重组酶的纯化方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010620719.0 (22)申请日 2020.07.01 (71)申请人 济南国科医工科技发展有限公司 地址 250101 山东省济南市高新区综合保 税区港兴三路北段1号济南药谷研发 平台区3号楼401房间 (72)发明人 尹焕才蔺春茂殷建 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 孔凡玲 (51)Int.Cl. C12N 9/12(2006.01) (54)发明名称 重组酶的纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种重组酶的。

2、纯化方法， 包括 以下步骤： 1)收集完成重组酶表达后的菌株， 洗 涤； 2)将洗涤后的菌体重悬， 并破碎菌体； 3)无需 离心， 直接将菌体破碎液水浴加热一段时间， 再 离心取上清， 获得粗酶液； 4)将粗酶液进行Ni柱 纯化， 收集目的蛋白洗脱液； 5)超滤浓缩； 6)对纯 化后得到的重组酶进行酶活性和宿主DNA残留验 证。 本发明的方法可获得高纯度DNA聚合酶， 不仅 可用于普通的PCR反应， 在对反应条件要求较高 的荧光定量PCR及数字PCR反应也可以有效使用； 本发明可以应用到所有耐热DNA聚合酶的纯化流 程， 能减少相关实验的操作难度， 且可以为工业 化大规模生产提供借鉴和帮助。 。

3、权利要求书1页 说明书5页 附图5页 CN 111733145 A 2020.10.02 CN 111733145 A 1.一种重组酶的纯化方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)收集完成重组酶表达后的菌株， 使用Binding Buffer洗涤； 2)将洗涤后的菌体使用Binding Buffer重悬， 并破碎菌体； 3)无需离心， 直接将菌体破碎液水浴加热一段时间， 再离心取上清， 获得粗酶液； 4)将粗酶液进行Ni柱纯化， 收集目的蛋白洗脱液； 5)将目的蛋白洗脱液用截留分子量为目的蛋白分子量2/31/2的超滤管进行浓缩并 更换Storage Buffer， 加入等体积的甘油于-20下。

4、保存； 6)对纯化后得到的重组酶进行酶活性和宿主DNA残留验证。 2.根据权利要求1所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述步骤1)中， 通过在室温 下， 7000rpm、 离心5min收集菌株； 使用Binding Buffer洗涤至少2次。 3.根据权利要求1所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 使用的 Binding Buffer与洗涤后的菌体体积比为1:5。 4.根据权利要求1所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 使用超声或 溶菌酶破碎菌体。 5.根据权利要求4所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述步骤2)中， 使用超声破 碎菌体， 且。

5、超声条件为： 超声功率300W， 开5s， 停10s， 运行45min。 6.根据权利要求1所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述步骤3)中， 水浴加热温 度为70， 加热时间为40min； 离心取上清条件为： 12000rpm， 4， 离心30min。 7.根据权利要求1所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述步骤4)中使用AKTA蛋白 纯化系统进行Ni柱纯化。 8.根据权利要求1所述的重组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述Binding Buffer的配方 为： 20mM NaH2PO42H2O、 500mM NaCl、 15mM咪唑， pH为7.9。 9.根据权利要求1所述的重。

6、组酶的纯化方法， 其特征在于， 所述Storage Buffer的配方 为： 50mM Tris-HCl、 50mM KCl、 0.1mM EDTA、 1mM DTT， pH为7.9。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111733145 A 2 重组酶的纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学技术领域， 特别涉及一种重组酶的纯化方法。 背景技术 0002 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction， PCR)是80年代中期提出的体外核 酸扩增技术， 得益于Taq DNA聚合酶的发现及基因工程的发展， PCR反应的核心-DNA聚合酶 得以大批量的生产， 促进了。

7、以PCR技术为核心的一系列相关检测技术的发现和进步， 随着研 究的进一步发展， 更多地耐热DNA聚合酶被发现和应用， 其中从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)中分离的Pfu DNA聚合酶具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切核酸酶活性， 可以 在催化聚合反应的同时,纠正聚合反应过程中错误掺入的碱基， 具有高保真的DNA聚合活 性 ,极大的促进了基因工程的发展。 紧接着， KOD DNA聚合酶从日本的Kodakara岛的 solfatarichot spring分离而得的嗜热古柯氏柯达氏球菌(Hyperthermophilicarchaea Thermococcus kodaka。

8、raensis KOD1)筛选出来。 相对于Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶， KOD DNA聚合酶同样具备5 3 聚合酶活性和3 5 外切核酸酶活性， 同时还拥有更高的 延伸能力和合成能力， 成为了基因工程中高保真DNA聚合酶的新选择。 0003 具有热稳定性的DNA聚合酶在纯化过程中一般会使用菌体破碎及热纯化实验操 作， 然而简单的热纯化及菌体破碎并不能有效的去除杂蛋白及宿主DNA， 虽然有时候并不影 响一般PCR扩增反应的结果， 但对于对样本及扩增条件要求较高的荧光定量PCR及数字PCR 反应， 细微的差异足以导致结果的不同。 因此， 对DNA聚合酶的纯度提出了更高的要求。 基。

9、于 此， 我们提出了一种新的DNA聚合酶纯化制备方法， 并以KOD DNA聚合酶为例进行了研究。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足， 提供一种重组酶的 纯化方法。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是： 一种重组酶的纯化方法， 包括以 下步骤： 0006 1)收集完成重组酶表达后的菌株， 使用Binding Buffer洗涤； 0007 2)将洗涤后的菌体使用Binding Buffer重悬， 并破碎菌体； 0008 3)无需离心， 直接将菌体破碎液水浴加热一段时间， 再离心取上清， 获得粗酶液； 0009 4)将粗酶液进行Ni柱纯化，。

10、 收集目的蛋白洗脱液； 0010 5)将目的蛋白洗脱液用截留分子量为目的蛋白分子量2/31/2的超滤管进行浓 缩并更换Storage Buffer， 加入等体积的甘油于-20下保存； 0011 6)对纯化后得到的重组酶进行酶活性和宿主DNA残留验证。 0012 优选的是， 所述步骤1)中， 通过在室温下， 7000rpm、 离心5min收集菌株； 使用 Binding Buffer洗涤至少2次。 0013 优选的是， 所述步骤2)中， 使用的Binding Buffer与洗涤后的菌体体积比为1:5。 说明书 1/5 页 3 CN 111733145 A 3 0014 优选的是， 所述步骤2)中。

11、， 使用超声或溶菌酶破碎菌体。 0015 优选的是， 所述步骤2)中， 使用超声破碎菌体， 且超声条件为： 超声功率300W， 开 5s， 停10s， 运行45min。 0016 优选的是， 所述步骤3)中， 水浴加热温度为70， 加热时间为40min； 离心取上清的 条件为： 12000rpm， 4， 离心30min。 0017 优选的是， 所述步骤4)中使用AKTA蛋白纯化系统进行Ni柱纯化。 0018 优选的是， 所述Binding Buffer的配方为： 20mM NaH2PO42H2O、 500mM NaCl、 15mM 咪唑， pH为7.9。 0019 优选的是， 所述Storag。

12、e Buffer的配方为： 50mM Tris-HCl、 50mM KCl、 0.1mM EDTA、 1mM DTT， pH为7.9。 0020 本发明的有益效果是： 0021 本发明的方法可获得高纯度DNA聚合酶， 不仅可用于普通的PCR反应， 在对反应条 件要求较高的荧光定量PCR及数字PCR反应也可以有效使用； 本发明可以应用到所有耐热 DNA聚合酶的纯化流程， 能减少相关实验的操作难度， 且可以为工业化大规模生产提供借鉴 和帮助。 附图说明 0022 图1为本发明的实施例2中的热纯化条件优化实验结果； 0023 图2为本发明的实施例3中的AKTA纯化实验结果； 0024 图3为本发明的。

13、实施例4中的洗脱液浓缩实验结果； 0025 图4为本发明的实施例5中的非变性蛋白电泳实验结果； 0026 图5为本发明的实施例6中的宿主DNA残留验证实验结果； 0027 图6为本发明的实施例6中的酶活性验证实验结果； 0028 图7为本发明的实施例7中的荧光定量PCR实验结果； 0029 图8-9为本发明的实施例8中的数字PCR检测实验结果。 具体实施方式 0030 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。 0031 应当理解， 本文所使用的诸如 “具有” 、“包含” 以及 “包括” 术语并不排除一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。 。

14、0032 实施例1 0033 本实施例以对KOD DNA聚合酶的纯化为例进行详细说明。 0034 本实施例的一种重组酶的纯化方法， 包括以下步骤： 0035 1)预先构建KOD DNA聚合酶表达菌株， 然后将完成重组酶表达后的菌株在室温下， 7000rpm、 离心5min， 收集菌株， 使用Binding Buffer洗涤2次； 0036 2)将洗涤后的菌体使用Binding Buffer重悬(Binding Buffer与洗涤后的菌体体 积比为1:5)， 使用超声破碎菌体(超声条件为： 超声功率300W， 开5s， 停10s， 运行45min)， 直 至溶液澄清； 说明书 2/5 页 4 C。

15、N 111733145 A 4 0037 3)无需离心， 直接将菌体破碎液在70水浴加热40min， 大部分不耐热蛋白及少量 目的蛋白变性沉降； 然后在12000rpm， 4， 离心30min， 取上清， 获得粗酶液； 0038 4)将获得的粗酶液使用AKTA蛋白纯化系统进行Ni柱纯化， 在100mM咪唑梯度时增 加洗脱体积， 尽可能多的洗掉剩余杂蛋白， 并在200mM咪唑洗脱出目的蛋白并收集； 0039 5)将目的蛋白洗脱液用截留分子量为目的蛋白分子量2/31/2的超滤管进行浓 缩并更换Storage Buffer， 得到自制的高纯度KOD DNA聚合酶， 加入等体积的甘油于-20 下保存；。

16、 本实施例中， 目的蛋白分子量大约196kDa， 本实施例中用100kDa的超滤管进行浓 缩， 并更换Storage Buffer， 不仅可以浓缩蛋白， 还能进一步将小分子量的杂蛋白除去； 0040 其中， 本实施例中选择的超滤管为： 密理博Millipore 100kDa， 通常而言选择超滤 管应选择目标蛋白分子量1/3截留分子量的超滤管， 本实施例选用100kDa的超滤管不是为 了截留更多的蛋白， 而是为了使蛋白的纯度更高， 使可能存在的小分子杂蛋白超滤掉。 0041 其中更换Storage Buffer具体为： 实验操作， 将Ni柱纯化的蛋白(收集管有多个)， 加入到已加入ddH2O预冷。

17、的超滤管中， 4， 3000rcf， 离心至浓缩液小于0.5ml， 加入Storage Buffer 10ml， 4， 3000rcf， 继续离心至浓缩液小于0.5ml， 重复3次， 将浓缩液体加入等体 积甘油保存至-20， 得到自制的纯化后的重组酶。 0042 6)对纯化后得到的重组酶进行酶活性和宿主DNA残留验证。 0043 7)对纯化后得到的重组酶进行荧光定量PCR及数字PCR实验。 0044 其中， 所述Binding Buffer的配方为： 20mM NaH2PO42H2O、 500mM NaCl、 15mM咪 唑， pH为7.9。 0045 所述Storage Buffer的配方为。

18、： 50mM Tris-HCl、 50mM KCl、 0.1mM EDTA、 1mM DTT， pH为7.9。 0046 使用AKTA蛋白纯化系统进行Ni柱纯化中使用的洗脱A液配方为： 20mM NaH2PO4 2H2O， 500mM NaCl， pH7.9； 洗脱B液配方为： 20mM NaH2PO42H2O， 500mM NaCl， 500mM咪唑， pH7.9。 0047 实施例2进行热纯化条件优化实验 0048 优化的参数包括水浴温度和时间。 0049 参照图1， 为热纯化条件优化实验的结果， 图中线框所示的热纯化条件为： 未经离 心操作直接70水浴加热40min， 取离心上清。 相对。

19、于其他条件， 杂蛋白明显减少， 该条件下 获得了很好的结果。 同时， 菌体破碎液与菌体离心上清液经热纯化后， 在目的蛋白纯化效果 上无明显差异， 所以本发明的方案中， 省去破碎后的离心操作也不会影响结果， 从而能省时 省力， 简化步骤。 0050 实施例3进行AKTA纯化实验 0051 参照图2， 为AKTA纯化实验结果， 在100mM咪唑梯度时增加洗脱体积， 能尽可能多的 洗掉剩余杂蛋白， 到达200mM洗脱梯度， 目的蛋白均被洗脱下来。 0052 实施例4洗脱液浓缩实验 0053 参照图3， 为洗脱液浓缩实验结果， 从图中可以看出， lane8相对于浓缩之前lane1 变粗， 说明蛋白量增。

20、大了， 浓缩效果好； 但不符合196kDa的位置， 是因为SDS-PAGE在样品制 样阶段， 加热导致原本196kda的蛋白断了成了80多， 40多等的小断裂蛋白。 0054 实施例5非变性蛋白电泳实验 说明书 3/5 页 5 CN 111733145 A 5 0055 参照图4， 从实验结果可以看出非变性电泳蛋白条带(lane3)单一且大小合适。 0056 实施例6对实施例1获得的重组酶进行酶活性和宿主DNA残留验证实验 0057 1、 宿主DNA残留验证 0058 以采购的KOD DNA聚合酶为对照， 以某质粒作为模板， 按照如下表1和2所示的体系 和程序验证活性， 以下对比例(表中 “对。

21、” 一列)为采购的KOD DNA聚合酶， 编号1-7为通过以 上实施例1获得的自制重组酶。 0059 表1 0060 0061 表2 0062 0063 结果如图5所示， 说明自制酶取得了较好的结果。 图5中的 “酶” 即表示采购的KOD DNA聚合酶； 0064 关于宿主DNA检测的结果分析： 0065 Lane1没有条带说明采购的酶不含有宿主DNA； 0066 Lane2破碎液指的是菌体破碎之后的液体， 有条带， 有宿主DNA； 0067 Lane3粗酶液指的是菌体破碎液热处理后的离心上清， 有条带， 有宿主DNA； 0068 Lane4洗脱液指的是菌体破碎液热处理后的离心上清经Ni柱纯化。

22、时收集管中的含 有蛋白的液体， 无条带， 无宿主DNA； 说明纯化效果好； 0069 Lane5浓缩液指的是洗脱液经超滤浓缩之后的浓缩蛋白； 0070 Lane6-8是对lane3-5的对照， 说明有条带不是因为采购酶引起的， 是自身就存在 宿主DNA。 0071 2、 酶活性验证： 0072 以宿主16s DNA为模板， 进行PCR反应验证， 其结果如图6所示， 经Ni柱纯化与超滤 说明书 4/5 页 6 CN 111733145 A 6 浓缩后均未检测出宿主DNA。 图6中， Lane对是采购的KOD DNA聚合酶， 添加量0.4ul； Lane1-7 是自制酶不同浓度， 添加量0.1ul。

23、， 0.2ul， 0.4ul， 0.8ul， 1.2ul， 1.6ul， 2.0ul， 据结果来看， 本发明获得的自制酶具有很好的活性， 且专一性要比采购酶好。 0073 实施例7对实施例1获得的重组酶进行荧光定量PCR反应实验。 0074 参照图7反应体系及程序参考表一， 按照SYBR Green染料使用说明， 每个体系添加 适量染料， 结果显示该酶可用于荧光定量PCR。 0075 实施例8对实施例2获得的重组酶进行数字PCR检测实验。 0076 参考图8-9， 可以看出， 对比采购的聚合酶(图8)， 本发明的自制酶(图9)在数字PCR 中稳定性更好。 0077 尽管本发明的实施方案已公开如。

24、上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节。 说明书 5/5 页 7 CN 111733145 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/5 页 8 CN 111733145 A 8 图4 图5 图6 说明书附图 2/5 页 9 CN 111733145 A 9 图7 说明书附图 3/5 页 10 CN 111733145 A 10 图8 说明书附图 4/5 页 11 CN 111733145 A 11 图9 说明书附图 5/5 页 12 CN 111733145 A 12 。