胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010815357.0 (22)申请日 2020.08.14 (71)申请人 北京质肽生物医药科技有限公司 地址 102206 北京市昌平区回龙观镇生命 园路20号院7号楼101室 （昌平示范园） (72)发明人 翟鹏张媛媛赵新宇曾伶俐 金耀光陈旭吴博 (74)专利代理机构 北京植德律师事务所 11780 代理人 唐华东 (51)Int.Cl. C07K 14/605(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (54)发明名称 一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯。

2、化方法 (57)摘要 本发明公开了一种胰高血糖素样肽1类似 物的纯化方法， 所述方法包括使用聚合物反相填 料纯化GLP1类似物。 所述方法具有单位体积填 料载量高的特点， 能够减少样品损失， 提高纯化 产率， 降低生产成本。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 111718407 A 2020.09.29 CN 111718407 A 1.一种式(I)所示的GLP-1类似物的纯化方法， 所述方法包括使用聚合物反相填料纯化 GLP-1类似物； X7X8X9X10TFTSDVSSYLEX22QAAX26X27FIAWLVX34GX36G (I) 其中： X7为H或缺失； X8为A、 Aib。

3、、 G、 S、 V或缺失； X9为E或缺失； X10为G或缺失； X22为G或E； X26为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X27为E、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X34为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X36为R、 G、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 2.权利要求1所述的方法， 其中， 所述聚合物反相填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。 3.权利要求1或2所述的方法， 其中， 缺失X7X8。 4.权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述反相填料选自NM100、 DIAION HP20SS和/或 Super100。 5.权利要求1或2所。

4、述的方法， 其中， X8为A、 Aib、 G、 S或V。 6.权利要求1或2所述的方法， 其中， X22为G或E。 7.权利要求1或2所述的方法， 其中， X26为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 8.权利要求1或2所述的方法， 其中， X27为E、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 9.权利要求1或2所述的方法， 其中， X34为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 10.权利要求1或2所述的方法， 其中， X36为R、 G、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰 的K。 11.权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述脂肪酸选自C12-C22脂肪酸。 12.权利。

5、要求11所述的方法， 其中， 所述脂肪酸为棕榈酸或硬脂酸。 13.权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述脂肪酸衍生物选自： ， 或 其中， *表示该末端为与多肽链上赖氨酸侧链连接的位点。 14.权利要求1或2所述的方法， 其中， 式(I)所示的GLP-1类似物选自： （1） GLP1(7-37, 34R)， 其氨基酸序列为： 权利要求书 1/2 页 2 CN 111718407 A 2 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG； （2） GLP1(9-37, 34R)， 其氨基酸序列为： EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG； （3） GLP1(7。

6、-37, 8G, 22E, 36G)， 其氨基酸序列为： HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG； （4） 利拉鲁肽 （Liraglutide） ， 其结构为： （5） 司美鲁肽 （Semaglutide） ， 其结构为： 。 15.权利要求1或2所述的方法， 其中， 流动相的pH值在8.5-9.5范围内。 16.权利要求15所述的方法， 其中， 流动相的pH值为8.5-9.0。 17.权利要求1或2所述的方法， 其中， 使用酸或碱调节pH值； 所述酸为盐酸或醋酸； 所述 碱为氢氧化钠。 18.权利要求1或2所述的方法， 其中， 使用醇类为流动相； 所述醇为异丙醇、 乙。

7、醇、 丁醇 或丙醇。 19.权利要求18所述的方法， 其中， 所述流动相为： 5-50mM Tris， 1-10%w/w异丙醇， pH 8.5-9.5。 20.权利要求19所述的方法， 其中， 所述流动相为： 20mM Tris， 5%w/w异丙醇， pH 9.0。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111718407 A 3 一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种肽纯化方法， 特别是一种胰高血糖素样肽-1类似物的纯化方法。 背景技术 0002 糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。 高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或 其生物作用受损， 或两者兼有引起。 糖尿。

8、病时长期存在的高血糖， 导致各种组织， 特别是眼、 肾、 心脏、 血管、 神经的慢性损害、 功能障碍。 近年来中国糖尿病患病率增长迅速， 已经成为 世界上糖尿病患者人数最多的国家， 患病人数超过一亿。 0003 胰高血糖素样肽1 （GLP-1） 通过葡萄糖依赖方式作用于胰岛 细胞， 促进胰岛素基 因的转录， 增加胰岛素的生物合成和分泌； 刺激 细胞的增殖和分化， 抑制 细胞凋亡， 从而 增加胰岛 细胞数量， 抑制胰高血糖素的分泌， 抑制食欲及摄食， 延缓胃内容物排空等。 这些 功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。 0004 胰高血糖素样肽1 （GLP-1） 在人体内具有生物活性的主。

9、要形式是GLP-1 (7-37)， 但 其易被二肽基肽酶IV （DPP-IV） 水解， 半衰期不到5分钟。 因此成药的GLP-1受体激动剂必须 延长半衰期。 目前市场上代表性较为成熟的GLP1类药物为诺和诺德公司研制的利拉鲁肽 （Liraglutide） 和司美鲁肽 （Semaglutide） ， 其分子结构为GLP-1类似物分子上增加脂肪酸 侧链后形成的衍生物。 通过遮蔽 （或突变） DPP-IV酶切位点和白蛋白结合增长体内存留时间 的作用， 分别实现了一天一次给药方式。 0005 目前， 诺和诺德采用酵母重组表达方式生产， 国内仿制品多采用化学合成或大肠 杆菌重组表达实现。 化学合成法多采。

10、用小粒径 （10 m以下） C8或C18硅胶反相色谱纯化； 重组 表达生产的GLP-1类似物， 多采用阴离子 （如CN110498849A， CN04592381A） 阳离子 （如 CN110128552A， CN110724187A） 交换层析进行捕获纯化。 0006 小粒径硅胶C8/C18反相色谱， 对样品要求较高， 不适用于含有较多杂质的重组蛋 白样品的捕获纯化； 同时， 该类填料多以乙腈等有害有机溶剂作为洗脱相， 环保压力大。 此 外， 由于此类色谱填料对碱耐受能力极差， 不利于填料的在位清洗和重复使用。 重组表达生 产的GLP-1类似物， 如采用阴离子交换层析进行捕获纯化， 受宿主细。

11、胞DNA， 内毒素等杂质影 响较大； 而阳离子交换捕获纯化的方法， 需要将待捕获的样品的pH值调至蛋白等电点以下， 在对于GLP-1类样品， 由于宿主蛋白和核酸的存在， 在跨越等电点的过程中经常发生GLP-1 类样品的共沉淀， 且难于复溶， 造成样品大量损失。 发明内容 0007 为了减少样品损失， 提高纯化产率， 本发明提供了一种纯化GLP-1类似物的方法， 其使用聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物作为反相填料， 可实现接近或超过90%的产率， 同时可 使GLP-1类似物的载量达30g / L升色谱填料以上。 0008 具体来说， 本发明提出了如下技术方案： 一种式(I)所示的GLP-1类似物的纯化。

12、方法， 所述方法包括使用聚合物反相填料纯化 说明书 1/8 页 4 CN 111718407 A 4 GLP-1类似物； 优选地， 所述聚合物反相填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物， X7X8X9X10TFTSDVSSYLEX22QAAX26X27FIAWLVX34GX36G (I) 其中： X7为H或缺失； X8为A、 Aib、 G、 S、 V或缺失； X9为E或缺失； X10为G或缺失； X22为G或E； X26为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X27为E、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X34为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X36为R、 G、 。

13、K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； 优选地， 缺失X7、 X8、 X9或X10中的一个或多个； 更优选地， 缺失X7X8； 优选地， 反相填料选自NM100、 DIAION HP20SS和/或Super100。 0009 本发明的方法较之现有常用工艺有以下特点： 1.纯化过程单位体积填料载量高， 可达30克GLP-1/升色谱填料以上。 0010 2.纯化步骤简单， 使用等度洗脱， 可实现接近或超过90%以上的产率， 产物纯度可 达90%左右。 0011 3.填料粒径较大， 可承受样品中较高含量杂质， 同时背压小， 无需使用昂贵的高压 色谱仪。 0012 4.填料耐强酸强碱， 可用氢氧化钠。

14、反复清洗， 有效去除残留杂质， 增加填料使用循 环数。 0013 5.纯化中仅使用较少量的， 环境友好的醇类有机溶剂 （如乙醇， 异丙醇等） 。 0014 6.填料价格较低， 生产成本低。 附图说明 0015 图1为GLP-1融合蛋白示意图。 0016 图2示出了不同pH值下， GLP1类似物 （A. GLP1(7-37, 34R); B.GLP1(9-37, 34R)） 在聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱NM100上的载量测定。 0017 图3示出了不同pH值下， GLP1类似物 （GLP1(7-37, 8G, 22E, 36G)） 在聚苯乙烯- 二乙烯基苯聚合物反相色谱DIAION HP。

15、20SS色谱上的载量测定。 0018 图4示出了最适pH值下， GLP1类似物 （GLP1(9-37, 34R)） 在其他品牌聚苯乙烯-二 乙烯基苯聚合物反相色谱上的载量测定。 0019 图5示出了pH 9.0时， 酰化GLP1类似物在聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱 DIAION上的HP20SS上载量测定。 具体实施方式 0020 下面将结合附图对本公开的技术方案进行清楚、 完整地描述。 显然， 基于本公开中 的具体实施方式， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实 说明书 2/8 页 5 CN 111718407 A 5 施方式， 都属于本公开保护的范围。 002。

16、1 需要注意的是， 本文所使用的术语仅是为了描述具体实施方式， 而非意图限制根 据本公开的示例性实施方式。 0022 本文所用的术语 “GLP-1类似物” 意欲指定GLP-1 (7-37)、 GLP-1 (7-36)酰胺及其 类似物和衍生物。 这样的GLP-1肽包括但不限于天然胰高血糖素样肽-1， 例如WO 87/06941 中公开的这些包含GLP-1 (7-37)及其功能性衍生物的肽碎片； WO 90/11296中公开的这些 包含GLP-1 (7-36)及其功能性衍生物的肽碎片； WO 91/11457中公开的活性GLP-1肽7-34、 7-35、 7-36和7-37这些类似物； WO 98。

17、/08871中公开的这些GLP-1衍生物， 其中亲脂性取代基 连接在至少一个氨基酸残基上； EP 0699686-A2中公开的这些GLP-1的N-末端截短的片段； 和EP 0708179-A2公开的这些包括N-末端咪唑基团的GLP-1类似物和衍生物。 0023 如上所述， 本公开的目的在于提供一种纯化GLP-1类似物的方法， 以解决样品损失 大、 影响因素多等的技术问题， 提高工艺稳定性和效率。 0024 本发明的式(I)所示的GLP-1类似物的纯化方法包括使用聚合物反相填料纯化 GLP-1类似物； 优选地， 所述聚合物反相填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物， X7X8X9X10TFTSDVSS。

18、YLEX22QAAX26X27FIAWLVX34GX36G (I) 其中： X7为H或缺失； X8为A、 Aib、 G、 S、 V或缺失； X9为E或缺失； X10为G或缺失； X22为G或E； X26为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X27为E、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X34为R、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K； X36为R、 G、 K或侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 0025 在本发明的优选实施方案中， 缺失X7、 X8、 X9或X10中的一个或多个。 0026 在本发明的一个具体实施方案中， 缺失X7X8。 0027 在本发明的一个具体。

19、实施方案中， 缺失X7X8X9X10。 0028 在本发明的优选实施方案中， 反相填料选自苏州纳微科技股份公司NM100、 三菱化 学株式会社DIAION HP20SS和/或苏州强耀生物科技有限公司Super100。 0029 在本发明的优选实施方案中， X8为A、 Aib、 G、 S、 V或缺失。 0030 在本发明的一个具体实施方案中， X8为A。 0031 在本发明的一个具体实施方案中， X8为Aib。 Aib即为2-氨基异丁酸。 0032 在本发明的一个具体实施方案中， X8为G。 0033 在本发明的一个具体实施方案中， X8为S。 0034 在本发明的一个具体实施方案中， X8为V。

20、。 0035 在本发明的一个具体实施方案中， X22为G。 0036 在本发明的一个具体实施方案中， X22为E。 0037 在本发明的一个具体实施方案中， X26为R。 说明书 3/8 页 6 CN 111718407 A 6 0038 在本发明的一个具体实施方案中， X26为K。 0039 在本发明的一个具体实施方案中， X26为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 0040 在本发明的一个具体实施方案中， X27为E。 0041 在本发明的一个具体实施方案中， X27为K。 0042 在本发明的一个具体实施方案中， X27为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 0043 在本发明的一个具。

21、体实施方案中， X34为R。 0044 在本发明的一个具体实施方案中， X34为K。 0045 在本发明的一个具体实施方案中， X34为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 0046 在本发明的一个具体实施方案中， X36为R。 0047 在本发明的一个具体实施方案中， X36为G。 0048 在本发明的一个具体实施方案中， X36为K。 0049 在本发明的一个具体实施方案中， X36为侧链被脂肪酸或脂肪酸衍生物修饰的K。 0050 在本发明的一个具体实施方案中， 缺失X7X8。 0051 在本发明的一个具体实施方案中， 缺失X7X8X9X10。 0052 在本发明的优选实施方案中， 所述脂。

22、肪酸选自C12-C22脂肪酸， 更优选地， 所述脂 肪酸为棕榈酸或硬脂酸。 0053 在本发明的优选实施方案中， 所述脂肪酸衍生物选自： ， 或 其中， *表示该末端为与多肽链上赖氨酸侧链连接的位点。 0054 式(I)所示的GLP-1类似物选自： （1） GLP1(7-37, 34R)， 其氨基酸序列为： HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG； （2） GLP1(9-37, 34R)， 其氨基酸序列为： EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG； （3） GLP1(7-37, 8G, 22E, 36G)， 其氨基酸序列为： HGEGTFTSDVSS。

23、YLEEQAAKEFIAWLVKGGG； （4） 利拉鲁肽 （Liraglutide） ， 其结构为： 说明书 4/8 页 7 CN 111718407 A 7 （5） 司美鲁肽 （Semaglutide） ， 其结构为： 。 0055 在本发明的优选实施方案中， 流动相的pH值在8.5-9.5范围内； 更优选为pH 8.5- 9.0。 0056 在本发明的优选实施方案中， 使用酸或碱调节pH值。 所述酸选自有机酸或无机酸， 优选地， 所述酸为盐酸或醋酸。 所述碱选自有机碱或无机碱， 优选的， 所述碱为氢氧化钠。 0057 在本发明的优选实施方案中， 使用醇类为流动相； 优选地， 使用异丙醇、。

24、 乙醇、 丁醇 或丙醇作为流动相。 0058 在本发明的一个具体实施方案中， 使用异丙醇作为流动相； 优选地， 所述流动相 为： 5-50mM Tris， 1-10%w/w异丙醇， pH 8.5-9.5； 更优选地， 所述流动相为： 20mM Tris， 5%w/ w （质量分数） 异丙醇， pH 8.5-9.0。 0059 本发明所述的GLP-1类似物化学合成方法和基因工程方法既可以用化学合成法生 产， 也可以用基因工程方法生产， 优选使用基因工程方法。 其中的化学方法优选是固相合成 法。 当然还可以采用本领域公知的其它常规方法来合成。 0060 本发明的优选实施方案中， 使用苏州纳微科技有。

25、限公司生产的NM100， 日本三菱化 学控股株式会社生产的DIAION HP20SS， 苏州强耀生物科技有限公司生产的Super100等聚 苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相填料进行纯化。 0061 本发明的实验结果表明， 聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相填料受上样样品pH影 响明显， 仅在pH8.5-9.5范围内， 可实现理想载量(30g/L左右)。 0062 下面通过具体实施例来说明本发明的技术方案。 0063 实施例1 GLP1类似物融合蛋白的制备 编码GLP1类似物融合蛋白(见图1)的质粒转化至BL21(DE3)衍生的大肠杆菌宿主工程 菌中进行表达， 表达产生不可溶性包涵体。 经菌体破碎后， 。

26、回收包涵体； 溶解复性后以蛋白 酶酶切去除表达标签， 加入1/20质量分数的异丙醇后， 调节pH值至指定值。 离心， 澄清， 获得 GLP1 (9-37, 34R)， GLP1(7-37, 34R)或GLP1 (7-37, 8G, 22E, 36G)样品。 0064 利拉鲁肽样品， 由GLP1(7-37, 34R)样品经化学酰化反应， 连接脂肪酸侧链制备； 司美鲁肽样品， 由GLP1 (9-37, 34R)样品经化学反应， 添加N-端非天然氨基酸和脂肪酸侧 链制备。 0065 实施例2 pH值对层析填料载量的影响 （1） 使用NM100层析填料色谱柱 使用8mL装填NM100层析填料色谱柱， 。

27、以流动相A1 （20mM Tris， 5%w/w异丙醇， pH 8.5； 测 试pH 8.0及以上样品） 或A2 （0.1% w/w甲酸， 5% w/w异丙醇； 测试pH 3.0和pH2.5样品时） 平 衡， 将实施例1制备的GLP1(7-37, 34R)或GLP1(9-37, 34R)样品在不同pH值的样品连续上 样至30克的蛋白/每升色谱填料左右， 检测在不同体积流穿样品中目的蛋白浓度， 样品上样 说明书 5/8 页 8 CN 111718407 A 8 量通过如下公式计算： 结果如见图2所示， 其中， 图2A为GLP1(7-37, 34R)的载量测定， 图2B为GLP1(9-37, 34。

28、R)的载量测定。 以流穿比例低于20%作为标准， 在使用pH8.5和9.0样品时， 对于上述两种 GLP1类似物， 聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱填料均可实现30g/L左右的上样载量。 0066 （2） 使用DIAION HP20SS层析填料色谱柱 相似的， 使用8mL装填DIAION HP20SS层析填料色谱柱， 以流动相A1 （20mM Tris， 5%w/w 异丙醇， pH 8.5； 测试pH 8.0及以上样品） 或A2 （0.1% w/w甲酸， 5% w/w异丙醇； 测试pH 3.0 样品时） 平衡， 将实施例1制备的GLP1 (7-37, 8G, 22E, 36G)样品在不同pH。

29、值的样品连续 上样至30克的蛋白/每升色谱填料左右， 检测在不同体积流穿样品中目的蛋白浓度， 样品上 样量通过前述相同公式计算。 0067 结果如见图3所示。 以流穿比例低于20%作为标准， 在样品pH为7.5-9.0时， 对于此 GLP1类似物， 聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱填料可实现30g/L左右的上样载量。 0068 实施例3 上样量对层析填料效果的影响 （1） GLP1 (9-37, 34R)样品 依实施例1中描述方法， 制备的GLP1 (9-37, 34R)样品， 酶切后加入1/20质量的异丙 醇， 如pH在8.5-9.5范围之外， 以盐酸或氢氧化钠调节pH至此区间中。 006。

30、9 使用27mL装填NM100层析填料色谱柱， 以流动相A1 （20mM Tris， 5%w/w异丙醇pH 8.5） ， 将GLP1(9-37, 34R） 样品按不同上样比例上样， 以流动相B(20mM Tris， 30%w/w异丙 醇， pH 8.5)洗脱目的多肽， 比较流穿比例、 回收率、 洗脱峰体积和洗脱峰纯度 （以反相高压 液相色谱法测定） 等参数， 结果见表1。 0070 表1 不同上样量下聚苯乙烯聚合物反向色谱纯化GLP1 (9-37, 34R)效果比较 （2） GLP1(7-37, 34R)样品 依实施例1中描述方法， 制备的GLP1(7-37, 34R)样品， 酶切后加入1/2。

31、0质量的异丙醇， 如pH在8.5-9.5之外， 以盐酸或氢氧化钠调节pH至此区间中。 0071 使用27mL装填NM100层析填料色谱柱， 以流动相A1 （20mM Tris， 5%w/w异丙醇， pH 8.5） ， 将GLP1(7-37, 34R)样品按不同上样比例上样， 以流动相B(20mM Tris， 30%w/w异丙 醇， pH 8.5)洗脱目的多肽， 比较流穿比例， 回收率， 洗脱峰体积和洗脱峰纯度等参数， 结果 见表2。 0072 表2 不同上样量下聚苯乙烯聚合物反向色谱纯化GLP1 (7-37, 34R)效果比较 说明书 6/8 页 9 CN 111718407 A 9 以上实例。

32、说明， 以上两种GLP1类似物， 均可在NM100聚合物反相填料柱上实现接近40 克/升载量， 洗脱回收率、 洗脱峰体积和洗脱峰纯度在不同上样量测试中， 基本保持一致。 0073 实施例4： 其他聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反向色谱填料效果 采用与实施例1中相同方法制备GLP1(9-37, 34R)样品， 酶切后加入1/20质量的异丙 醇， 如pH在8.5-9.5范围之外， 以盐酸或氢氧化钠调节pH至此区间中。 使用27mL色谱柱分别 装填DIAION HP20SS或Super100层析填料。 测试时， 以流动相A1 （20mM Tris， 5%w/w异丙醇， pH 8.5） 平衡后， 将GLP。

33、1(9-37, 34R） 样品按约40克目标蛋白/升色谱填料比例上样， 以流动 相B(20mM Tris， 30%w/w异丙醇， pH 8.5)洗脱结合的目的多肽， 采用实施例2中描述的方法， 绘制流穿曲线 （图4） ； 同时， 比较最终流穿比例、 回收率、 洗脱峰体积和洗脱峰纯度等参数 （表3） 。 0074 表3： 不同品牌填料的纯化效果比较 填料上样量(g/L)流穿比例洗脱回收率洗脱峰体积 （CV） 洗脱峰纯度 HP20SS41.62.2%93.7%1.6 90.6% Super10038.42.5%100.7%2.0 89.7% 以上实例说明， GLP1类似物在其他聚苯乙烯-二乙烯基苯。

34、聚合物反相填料DIAION HP20SS和Super100柱上均实现40克/升以上载量， 洗脱回收率， 洗脱峰体积和洗脱峰纯度与 NM100相比， 基本保持一致。 0075 实施例4： 酰化修饰的GLP-1类似物使用聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反向色谱填 料纯化效果 使用8mL装填DIAION HP20SS层析填料色谱柱， 以流动相A1 （20mM Tris， 5%w/w异丙醇， pH 8.5； 测试pH 8.0及以上样品） 平衡， 将实施例1制备的利拉鲁肽和司美鲁肽样品 （预先调 节pH至9.0） 连续上样至30克的蛋白/每升色谱填料以上， 检测在不同体积流穿样品中目的 蛋白浓度， 样品上样量。

35、通过前述相同公式计算。 结果如见图5所示。 以流穿比例低于20%作为 标准， 在样品pH为9.0时， 对于这两种GLP1类似物， 聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物反相色谱填 料DIAION HP20SS可实现约30g/L的上样载量。 0076 上样后， 以流动相A1充分冲洗色谱柱去除非特异性结合蛋白后， 以流动相B (20mM Tris， 30%w/w异丙醇， pH 8.5)洗脱目的多肽， 计算洗脱峰产率和总回收率 （目的蛋白在流穿 中的比例+洗脱峰中的比例） 。 结果如表4所示， 结果显示， 酰化GLP1类似物， 在聚苯乙烯-二 乙烯基苯聚合物反相填料色谱纯化中， 并未出现柱上聚集等造成蛋白损失的情况， 总回收 率超过90%。 0077 表4： 酰化GLP-1载量回收率测定 说明书 7/8 页 10 CN 111718407 A 10 说明书 8/8 页 11 CN 111718407 A 11 图1 图2A 图2B 说明书附图 1/3 页 12 CN 111718407 A 12 图3 图4 说明书附图 2/3 页 13 CN 111718407 A 13 图5 说明书附图 3/3 页 14 CN 111718407 A 14 。