的总核酸作为扩增模板， 保存于-20备用。 0050 根据。

19、本发明的一些实施方式， 所述配制反应体系包括： 将所述扩增模板和反应液 冻干品配制成反应体系。 0051 根据本发明的一些实施方式， 所述样品检测包括： 将配制成的反应体系进行三重 荧光PCR扩增。 0052 根据本发明的一些实施方式， 所述数据分析和结果判定包括： 0053 阳性标准品在FAM、 HEX、 ROX三个通道均有典型的扩增曲线， 且Ct值小于30； 阴性标 准品在三个通道均没有扩增曲线且无Ct值。 说明书 3/12 页 5 CN 111733283 A 5 0054 在以上阴阳性对照成立的条件下， 若样品在FAM通道有典型的扩增曲线， 且Ct 35， 则判定样品为ISKNV核酸阳。

20、性； 若样品在HEX通道有典型的扩增曲线， 且Ct35， 则判定 样品为SCRV核酸阳性； 若样品在ROX通道有典型的扩增曲线， 且Ct35， 则判定样品为LMBV 核酸阳性； 若相应通道35Ct40 则判定为可疑， 需要重新检测， 若重新检测以后仍是可 疑， 则判定为相应通道的病毒核酸阳性； 若对应通道没有孔增曲线或Ct值40则判定为该 通道核酸阴性。 0055 实时荧光定量PCR与传统的PCR方法相比， 具有更高的灵敏度、 特异性和可量化的 特性， 能精准检出微量病原。 本发明针对这三种易发的淡水养殖鱼病毒， 在其基因的保守区 域分别设计了特异性探针和引物， 建立了一种三重实时荧光PCR检。

21、测方法， 能在一次荧光定 量PCR操作中同时检测三种病毒， 大大提高了检测效率， 具有良好的特异性、 灵敏度和重复 性， 同时还使用了冻干工艺， 增加了试剂的稳定性， 降低了试剂的储存、 运输要求， 不仅能用 于实验室检测， 搭配便携式荧光PCR设备也能用于现场检测， 具有良好的应用前景。 0056 本发明另一方面还提供一种上述试剂盒进行三重荧光PCR扩增的方法， 该方法包 括： 反转录、 预变形、 扩增循环和荧光信号采集。 0057 根据本发明的一些实施方式， 其中， 反转录： 50， 15min； 预变性： 95， 30s； 扩增 循环： 95， 10s； 60， 30s； 45个循环， 。

22、在60退火步骤时读取荧光。 0058 本发明的另一方面还涉及如上所述的引物组、 如上所述的探针、 如上所述的组合 物或如上所述的试剂盒在制备检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的 试剂中的应用。 0059 与检测单一病毒相比， 本发明采用三重荧光PCR法同时检测传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒三种病毒， 存在很大难度。 一个PCR反应体系中引物越多， 越 有可能发生引物之间相互作用从而影响扩增效率， 降低检测灵敏度， 本发明在设计时需要 考虑多种因素， 比如在LMBV的基因保守区设计特异性引物和探针， 不能与其他病毒有交叉； 三对引物和探针在设计时需要有相似的T。

23、m值， 且相互之间不能形成熵值过高的二级结构。 0060 本发明的有益效果： 0061 本发明同时检测三种目前国内十分常见的对淡水鱼养殖有严重危害的病毒的三 重荧光PCR试剂盒， 经过大量真实样品验证可靠， 该方法具有较高的灵敏度， 可以检出病毒 核酸含量低至10copies/ L的样品， 且与其他水产病毒没有交叉反应， 特异性较高， 可以用 于疫病的早期监测和防控。 0062 本发明试剂盒利用荧光PCR仪可以多个通道同时检测的优点， 使用不同荧光标记 的探针， 做到可以一个反应体系同时检测三种病毒， 降低了检测难度， 缩短了检测时间， 可 以帮助养户准确及时的拿到检测结果。 0063 本发明。

24、试剂盒主要组分均采用了冻干的形式， 可以实现常温保存和运输， 降低了 储存和运输成本， 不仅能用于实验室检测， 而且配合便携式荧光PCR仪可以用于现场快速采 样检测。 0064 本发明试剂盒反应液使用了8连PCR管分装的形式， 适用于大部分荧光 PCR仪， 使 用时直接加入无核酸酶水和样品核酸即可上机反应， 不需要额外分装和换管， 不仅简化了 体系配制流程和操作难度， 降低了使用门槛， 同时避免了反复冻融对试剂的影响， 而且大大 降低了交叉污染的风险。 说明书 4/12 页 6 CN 111733283 A 6 附图说明 0065 图1为冻干反应液成品图； 0066 图2为三重荧光PCR的标准。

25、曲线和扩增曲线； 0067 图3为本发明试剂盒灵敏度测试结果图； 0068 图4为本发明试剂盒特异性度测试结果图； 0069 图5为ISKNV普通PCR检测结果； 0070 图6为LMBV普通PCR检测结果； 0071 图7为SCRV普通PCR检测结果。 具体实施方式 0072 以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明， 但本发明并不 限于这些具体实施方式。 实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得 到。 0073 实施例1引物和探针设计 0074 本发明人根据Genebank中登录的传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)MCP蛋白序列 DQ399789， 鳜。

26、弹状病毒(SCRV)核衣壳蛋白序列DQ399789， 大口黑鲈鱼病毒(LMBV)MCP蛋白序 列JQ178325设计了3条特异性探针和3对引物(表1)， 包括： ISKNV-rtF(SEQ ID NO:1)， ISKNV-rtR(SEQ ID NO:2)， ISKNV-rtProbe(SEQ ID NO:3)， SCRV-rtF(SEQ ID NO:4)， SCRV- rtR(SEQ ID NO:5)， SCRV-rtProbe(SEQ ID NO:6)， LMBV-rtF(SEQ ID NO:7)， LMBV-rtR (SEQ ID NO:8)和LMBV-rtProbe(SEQ ID NO:。

27、9)； 探针经Blast 验证， 有较高的特异性。 交由 Invitrogen公司合成。 0075 表1 三重荧光PCR探针及扩增引物 0076 0077 实施例2核酸样品与标准品的制备 0078 参照病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书提取鳜鱼、 鲈鱼发病组织中的总核酸作 为扩增模板， 保存于-20备用。 分别以ISKNV、 LMBV和SCRV全病毒基因组核酸为模板， 以 ISKNV-F/R(SEQ ID NO:1011)、 SCRV-F/R(SEQ ID NO:1213)、 LMBV-F/R(SEQ ID NO:14 说明书 5/12 页 7 CN 111733283 A 7 15)(使。

28、用浓度为： 10 M)为引物分别进行PCR或RT-PCR扩增， DNA病毒扩增条件为： 94 3min； 94 30s、 5530s、 7245s， 共35个循环； 7210min； RNA病毒扩增条件为 50， 15min， 943min； 9430s、 5530s、 7245s， 共35个循环； 72 10min。 反应产物用2琼 脂糖凝胶电泳检测分离。 将条带大小正确的PCR产物经切胶纯化后， 分别克隆至pMD-18T (TaKaRa)载体中， 构建重组质粒 pMD-ISKNV、 pMD-LMBV和pMD-SCRV， 将阳性重组质粒进行测 序分析， 测序正确的重组质粒经测定在260nm处。

29、的吸光值后， 计算重组质粒的初始拷贝数， - 20保存， 做为测试用阳性标准品。 0079 将测试用的三种阳性标准品用无核酸酶水分别稀释至105copies/ L， 等比例混 合， 然后加入冻干保护剂， 按20 L/管， 分装到200 L PCR管中， 冻干后作为试剂盒的阳性标 准品。 0080 按1ml/管， 分装无核算酶水到2ml无核酸酶螺口试剂管中， 作为试剂盒的冻干稀释 液和阴性标准品。 0081 实施例3三重荧光PCR冻干体系的建立和反应条件优化 0082 将实施例2制备得到的阳性标准品分别用无核酸酶水稀释至104、 103、 102、 101、 100copies/ L， 然后将相。

30、同浓度的阳性标准品稀释液等比例混合， 再以此混合液做为灵敏 度优化模板； 以提取的鳜弹状病毒(SCRV)阳性病料总核酸作为反转录酶和RNA酶抑制剂优 化模板。 0083 配制三重荧光PCR冻干体系， 其中包括反应所需的Taq酶、 反转录酶、 RNA酶抑制 剂、 反应缓冲液、 dNTP、 三种病毒对应的引物和探针(如表1所示)、 无核酸酶水以及冻干保护 剂。 其中冻干保护剂选自海藻糖、 蜜三糖、 甘露醇、 甘氨酸中的至少一种。 0084 优化用仪器为ABI Q3荧光定量PCR仪， 优化反应体系为25 L。 0085 反应体系优化组分浓度范围为： 0086 Taq酶浓度为0.16U/ L， 优化浓。

31、度范围为： 1U-10U/反应体系； 0087 反转录酶浓度为0.4U/ L， 优化浓度范围为： 5U-20U/反应体系； 0088 RNA酶抑制剂浓度为： 2.4U/ L， 优化浓度范围为： 20-80U/反应体系； 0089 反应缓冲液浓度为购买的商品化反转录酶缓冲液的推荐使用浓度； 0090 dNTP浓度为0.4mM， 优化浓度范围为： 0.5-5mM； 0091 引物和探针浓度为0.2 M， 优化浓度范围为： 0.2-1 M。 0092 冻干保护剂为海藻糖、 蜜三糖、 甘露醇、 甘氨酸中的一种或多种混合物的水溶液， 优化浓度范围m/v为5-10； 0093 退火温度优化范围： 5565。

32、， 延伸时间优化范围： 20s-1min； 0094 根据灵敏度优化模板和SCRV病毒阳性病料总核酸的扩增效率和扩增灵敏度筛选 最佳的反应体系及反应条件。 0095 实施例4冻干条件优化及冻干成品稳定性测试 0096 根据反应体系优化的结果， 按最佳反应体系配制反应液， 然后按20 L/管， 分装到 200 L 8连PCR管中， 上机进行冻干。 0097 根据冻干成品形态， 和成品稳定性确定了最佳冻干条件为： -40预冻3小时， -40 真空冻干8小时， -20真空冻干3小时， 0真空2小时， 25真空 2小时。 该条件下冻干成 品如图1所示， 可以看出， 最优冻干条件下， 不同批次的冻干产品。

33、其形态均为白色干粉， 且均 说明书 6/12 页 8 CN 111733283 A 8 匀地填充于管底部， 平面整齐。 0098 将最佳冻干条件下得到的冻干成品分别避光保存在-20、 4和室温 (20-25 )， 1-6个月， 每个月取出部分冻干试剂， 使用相同浓度的阳性标准品和阳性核酸进行荧光 PCR检测， 测试冻干试剂的稳定性。 其中， 变异系数 CV(标准偏差/平均值)100， 结果 如表2所示。 0099 表2 冻干成品稳定性测试结果 0100 0101 实施例5试剂盒的组装及使用方法 0102 试剂盒(25 L/反应体系， 48T)的组成包括冻干反应液(规格： 20 L/管； 数量：。

34、 8管 6排)、 冻干阳性质控品(规格： 20 L/管； 数量： 8管)和阴性标准品(规格： 1mL/管； 数量： 2管)， 在常温或4储存。 0103 冻干反应液包括： 引物和探针、 Taq酶、 反转录酶、 RNA酶抑制剂、 反应缓冲液、 dNTP、 无核酸酶水、 和冻干保护剂； 各组分的用量如表3所示， 并按照实施例4中最佳冻干条件进行 冻干。 0104 阴性标准品为无核酸酶水， 按1ml/管， 分装无核酸酶水到2ml无核酸酶螺口试剂管 中， 作为试剂盒的阴性标准品。 0105 阳性标准品的制备方法如实施例2所示， 将阳性对照品与冻干保护剂混合后进行 冻干处理(冻干保护剂用量和冻干条件参见。

35、实施例3和实施例4)。 0106 表3列出了试剂盒进行三重荧光PCR时的反应体系。 0107 表3 PCR反应体系各组分及用量 0108 说明书 7/12 页 9 CN 111733283 A 9 0109 0110 用法 0111 样品制备 0112 参照病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书提取鳜鱼、 鲈鱼发病组织中的总核酸作 为扩增模板， 保存于-20备用。 0113 配制反应体系： 0114 根据检测样品数量加上阴阳性对照数量， 在相应数量的冻干反应液管中加入20 L 阴性标准品中的无核酸酶水， 再分别加入5 L使用柱式或磁珠法提取好的样品核酸及阴阳 性标准品(阳性标准品使用前需加入2。

36、0 L阴性标准品中的无核酸酶水)。 0115 样品检测： 0116 将将配制成的反应体系进行三重荧光PCR扩增。 0117 扩增反应程序为： 反转录： 50， 15min； 预变性： 95， 30s； 扩增循环： 95， 10s； 60， 30s； 45个循环， 在60退火步骤时读取荧光。 0118 数据分析和结果判定。 0119 阳性标准品在FAM、 HEX、 ROX三个通道均有典型的扩增曲线， 且Ct值小于30； 阴性标 准品在三个通道均没有扩增曲线且无Ct值。 0120 在以上阴阳性对照成立的条件下， 若样品在FAM通道有典型的扩增曲线， 且Ct 35， 则判定样品为ISKNV核酸阳性；。

37、 若样品在HEX通道有典型的扩增曲线， 且Ct35， 则判定 样品为SCRV核酸阳性； 若样品在ROX通道有典型的扩增曲线， 且Ct35， 则判定样品为LMBV 核酸阳性； 若相应通道35Ct40 则判定为可疑， 需要重新检测， 若重新检测以后仍是可 疑， 则判定为相应通道的病毒核酸阳性； 若对应通道没有孔增曲线或Ct值40则判定为该 通道核酸阴性。 0121 实施例6三重荧光PCR标准曲线及试剂盒灵敏度、 重复性和特异性测试 0122 将阳性标准品分别用无核酸酶水稀释至108、 107、 106、 105、 104、 103、 102、 101、 100copies/ L， 以此为模板使用优。

38、化后的三重实时荧光定量PCR反应体系分别进行扩增， 构 建标准曲线， 并计算扩增效率。 0123 将阳性标准品分别稀释至103、 102、 101、 100copies/ L， 然后使用优化后的三重荧 光PCR反应体系进行扩增， 测试其灵敏度。 说明书 8/12 页 10 CN 111733283 A 10 0124 将104102copies/ L的阳性标准品按照优化后的实时荧光定量PCR反应体系分别 进行扩增， 每个浓度梯度重复3次， 以验证该方法的稳定性和重复性。 0125 采用优化后的反应条件， 以104copies/ L的样品标准品做为阳性标准品， 以ddH2O 做为阴性标准品， 以。

39、虾虹彩病毒(SHIV)、 病毒性神经坏死病病毒 (VNN)、 罗非鱼湖病毒 (TiLV)、 鲤浮肿病病毒(CEV)阳性标准品核酸(购自广东海大畜牧兽医研究院有限公司保 存)做为特异性模板进行三重实时荧光 PCR扩增， 验证其特异性。 0126 如图2所示， 为三重荧光PCR的标准曲线图， 以10倍梯度稀释阳性标准质粒， 然后选 取108100copies/ L几个稀释度使用冻干试剂进行荧光PCR扩增。 以重组质粒稀释后的拷 贝数为X轴、 相应的Ct值为Y轴作图， 得到三条标准曲线， 分别是ISKNV的标准曲线图扩增曲 线图； LMBV的标准曲线图扩增曲线图； SCRV的标准曲线图扩增曲线图； 。

40、根据标准曲线计算三 种病毒的荧光PCR 扩增效率均在90-105之间， 对应的R2值分别为(ISKNV)R20.975； (SCRV) R20.988； (LMBV)R20.984； 表明该荧光PCR体系在108100范围内有较好的扩增 效率和线性关系。 0127 如图3所示， 为试剂盒灵敏度测试结果图。 从左至右阳性标准品浓度依次是104、 103、 102、 101、 100copies/ L。 检测结果表明， 本发明试剂盒的灵敏度可达101copies/ L。 每一 梯度的标准样品进行3次平行实验， 结果表明3次重复的Ct值变异系数小于5(表4)， 表示 该方法具有良好的重复性和稳定性。。

41、 0128 表4 三重荧光PCR重复性检测 0129 0130 0131 如图4所示， 为试剂盒特异性测试结果图， 可以看出， 除阳性对照品有扩增曲线外， SHIV、 VNN、 TiLV、 CEV阳性样品核酸均无扩增， 说明该检测方法有较好的特异性。 0132 实施例7试剂盒应用实例 0133 将实验室保存的100份鱼类疑似样品， 利用本发明的试剂盒进行三重荧光 PCR检 说明书 9/12 页 11 CN 111733283 A 11 测， 同时利用普通PCR检测作为对照， 并结合测序、 免疫荧光等方法对试验结果进行验证。 其 中， 普通PCR的反应体系： 总体系20 l， 上下引物各1 l，。

42、 2Vazymetm Taq Master Mix 10 l， 模板2 l， ddH2O 6 l。 反应程序： 943min； 94 30s， 50 30s,72 1min， 循环35次； 72 8min； 25， forever。 0134 检测结果为： 三重荧光PCR检出ISKNV阳性样品41份， 可疑样品5份； SCRV阳性样品 7份， 可疑样品2份； LMBV阳性样品15份， 可疑0份； 其结果如表57所示。 0135 普通PCR检出ISKNV阳性样品35份， 可疑样品3份； SCRV阳性样品7 份， 可疑样品2 份； LMBV阳性样品8份， 可疑样品6份。 0136 如图5-7所示，。

43、 为普通PCR检测结果； 其中， 图5为ISKNV普通PCR检测结果， 图中， M： 2000bp marker， 9-54： 样品编号， NC： 阴性对照。 图6为 LMBV普通PCR检测结果， 图中， M： 2000bp marker， 5-62： 样品编号， PN： 阳性对照， NC： 阴性对照。 图7为SCRV普通PCR检测结果， 图中， M： 2000 bp marker， 11-84： 样品编号， PN： 阳性对照， NC： 阴性对照。 0137 可以看出， 检测结果一致， 本发明三重荧光PCR检测的Ct值也基本对应普通PCR的 条带亮度， 即荧光PCR的检测Ct值越低(阳性核酸拷。

44、贝数越高)， 对应样品的普通PCR检测条 带越亮； 但因为荧光PCR灵敏度较高， 通常Ct值高于32的样品， 使用普通PCR检测方法就很难 检出了， 这同样体现了荧光PCR 方法在早期筛查和避免漏检方面的优势。 对普通PCR检测为 阳性的样品， 回收扩增条带进行测序， 测序结果经NCBI数据库比对， 比对结果表明扩增条带 确实为对应病毒的核酸片段， 免疫荧光的验证结果也与荧光PCR检测结果一致。 经过以上临 床样品验证， 说明本试剂盒检测方法准确可靠， 不仅在检测灵敏度上明显优于普通PCR检测 方法， 且相比于普通PCR， 一方面减少了核酸电泳步骤， 大大缩短检测时间， 另一方面， 三重 荧光。

45、PCR在同一个反应体系可以同时检测三种病毒， 大大减小了体系配制的难度。 0138 表5 本发明试剂盒的检测结果(ISKNV) 说明书 10/12 页 12 CN 111733283 A 12 0139 0140 0141 表6 本发明试剂盒的检测结果(LMBV) 0142 样品编号 结果(CT值) 样品编号 结果(CT值) 5 可疑(36.40) 41 可疑(39.20) 6 阳性(26.10) 55 阳性(21.56) 11 阳性(24.34) 59 阳性(22.27) 17 可疑(37.56) 60 可疑(36.48) 20 阳性(18.32) 61 阳性(19.36) 21 可疑(38。

46、.94) 62 阳性(14.56) 22 阳性(20.23) 阳性对照 23.34 说明书 11/12 页 13 CN 111733283 A 13 38 可疑(36.23) 阴性对照 - 0143 表7 本发明试剂盒的检测结果(SCRV) 0144 样品编号 结果(CT值) 样品编号 结果(CT值) 11 阳性(22.21) 77 阳性(20.41) 19 阳性(14.67) 80 阳性(19.51) 35 阳性(24.30) 84 阳性(26.84) 37 可疑(35.61) 阳性对照 21.54 40 阳性(29.34) 阴性对照 - 76 可疑(36.67) / 0145 本领域技术人。

47、员应该理解的是， 本发明的使用不受限于上述特定应用。 就本文描 述或描绘的特定元素和/或特征而言， 本发明也不局限于其优选实施方案。 应当理解的是， 本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案， 且在不脱离由以下权利要求所阐述和 限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、 修改和替换。 说明书 12/12 页 14 CN 111733283 A 14 SEQUENCE LISTING 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 传染性脾肾坏死病毒、 大口黑鲈鱼病毒和鳜弹状病毒的三重荧光PCR检测试 剂盒 111 9 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 （Artif。

48、icial sequence） 1 cctgtcacac ccgtagac 18 2 22 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 2 gcagattcac cttgttgttg ac 22 3 27 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 3 ccttggtgca tctcgacctg aggttca 27 4 21 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 4 gtcgcatcat tcactggatt a 21 5 19 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 5 gcctggtttc atcatcct。

49、c 19 6 序列表 1/2 页 15 CN 111733283 A 15 22 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 6 tgcgacagtc tccgtgaaca cc 22 7 18 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 7 tcccgtgggt tggtttac 18 8 18 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 8 gccgccagca gtttaatc 18 9 27 DNA 人工序列 （Artificial sequence） 9 cagccaagag ttgagcacat agtcgcc 27 序列表 2/2 页 16 CN 111733283 A 16 图1 图2 说明书附图 1/4 页 17 CN 111733283 A 17 图3 图4 说明书附图 2/4 页 18 CN 111733283 A 18 图5 图6 说明书附图 3/4 页 19 CN 111733283 A 19 图7 说明书附图 4/4 页 20 CN 111733283 A 20 。