LOC158435作为诊治喉鳞癌的生物标志物的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010703986.4 (22)申请日 2020.07.21 (71)申请人 北京泱深生物信息技术有限公司 地址 100176 北京市大兴区荣华南路10号 荣华鑫泰大厦3号楼1210室 (72)发明人 杨承刚孙耀兰 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 31/7088(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 LOC158435作为诊治喉鳞癌的生物标志物的 应用 。

2、(57)摘要 本发明公开了LOC158435作为诊治喉鳞癌的 生物标志物的应用。 本发明利用QPCR和体外细胞 实验证明， LOC158435与喉鳞癌的诊断与治疗密 切相关， 故本发明的研究成果为临床提供了一种 新的诊断方法和治疗方法。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图1页 CN 111733248 A 2020.10.02 CN 111733248 A 1.检测长链非编码RNA表达的试剂在制备诊断喉鳞癌的产品中的应用； 所述长链非编 码RNA是 LOC158435。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括： 通过反转录PCR、 实时定量 PCR、 免疫检测、 。

3、原位杂交或芯片技术检测LOC158435表达水平用的试剂。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括与LOC158435或其DNA序列结 合的核酸。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述核酸包括针对LOC158435的引物。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述引物具有SEQ ID NO.7-8所示的序列。 6.一种用于喉鳞癌诊断的产品， 其特征在于， 所述产品包括权利要求1-5中任一项所述 的试剂。 7.根据权利要求6所述的产品， 其特征在于， 所述产品可以是芯片、 试剂盒、 试纸、 或高 通量测序平台。 8.LOC158435在筛选预防或治疗喉。

4、鳞癌的候选药物中的应用。 9.LOC158435在制备预防或治疗喉鳞癌的药物中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述药物包括抑制LOC158435表达的物 质。 11.根据权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述抑制LOC158435表达的物质包括核 酸抑制物， 核酸抑制物包括shRNA、 小干扰RNA、 dsRNA、 微小RNA、 反义核酸， 或能表达或形成 所述shRNA、 小干扰RNA、 dsRNA、 微小RNA、 反义核酸的构建物。 12.根据权利要求11所述的应用， 其特征在于， 所述核酸抑制物为siRNA。 13.根据权利要求12所述的应用， 其特征在于。

5、， 所述siRNA序列如SEQ ID NO.17-18所 示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111733248 A 2 LOC158435作为诊治喉鳞癌的生物标志物的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医学领域， 涉及LOC158435作为诊治喉鳞癌的生物标志物的应用。 背景技术 0002 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤， 占头颈部肿瘤的第二位， 其发病率约占全身恶性 肿瘤的5%， 鳞状细胞癌约占喉癌总数的93%-99%， 喉鳞状细胞癌原发于声带部位者居多， 约 占60%。 黄新辉等对306例喉恶性肿瘤进行回顾性分析， 发现鳞状细胞癌占全部恶性肿瘤的 99. 7%， 其中又以高、 中分化。

6、鳞癌为主； 喉癌的原发部位以声门型居多， 其次为声门上型， 声 门下型； 吸烟、 饮酒与肿瘤的发生密切相关。 虽然手术、 放疗和化疗可以在不同程度上缓解 患者的痛苦， 但是治疗后常造成功能障碍、 局部畸形， 而且复发率较高， 严重威胁患者的身 心健康。 1971年Knudson提出的二次突变假说是一个为肿瘤遗传学研究工作者所普遍接受 的有关肿瘤发生机制的科学预言， 指导了30多年的肿瘤发生分子机制的研究。 探讨不同类 型肿瘤相关基因是认识肿瘤发生分子机制、 开展基因诊断和基因治疗的基本前提， 包括肿 瘤在内的疾病致病基因的克隆和定位仍是人类基因组计划完成后的一项重要内容。 Srinivus等研。

7、究发现， 肿瘤在很早期即可伴随肿瘤标志物的改变， 检测其含量变化有助于 肿瘤的早期发现。 基因水平的研究工作将是根治包括喉癌在内的所有肿瘤的关键。 因此， 寻 找并克隆喉癌特异性相关基因将为喉癌的分子机制、 基因诊断和基因治疗的研究提供广阔 前景。 0003 虽然肿瘤诊断与治疗的手段日新月异， 但全球的喉癌总体生存率并未得到明显改 善， 尤其是晚期病人。 其原因主要表现在三个方面： 首先， 喉癌早期临床表现多样， 给喉癌的 早期诊断带来了较大的难度， 多数患者早期未能接受及时有效的治疗， 如何找到喉癌早期 诊断的分子标记物， 是提高喉癌早期诊断率的关键。 二， 喉癌的治疗以手术为主， 放疗、 。

8、化疗 为辅， 尽管喉部分切除术及声门型喉癌早期采用C02激光治疗比例的提高， 使得喉功能完全 保留或部分保留， 术后并发症减少， 从而使患者的生活质量得到提高， 但术后复发率仍然很 高， 如果能找出喉癌促瘤基因或肿瘤抑制因子， 从中筛选出潜在的药物作用靶点， 将会为开 发出喉癌相关特异性的疫苗或/和抗癌新药奠定基础。 三， 不同患者所患喉癌在病理类型、 肿瘤分化程度、 就诊时病变严重程度等方面有差异， 不同喉癌患者有不同的临床表现及体 质状况， 对手术后放疗、 化疗的敏感性各有差异， 如何找到疗效监测， 预后判断的分子标志 物， 将为实现对喉癌的个性化治疗奠定基础。 发明内容 0004 本发明。

9、的目的在于提供一种用于诊断喉鳞癌的长链非编码RNA标志物。 本发明利 用QPCR实验证明LOC158435在喉鳞癌患者癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织， 因此可 以将LOC158435作为诊断喉鳞癌的分子标志物。 0005 为了实验上述目的， 本发明采用了如下技术方案： 本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备喉鳞癌诊断产品中的应用。 长链 说明书 1/8 页 3 CN 111733248 A 3 非编码RNA是 LOC158435。 0006 进一步， 所述试剂包括利用反转录PCR法、 实时定量PCR法、 芯片检测法、 DNA印迹 法、 或RNA印迹法或原位杂交法检测LOC1584。

10、35表达量时使用的试剂。 0007 更进一步， 所述试剂包括检测LOC158435表达量时使用的扩增引物。 0008 在本发明的具体实施方案中， 所述扩增引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所 示。 0009 本发明提供了一种用于喉鳞癌诊断的产品， 所述产品通过检测样本中前面所述的 长链非编码RNA的表达来诊断喉鳞癌。 0010 进一步， 所述产品包括但不限于芯片、 试剂盒、 试纸、 或高通量测序平台； 高通量测 序平台是一种特殊的诊断工具， 随着高通量测序技术的发展， 对一个人的RNA表达谱的构建 将成为十分便捷的工作。 通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱， 容易分。

11、析出哪个RNA 的异常与疾病相关。 因此， 在高通量测序中获知LOC158435表达异常与喉鳞癌相关也属于 LOC158435的用途， 同样在本发明的保护范围之内。 0011 所述试剂盒包括检测LOC158435表达量的试剂， 所述试剂包括与LOC158435或其 DNA序列结合的核酸， 所述核酸包括SYBR Green、 TaqMan 探针、 分子信标、 双杂交探针、 或复 合探针检测LOC158435表达量时使用的引物和/或探针。 0012 所述芯片包括检测LOC158435表达量的试剂， 所述试剂包括与LOC158435或其DNA 序列结合的核酸， 所述核酸包括能够检测LOC158435。

12、表达量的引物和/或探针。 0013 所述试纸包括检测LOC158435表达量的试剂， 所述试剂包括与LOC158435或其DNA 序列结合的核酸， 所述核酸包括能够检测LOC158435表达量的引物和/或探针。 0014 所述的试剂盒还可以包括： 容器、 使用说明书、 阳性对照物、 阴性对照物、 缓冲剂、 助剂或溶剂。 例如用于混悬或固定细胞的溶液， 可检测的标签或标记， 使核酸易于杂交的溶 液， 用于裂解细胞的溶液， 或用于核酸纯化的溶液。 0015 本发明的试剂盒的使用说明书， 其中记载了如何采用试剂盒进行检测， 和如何利 用检测结果对肿瘤发展进行判断、 对治疗方案进行选择。 0016 采。

13、用本发明的试剂盒， 可通过选自下组的各种方法( 包括但不限于) 检测 LOC158435： 反转录PCR法、 实时定量PCR法、 芯片检测法、 DNA印迹法、 或RNA印迹法或原位杂 交法。 本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。 0017 进一步， 所述引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。 0018 本发明提供了LOC158435在筛选预防或治疗喉鳞癌的候选药物中的应用。 0019 进一步， 筛选候选药物的步骤如下： 用候选物质处理表达或含有LOC158435的体系； 和 检测所述体系中LOC158435的表达； 其中， 若所述候选物质可降。

14、低LOC158435的表达， 优选显著降低， 则表明该候选物质是 预防或治疗喉鳞癌的候选药物。 0020 在本发明中， 所述体系包括 （但不限于） ： 细胞体系、 亚细胞体系、 溶液体系、 组织体 系、 器官体系或动物体系。 所述候选物质包括 （但不限于） ： 针对LOC158435或其上游或下游 设计的干扰分子、 核酸抑制物、 小分子化合物。 0021 在本发明中， 所述步骤还包括： 对获得的候选药物进行进一步的细胞实验和/或动 说明书 2/8 页 4 CN 111733248 A 4 物试验， 以从候选药物中进一步选择和确定对于预防、 缓解或治疗喉鳞癌有用的药物。 0022 本发明提供了L。

15、OC158435在制备预防或治疗喉鳞癌的药物中的应用。 0023 所述药物包括抑制LOC158435表达的物质。 0024 所述抑制LOC158435表达的物质包括核酸抑制物， 包括以LOC158435或其转录本为 靶序列、 且能够抑制LOC158435表达的干扰分子， 如： shRNA(小发夹RNA)、 小干扰RNA (siRNA)、 dsRNA、 微小RNA、 反义核酸， 或能表达或形成所述shRNA、 小干扰RNA、 dsRNA、 微小 RNA、 反义核酸的构建物。 0025 “小发夹RNA （Small hairpin RNA， shRNA） ” ， 其是能够形成发夹结构的非编码小 R。

16、NA分子， 小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。 如上述， shRNA可以由双链 DNA模板来表达。 双链DNA模板被插进一个载体， 例如质粒或病毒载体， 然后在体外或体内连 接到一个启动子进行表达。 shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下， 可被切割成小干扰RNA分 子， 从而进入RNAi途径。“shRNA 表达载体” 是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质 粒， 通常该质粒上存在 “间隔序列” 以及位于 “间隔序列” 两边的多克隆位点或供替换序列， 从而人们可以将shRNA （或类似物） 相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点 或替换其上的供替换序列，。

17、 该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA （Short Hairpin） 结构。 所 述的 “shRNA表达载体” 目前已经完全可以通过商购的途径购买获得， 例如一些病毒载体。 0026 所述 “小干扰RNA” 是指一种短片段双链RNA 分子， 能够以同源互补序列的mRNA为 靶目标降解特定的mRNA， 这个过程就是RNA干扰 （RNA interference） 过程。 小干扰RNA可以 制备成双链核酸的形式， 它含有一个正义链和一个反义链， 这两条链仅在杂交的条件下形 成双链。 一个双链RNA 复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。 因此， 举例来讲， 互补的正义链和反义链是化学。

18、合成的， 其后可通过退火杂交， 产生合成的双链RNA 复合物。 0027 进一步， 所述抑制LOC158435表达的物质为siRNA； 在本发明的具体实施方案中， 所 述siRNA序列如SEQ ID NO.17-18所示。 0028 本发明中的siRNA可以化学合成， 也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录 成单链RNA之后进行制备。 siRNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内， 或还可采用 本领域已知的多种技术被输送到细胞内。 0029 本发明提供了一种治疗喉鳞癌的药物组合物， 所述药物组合物包括抑制 LOC158435表达的物质， 和/或与所述物质配伍的其他药学上可接受的载体。 0。

19、030 所述药学上可接受的载体包括 （但不限于） 稀释剂、 赋形剂、 粘合剂、 湿润剂、 吸收 促进剂、 表面活性剂、 致湿剂、 吸附载体、 润滑剂、 缓冲剂、 稳定剂、 抑菌剂、 等渗剂、 螯合剂、 pH控制剂。 0031 本发明的药物组合物可口服给药、 非胃肠道给药、 通过吸入喷雾给药、 局部给药、 直肠给药、 鼻给药、 颊给药、 阴道给药或通过植入的贮药装置给药。 优选口服给药或注射给 药。 本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、 辅料或赋形剂。 0032 本发明的药物组合物还可以与其他治疗喉鳞癌的药物联用， 其他治疗性化合物可 以与主要的活性成分同时给药， 甚至在同一组合物中。

20、同时给药。 还可以以单独的组合物或 与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。 0033 优选的， 可采用基因治疗的手段进行。 比如， 可直接将抑制LOC158435表达的物质 （如siRNA， shRNA） 通过诸如注射等方法给药于受试者； 或者， 可通过一定的途径将携带其表 说明书 3/8 页 5 CN 111733248 A 5 达单位递送到靶点上， 这些均是本领域技术人员所熟知的。 0034 本发明还提供了一种诊断喉鳞癌的方法， 所述方法包括如下步骤： （1） 获取受试者喉部疑似患病组织； （2） 检测步骤1组织中LOC158435的表达水平； （3） 将测得的LOC15。

21、8435的表达水平与受试者的患病与否关联起来。 0035 （4） 与正常对照相比， 受试者喉部疑似患病组织中LOC158435的表达水平显著升 高， 则该受试者被判断患有喉鳞癌、 或判断该受试者患有喉鳞癌的风险高、 或者喉鳞癌患者 被判断为复发、 或者喉鳞癌患者被判断为预后不良。 0036 在本发明的上下文中，“正常对照” 可以指不患有喉鳞癌的正常人， 也可以指患有 喉鳞癌的人的癌旁组织。 0037 在本发明的上下文中，“诊断” 包括判断受试者是否已经患病、 判断受试者是否存 在患病的风险、 判断患者是否已经复发、 判断患者对药物治疗的反应性、 或者判断患者的预 后情况。 附图说明 0038 。

22、图1显示LncRNA表达对喉鳞癌细胞增殖影响的结果图； 图2显示LncRNA表达对喉鳞癌细胞迁移影响的结果图。 具体实施方式 0039 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。 实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条 件 ， 例如Sambrook 等人 ， 分子克隆 ： 实验室手册（New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989） 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0040 实施例1 差异表达分子验证 一、 研究对象 收集45例喉鳞癌患者的癌组织及相应的。

23、癌旁组织。 纳入排除标准： 患者除原发肿瘤 外， 无其他部位原发肿瘤， 原发肿瘤未转移； 无糖尿病、 高血压等心脑血管疾病史； 无肝 炎、 梅毒、 结核、 HIV等传染病病史； 无家族遗传性疾病史； 术前未行放疗、 化疗及生物治 疗等。 0041 取样注意事项： 切取肿瘤标本时注意切取肿瘤中央区域非坏死肿瘤组织， 切取癌 旁正常组织时尽可能远离肿瘤， 距肿瘤边缘1.5cm以上， 尽量切取粘膜上皮组织避免深层结 缔组织。 0042 二、 组织总RNA提取 利用Norgen RNA提取试剂盒提取组织总RNA： 组织裂解 1) 在较少RNase干扰的清洁区， 使用含适量液氮的研钵称取离体组织样本约2。

24、0 mg， 用 杵棒研磨至粉末状； 2) 将样本转移到一个不含RNA酶的2 mL的离心管中； 3) 加入300uL Lysis solution， 置于匀浆器内， 充分研磨1-5min； 说明书 4/8 页 6 CN 111733248 A 6 4) 12000 g， 4， 离心10min， 转移上清至新的1.5 mL的离心管中； 5) 加入600ul RNase-Free Water， 用漩涡器混匀； 6) 加入20ul蛋白酶K， 在55温浴15min， 不断涡旋混匀； 7) 14000 g， 室温， 离心1 min， 使细胞碎片沉淀于离心管底部， 取上清转移到另外一个 不含RNA酶1 5 。

25、mL的离心管中； 8) 加入450ul的95乙醇， 涡旋混匀； RNA吸附： 9) 取650ul含乙醇的裂解液加到离心柱中， 14000 g离心1 min； 10) 弃下层， 重置收集管于柱上； 11) 依照裂解液的容量， 重复9)10)步； 12) 加入400ulWash solution， 14000 g离心2min； 13) 弃下层， 将柱置于一新的收集管上； DNase处理： 14) 加入100ulEnzyme Incubation Buffer和15ulDNase I， 14000 g离心1min； 15) 将收集管中的溶液重新移入柱中； 16) 室温放置15min； RNA洗涤： 。

26、17) 加入400ulWash solution， 14000 g离心1min， 弃下层， 重置收集管于柱上； 18) 加入400ulWash solution， 14000 g离心2 min， 弃收集管； RNA洗脱： 19) 把柱子放入1.7mL Elution管中； 20) 加入30ul Elution Buffer； 21) 200 g离心2min， 使溶液充分与柱结合， 然后14000 g离心1 min。 0043 三、 反转录 反转录试剂盒 （DDR037A） 购自宝生物工程 （大连） 有限公司。 0044 以提取的总RNA （1 g） 为模板， 加入以下反应体系， 具体为： 5P。

27、rimeScript Buffer 4 L， PrimeScript RT Enzyme Mix 1 L， Oligo dT Primer （50 M） 1 L， Random 6 mers （100 M） 1 L， 以无RNA 酶的ddH2O将反应体积补足为20 L。 将上述混合液 置于37 15 min， 85 5s， 即获得cDNA。 该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR 检测。 0045 四、 QPCR 荧光实时 （Real-time） 定量PCR （polymerase chain reaction） 所用的SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNa。

28、seH Plus） 试剂盒为日本Takara 公司生产。 按照说明书进行操作。 0046 采用 2- Ct相对定量法分析LncRNA的表达水平， Ct是热循环仪检测到反应体系中 荧光信号的强度值。 计算方法为： Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)癌组织实验组-(Ct目 的基因-Ct内参基因)对照组织组， 2- Ct 表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的 变化倍数， 实验数据分析由 Bio-RAD分析软件完成。 0047 引物设计： 根据LncRNA序列， 通过NCBI 的引物设计工具 （Primer BLAST） 设计引 物， 引物序列如下所示： LOC730101 说明书 5/8 页。

29、 7 CN 111733248 A 7 上游引物： 5 - TGGATACGGCACAGATTA-3 （SEQ ID NO .1）； 下游引物： 5 - CAACGATGGATGGATGAC-3 （SEQ ID NO.2） 。 0048 LOC442028 上游引物： 5 - TCGCATATCATCAACACAAC-3 （SEQ ID NO .3）； 下游引物： 5 - ACCTGGAAGTTAATGTCTCA -3 （SEQ ID NO.4） 。 0049 LOC100507437 上游引物： 5 - GTGAACAAGGTGGATTGC-3 （SEQ ID NO .5）； 下游引物： 5。

30、 - GCTGGATTCTTCTTAATTCTTTG -3 （SEQ ID NO.6） 。 0050 LOC158435 上游引物： 5 - GGTGTGCCTATATGTGAA-3 （SEQ ID NO.7） ； 下游引物： 5 -CGAGTCAGAATGTTATGC-3 （SEQ ID NO.8） 。 0051 根据GAPDH （内参基因） 序列设计引物， 上游引物： 5 - CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3 （SEQ ID NO.9） ； 5 - GGTGGAATCATATTGGAACA-3 （SEQ ID NO.10） 。 0052 五、 统计学分析 采用统计学软件 SP。

31、SS19.0进行数据分析， 应用配对T检验判断癌组织与癌旁组织样本 中LncRNA的表达是否存在统计学意义上的差异。 统计检验都为双侧检验，P0.05 为差异 有统计学意义。 0053 六、 结果 统计结果如表1所示， 与癌旁组织相比， 喉鳞癌患者癌组织中LOC730101、 LOC442028、 LOC100507437、 LOC158435表达水平均显著上调， 组间差异具有统计学意义 （P0.05） 。 0054 表1 LncRNA表达情况统计 实施例2 LncRNA沉默 1、 细胞培养 人喉鳞癌细胞株Hep2， 以含10%胎牛血清和1% P/S的RPMI1640培养基在37、 5%CO2。

32、、 相 对湿度为90%的培养箱中培养。 2-3天换液1 次， 细胞生长良好， 呈单层贴壁生长。 使用0.25% 含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。 0055 2、 转染 1） 转染前细胞的处理 转染前一天， 6孔培养板上种35105个细胞/孔， 在无抗生素培养基中培养一天， 转染 时细胞密度为3050%， 于转染前换成无血清培养基。 说明书 6/8 页 8 CN 111733248 A 8 0056 2） siRNA的设计 实验设2个组： 阴性对照组 （siNC， 转染阴性对照siRNA） 、 siLncRNA沉默组 （转染针对 LncRNA的siRNA） 。 0057 其中， 针对LOC73。

33、0101的siRNA （si LOC730101） 序列如下： 正义链为5 -UAACAGAACUUAACAUCACCAtt-3 （SEQ ID NO .11）； 反义链： 5 - GUGAUGUUAAGUUCUGUUAGGtt-3 （SEQ ID NO.12） 。 0058 其中， 针对LOC442028的siRNA （si LOC442028） 序列如下： 正义链为5 - UCAAUGUAAGCAAUGAUUCUGtt-3 （SEQ ID NO.13） ， 反义链为5 - GAAUCAUUGCUUACAUUGACAtt-3 （SEQ ID NO.14） 。 0059 其中， 针对LOC10。

34、0507437的siRNA （si LOC100507437） 序列如下： 正义链为5 - UUUUGAGAGUUUACUAAACGUtt-3 （SEQ ID NO.15） ， 反义链为5 - GUUUAGUAAACUCUCAAAAGAtt-3 （SEQ ID NO.16） 。 0060 其中， 针对LOC158435的siRNA （si LOC158435） 序列如下： 正义链为5 - UUCUCUAACUCGAUACAGGAUtt-3 （SEQ ID NO.17） ， 反义链为5 - CCUGUAUCGAGUUAGAGAAAUtt-3 （SEQ ID NO.18） 。 0061 通用阴性对。

35、照siRNA （siNC） 序列为上海吉玛制药技术有限公司提供。 0062 3） 转染 a.取浓度为50pmol的siRNA 3 l加入47 l的无血清培养基， 轻轻混匀， 室温孵育5min； b. 取1 l Lipofectamine 2000加入49 l无血清培养基。 轻轻混匀， 室温孵育5min； c.将上述两种混合物混合 （总体积100 l） ， 轻轻混匀， 室温下孵育25min， 以使复合体形 成； d.在6孔板中每孔加入100 l的复合物及适量培养基， 轻轻混匀； e.孵育4896h后观察基因的沉默效应。 0063 3、 细胞转染效率检测 利用实施例1中记载的QPCR方法进行靶基因。

36、干扰情况测定， 结果显示， 本发明的 siLncRNA的干扰效率均达到70%以上， 可作为有效siRNA进行接下来的功能研究。 0064 实施例3 LncRNA表达对喉鳞癌细胞增殖的影响 WST-1法检测LncRNA表达对喉鳞癌细胞增殖的影响。 0065 细胞转染第二天， 调整细胞密度至 1102 / l， 接种于96孔板 （100 l/孔） ， 每组 设置3个复孔。 37、 5% CO2培养72小时后加入10 l WST-1孵育2 h后， 于酶标仪在波长450 nm处检测细胞的光密度 （D） 值。 0066 结果如图1所示， 组间差异具有统计学意义 （*P0 .05） 。 表明LOC7301。

37、01、 LOC442028、 LOC100507437、 LOC158435表达被抑制后可抑制喉鳞癌细胞增殖。 0067 实施例4 LncRNA表达对喉鳞癌细胞迁移的影响 细胞转染第二天， 收集处理组细胞， 计数1105个细胞， 用100 l无血清培养基重悬， 加 入Transwell 细胞培养板的小室上室， 在下室加入600 l完全培养基。 在 37， 5% CO2孵育 48h后， 取出小室， 用棉签轻轻擦去上室的细胞， 4%多聚甲醛固定20min， PBS洗涤1次， 用结晶 紫染色10min后， PBS洗涤1次， 光学显微镜 （200） 下计数上、 下、 左、 右、 中5个不同视野的总 细。

38、胞数， 取其平均值。 重复3次实验。 说明书 7/8 页 9 CN 111733248 A 9 0068 结果如图2所示， 组间差异具有统计学意义 （*P0.05， *P0.01， *P0.005） 。 表 明LOC730101、 LOC442028、 LOC100507437表达被抑制后可抑制喉鳞癌细胞迁移， 而 LOC158435表达被抑制对于喉鳞癌细胞迁移并未产生影响。 0069 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。 应当指出， 对于本 领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行若干改进 和修饰， 这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保。

39、护范围内。 说明书 8/8 页 10 CN 111733248 A 10 序列表 北京泱深生物信息技术有限公司 LOC158435作为诊治喉鳞癌的生物标志物的应用 18 SIPOSequenceListing 1.0 1 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 tggatacggc acagatta 18 2 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 caacgatgga tggatgac 18 3 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 tcgcatatca tcaacacaac 20 4 20 DNA 。

40、人工序列(Artificial Sequence) 4 acctggaagt taatgtctca 20 5 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 gtgaacaagg tggattgc 18 6 23 DNA 序列表 1/3 页 11 CN 111733248 A 11 人工序列(Artificial Sequence) 6 gctggattct tcttaattct ttg 23 7 18 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 7 ggtgtgccta tatgtgaa 18 8 18 DNA 人工序列(Artificial Seque。

41、nce) 8 cgagtcagaa tgttatgc 18 9 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 9 ctctggtaaa gtggatattg t 21 10 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 10 ggtggaatca tattggaaca 20 11 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 11 uaacagaacu uaacaucacc att 23 12 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 12 gugauguuaa guucuguuag gtt 2。

42、3 序列表 2/3 页 12 CN 111733248 A 12 13 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 13 ucaauguaag caaugauucu gtt 23 14 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 14 gaaucauugc uuacauugac att 23 15 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 15 uuuugagagu uuacuaaacg utt 23 16 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 16 guuuaguaaa cucucaaaag att 23 17 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 17 uucucuaacu cgauacagga utt 23 18 23 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 18 ccuguaucga guuagagaaa utt 23 序列表 3/3 页 13 CN 111733248 A 13 图1 图2 说明书附图 1/1 页 14 CN 111733248 A 14 。