Annullatins系列天然物及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010660023.0 (22)申请日 2020.07.10 (71)申请人 新乡医学院 地址 453003 河南省新乡市金穗大道601号 (72)发明人 房立真胡书瑜宋宇张涛 高庆贺王亚坤孙倩倩朱润青 段迎超白素平 (74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 代理人 时立新 (51)Int.Cl. C07D 493/04(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 9/14(2006.01) A61P 9/00(2006.01。

2、) A61K 31/365(2006.01) (54)发明名称 Annullatins系列天然物及其制备方法和应 用 (57)摘要 本发明属药物化学领域， 涉及一种虫草次生 代谢产物Annullatins系列天然物及其制备方法 和应用。 通过实验， 设计和建立了全合成路线， 以 市售易得原料为底物， 经过温和的反应， 完成 Annullatins系列天然物的制备。 本发明设计的 Annullatins系列天然物经过体外抗糖尿病血管 并发症活性测试， 结果显示： 其对高糖诱导的血 管内皮细胞起到保护作用， 有利于临床上糖尿病 血管并发症的预防和治疗。 其具有如下结构通 式： 权利要求书2页 说明。

3、书9页 附图2页 CN 111763216 A 2020.10.13 CN 111763216 A 1.Annullatins系列天然物， 其特征在于， 结构通式如下： 2.一种制备如权利要求1所述的Annullatins系列天然物的方法， 其特征在于， 通过如 下步骤实现： (1)取氯铬酸吡啶、 硅藻土和CH2Cl2于反应瓶中， 将溶于CH2Cl2的化合物1滴加入反应瓶 中， 室温下搅拌反应， 用TLC检测， 待原料消耗完， 将反应瓶中的滤渣抽滤， 经洗涤， 减压浓 缩， 硅胶柱层析纯化得到化合物2； (2)称量NaH于干燥的反应瓶中， 加入无水四氢呋喃， 冰浴降温， 在氩气保护下缓慢滴加 。

4、1,3-丙酮二甲酸二甲酯到反应瓶中， 然后加入化合物2到混合反应液中， 冰浴下搅拌反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物3； (3)称取化合物3于反应瓶中， 滴加BrCH2CO2CH3， 加入丙酮， 在搅拌下加入K2CO3， 进行回 流反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物4； (4)称量CrO3研磨后加入反应瓶中， 分别量取Ac2O和AcOH于反应瓶中， 在冰浴下搅拌， 缓 慢滴加用AcOH稀释的化合物4， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合 物5； (5)称取化合物5、 十六烷基三甲基溴化铵、 。

5、(R,R)-N-(对甲苯磺酰)-1,2-二苯基乙二胺 (氯)(对丙基甲苯)钌(II)、 甲酸钠于反应瓶中， 在氩气保护下， 将CH2Cl2加入反应瓶中， 常温 下反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物6； (6)量取甲醇于反应瓶中， 分批加入钠块， 待钠块完全反应之后， 磁力搅拌下将CH3OH溶 解的化合物6滴加到反应瓶中， 回流反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理 得到化合物7； (7)取化合物7、 二甲基亚砜、 H2O于反应瓶中， 搅拌下加入LiOH， 回流反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物8。

6、； (8)称量化合物8， 碱性氧化铝于反应瓶中， 加入丙酮， 室温下反应， TLC监测反应， 待原 料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物9； (9)称取化合物9、 十六烷基三甲基溴化铵、 (R,R)-N-(对甲苯磺酰)-1,2-二苯基乙二胺 (氯)(对丙基甲苯)钌(II)、 甲酸钠于反应瓶中， 在氩气保护下， 将CH2Cl2和H2O加入反应瓶 中， 常温下反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到目标化合物； 权利要求书 1/2 页 2 CN 111763216 A 2 3.如权利要求1所述的Annullatins系列天然物的应用， 其特征在于， 以其为活性成份，。

7、 用于制备治疗或预防糖尿病血管并发症药物。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111763216 A 3 Annullatins系列天然物及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属药物化学领域， 涉及Annullatins系列天然物及其制备方法和在治疗糖 尿病血管并发症药物中的应用。 背景技术 0002 糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢性疾病， 控制不良会引起许多并发症， 其中之一是血管受损， 使患心血管疾病的风险加倍。 血管内皮细胞作为糖尿病血管病变的 中心环节， 有着重要的生理作用， 是血管的屏障保护层， 参与机体的凝血， 免疫反应， 产生和 释放各种活性物质， 维持着心血管稳态。

8、的平衡， 为血管正常功能和血液的供应提供基础。 内 皮细胞功能失调是糖尿病血管并发症最早出现的病理现象， 持续的高血糖可导致内皮功能 障碍和活性氧产生增加从而导致内皮细胞损伤。 0003 目前治疗糖尿病及其并发症的药物或手段， 只能使血糖水平控制在一定的范围从 而降低血糖并延缓并发症的发生。 临床上主要通过注射胰岛素来控制 型糖尿病的血糖水 平， 通过减少葡萄糖的产生、 抑制胰岛素的抵抗来缓解型糖尿病， 而对糖尿病血管并发症 的治疗途径随着研究者们不断的发现， 使得由以往单一增加胰岛素的降糖作用发展到控制 葡萄糖代谢、 抑制胰岛素抵抗、 减轻氧化应激等方面。 目前药物化学家正在不断研发新型抗 。

9、糖尿病及其并发症的药物， 以期能够找到治疗效果好、 防治范围广的新途径来降低糖尿病 及其并发症的发生和猝死率， 提高患者的生存质量。 0004 Annullatins是从虫草发酵液中分离得到的次生代谢产物， 其结构新颖， 分子量适 中， 具有较好的药物先导化合物的特征。 目前没见相关报道。 发明内容 0005 本发明提供了一种Annullatins系列天然物， 研究发现Annullatins具有神经调节 作用， 尚无治疗糖尿病血管并发症的报道。 因此， 本发明通过全合成Annullatins系列天然 物并通过建立高糖诱导的HUVEC细胞损伤模型， 探讨Annullatins对高糖损伤的血管内皮。

10、细 胞的保护作用以及其潜在的作用机制， 旨在为糖尿病血管并发症的治疗等临床研究提供理 论基础。 0006 同时本发明提供了Annullatins系列天然物通用、 简便、 有效的全合成方法。 0007 本发明的技术方案如下： 0008 所述Annullatins系列天然物结构式如通式(I)所示： 0009 说明书 1/9 页 4 CN 111763216 A 4 0010 其合成方法： 以1,3-丙酮二羧酸酯类化合物为原料， 先与炔醛经Michael-Aldol反 应构建出苯环上含有酚羟基的苯基化合物， 然后经酚羟基与卤代羧酸酯的取代反应、 苄位 的氧化及还原等反应完成苯并呋喃酮内酯的构建。 再。

11、在碱性条件下通过迪克曼缩合和 Krapho反应构建出苯并呋喃环， 通过一系列官能团转换分别完成该类化合物的消旋全合 成。 此外,在该路线中， 采用相应的手性试剂催化还原羰基或双键即可构建出相应的手性中 心， 完成Annullatins系列天然物的全合成。 0011 其反应路线如下： 0012 0013 具体通过如下步骤实现： 0014 (1)取氯铬酸吡啶、 硅藻土和CH2Cl2于反应瓶中， 将溶于CH2Cl2的化合物1滴加入反 应瓶中， 室温下搅拌反应， 用TLC检测， 待原料消耗完， 将反应瓶中的滤渣抽滤， 经洗涤， 减压 浓缩， 硅胶柱层析纯化得到化合物2； 0015 (2)称量NaH于干。

12、燥的反应瓶中， 加入无水四氢呋喃(THF)， 冰浴降温， 在氩气保护 下缓慢滴加1,3-丙酮二甲酸二甲酯到反应瓶中， 然后加入化合物2到混合反应液中， 冰浴下 搅拌反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物3； 0016 (3)称取化合物3于反应瓶中， 滴加BrCH2CO2CH3， 加入丙酮， 在搅拌下加入K2CO3， 进 行回流反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物4； 0017 (4)称量CrO3研磨后加入反应瓶中， 分别量取Ac2O和AcOH于反应瓶中， 在冰浴下搅 拌， 缓慢滴加用AcOH稀释的化合物4， TLC监测反应，。

13、 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到 化合物5； 0018 (5)称取化合物5、 十六烷基三甲基溴化铵、 (R,R)-N-(对甲苯磺酰)-1,2-二苯基乙 二胺(氯)(对丙基甲苯)钌(II)(Ru-1(R， R)、 甲酸钠于反应瓶中， 在氩气保护下， 将CH2Cl2加 入反应瓶中， 常温下反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物6； 说明书 2/9 页 5 CN 111763216 A 5 0019 (6)量取甲醇于反应瓶中， 分批加入钠块， 待钠块完全反应之后， 磁力搅拌下将 CH3OH溶解的化合物6滴加到反应瓶中， 回流反应， TLC监测反应， 待原料。

14、消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物7； 0020 (7)取化合物7、 二甲基亚砜、 H2O于反应瓶中， 搅拌下加入LiOH， 回流反应， TLC监测 反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物8； 0021 (8)称量化合物8， 碱性氧化铝于反应瓶中， 加入丙酮， 室温下反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到化合物9； 0022 (9)称取化合物9、 十六烷基三甲基溴化铵、 (R,R)-N-(对甲苯磺酰)-1,2-二苯基乙 二胺(氯)(对丙基甲苯)钌(II)(Ru-1(R， R)、 甲酸钠于反应瓶中， 在氩气保护下， 将CH2Cl2和 H2O加入反。

15、应瓶中， 常温下反应， TLC监测反应， 待原料消耗完， 停止反应； 经后处理得到目标 化合物。 0023 本发明通过体外培养HUVEC， 随机分为正常组(葡萄糖浓度为5.5mM)、 高糖组(葡萄 糖浓度为33mM)、 给药组(Annullatin+葡萄糖浓度为33mM)， 继续培养48h。 发现本发明所述 的药物对高糖诱导的细胞损伤和凋亡有抑制作用。 0024 本发明所述的药物通过降低活性氧水平， 提高谷胱甘肽含量， 以减轻细胞的氧化 应激状态。 所述活性氧水平可通过DCF的荧光强度来检测， 当本身没有荧光并可自由穿过细 胞膜的DCFH-DA探针进入细胞内后， 被水解为不能透过细胞膜DCFH。

16、从而标记到细胞内， 当细 胞内有活性氧存在时， 可以把DCFH氧化为绿色荧光物质DCF， 其荧光强度与细胞内活性氧水 平成正比。 谷胱甘肽是一种低分子清除剂， 它可清除O2-、 H2O2、 LOOH， 谷胱甘肽的含量多少是 衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。 0025 本发明所述的药物能够保护线粒体功能、 维持线粒体膜电位。 所述对线粒体膜电 位的影响通过使用JC-1和Mito-Tracker Red CMXRos荧光探针检测。 具体而言， JC-1以单体 和多聚体两种形式存在， JC-1在线粒体膜电位高时， 形成聚合物产生红色荧光， 线粒体膜电 位较低时， 为单体产生绿色荧光， 根据红绿荧光。

17、的转变检测线粒体膜电位。 Mito-Tracker Red CMXRos中含有的弱巯基反应性的氯甲基官能团能够特异性地标记细胞中有生物活性 的线粒体， 检测线粒体膜电位。 对于正常细胞， Mito-Tracker Red CMXRos可以把其中的线 粒体染色为明亮的红色荧光， 而当线粒体膜电位下降时， 线粒体的红色荧光会逐渐减弱。 0026 本发明具有以下优点： 1、 通过全合成Annullatins系列天然物， 解决其原料来源和 在化学结构上的问题。 2、 提供了Annullatins的新用途， 即用于糖尿病血管并发症的治疗。 发现Annullatins通过保护线粒体功能、 维持线粒体膜电位。

18、、 减轻细胞的氧化应激状态、 减 少细胞凋亡， 从而有效改善高糖诱导的血管内皮细胞损伤， 本发明为糖尿病血管并发症的 防治提供新的思路和理论基础。 附图说明 0027 图1为本发明Annullatin对HUVEC细胞活力的影响柱状图； 0028 图2为本发明Annullatin对细胞凋亡的影响图， NG(正常组)、 HG(33mM葡萄糖)、 HG+ Annullatin(33mM葡萄糖+给药组)； 0029 图3为本发明Annullatin对细胞内ROS、 GSH水平的影响柱状图； 0030 图4为本发明Annullatin对线粒体膜电位的影响荧光图， 其中图A： JC-1检测线粒 说明书 3。

19、/9 页 6 CN 111763216 A 6 体膜电位； 图B： Mito-Tracker Red CMXRos检测线粒体膜电位， NG(正常组)、 HG(33mM葡萄 糖)、 HG+Annullatin(33mM葡萄糖+给药组)， 荧光图(200倍)， 图中标尺长度为50 m。 具体实施方式 0031 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0032 实施例1： Annullatins系列天然物的合成步骤和结构表征 0033 (1)化合物2的合成 0034 0035 以产物2a的合成为例， 取新制备的氯铬酸吡啶(PCC)(1.94g， 9mmol)、 硅藻土 (0.96g，。

20、 15.8mmol)和10mL CH2Cl2于100mL反应瓶中， 将溶于适量CH2Cl2的原料1(672mg， 6mmol)， 滴加入反应瓶中。 室温下搅拌反应， 用TLC检测， 待原料消耗完， 开始处理反应。 将反 应瓶中的滤渣用布氏漏斗抽滤， 无水乙醚洗涤。 将滤液在30减压浓缩， 通过硅胶柱层析纯 化得到淡青色液体化合物2a(515mg， 78)， 直接投下一步反应。 0036 (2)化合物3的合成 0037 0038 以产物3a的合成为例， 快速称量NaH(0.21g， 5.2mmol)于100mL干燥的反应瓶中， 加 入无水THF(15mL)， 冰浴降温， 在氩气保护下缓慢滴加1,。

21、3-丙酮二甲酸二甲酯11(0.90g， 5mmol)到反应瓶中， 刚开始会放热并产生大量气体， 等待反应液颜色变为黄绿色且无气体 产生后， 加入原料2a(550mg， 5mmol)到混合反应液中， 冰浴下搅拌3小时之后， TLC监测反应， 待原料消失， 立即停止反应。 减压浓缩除去THF， 将反应瓶中混合物加入1N HCl调PH值， 加乙 酸乙酯萃取2次， 合并有机相， 用饱和NaCl水溶液洗涤， 向有机相中加入无水Na2SO4静置干 燥， 再经过滤， 最后将滤液减压蒸馏浓缩后通过硅胶柱层析分离纯化， 使用石油醚:乙酸乙 酯20:1作为洗脱剂， 得到浅黄色油状化合物3a(732mg， 收率55。

22、)。 0039 化合物3a的1H NMR数据:1H NMR(400MHz,CDCl3): ppm:11.13(s,1H),7.78(d,J 8.2Hz,1H),6.76(d,J8.2Hz,1H),3.94(s,3H),3.94(s,3H),2.62-2.57(m,2H),1.61-1.53 (m,2H),1.40-1,30(m,2H),0.91(t,J7.3Hz,3H). 0040 (3)化合物4的合成 0041 0042 以产物4a的合成为例， 称取原料3a(399mg， 1.5mmol)于100mL反应瓶中， 在通风橱 下滴加BrCH2CO2CH3(345mg， 2.3mmol)， 加入适。

23、量丙酮， 最后在搅拌下加入称量好的K2CO3 (725mg， 5.3mmol)。 在65下进行回流反应3小时后， TLC监测反应， 待原料消耗完， 开始处理 反应。 减压蒸除丙酮， 向反应瓶加入水稀释混合物， 加乙酸乙酯萃取2次， 合并有机相， 用饱 说明书 4/9 页 7 CN 111763216 A 7 和NaCl水溶液洗涤， 向有机相中加入无水Na2SO4静置干燥再经过滤， 最后将滤液减压蒸馏浓 缩后通过硅胶柱层析分离纯化， 使用石油醚:乙酸乙酯5:1作为洗脱剂， 得到无色油状化 合物4a(477mg， 收率94)。 0043 化合物4a的1H NMR和13C NMR数据:1H NMR(。

24、400MHz,CDCl3): ppm:7.73(d,J 8.1Hz,1H),6.96(d,J8.1Hz,1H),4.56(s,2H),3.78(s,3H),3.73(s,3H),3.68(s,3H), 2.49-2.43(m,2H),1.48-1.39(m,2H),1.26-1.16(m,2H),0.77(t,J7.3Hz,3H).13C NMR (400MHz,CDCl3): ppm:168.9,167.5,164.9,155.2,146.7,132.6,130.5,125.5,121.7, 72.2,52.2,52.3,51.9,33.2,32.8,22.4,13.7. 0044 (5)化。

25、合物5的合成 0045 0046 以产物5a的合成为例， 称量CrO3(450mg， 4.5mmol)研磨后加入50ml反应瓶中， 分别 量取Ac2O(2mL)和AcOH(1mL)于反应瓶中。 在冰浴下搅拌10min， 缓慢滴加用AcOH(1mL)稀释 的原料4a(338mg， 1mmol)于反应瓶中。 在0下反应2小时后， TLC监测反应， 待原料消耗完， 开始处理反应。 向反应瓶中加入冰水(10mL)， 用三氯甲烷萃取3次， 合并有机相， 用NaHCO3和 饱和NaCl水溶液洗涤无水Na2SO4干燥， 再经过滤， 最后将滤液减压蒸馏浓缩后通过硅胶柱层 析分离纯化， 使用石油醚:乙酸乙酯2:。

26、1作为洗脱剂， 得到白色固体化合物5a(287mg， 收率 82)。 0047 化合物5a的1H NMR数据:1H NMR(400MHz,CDCl3): ppm:7.99(d,J8.1Hz,1H) , 7.64(d,J8.1Hz,1H),4.74(s,2H),3.92(s,6H),3.83(s,3H),2.94-2.89(m,2H),1.79- 1.70(m,2H),0.99(t,J7.4Hz,3H).13C NMR(400MHz,CDCl3): ppm:199.7,168.9,167.4, 164.8,155.7,140.3,133.1,130.6,128.8,124.5,72.9,53.1。

27、,53.0,52.3,41.8,17.5,13.8. 0048 (6)化合物6的合成 0049 0050 以产物6a的合成为例， 称取原料5a(176mg， 0.5mmol)、 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)(14.6mg， 0.04mmol)、 Ru-1(R， R)(1.59mg， 0.0025mmol)、 甲酸钠(170mg， 2.5mmol)于 50ml两颈瓶中。 在氩气保护下， 量取CH2Cl2(2mL)和H2O(2mL)用注射器加到反应瓶中， 常温下 反应24小时后， TLC监测反应， 待原料消耗完， 开始处理反应。 向反应瓶中加入水稀释混合 物， 有机相用二氯甲烷萃取2次， 合。

28、并有机相， 合并有机相， 用饱和NaCl水溶液洗涤， 向有机 相中加入无水Na2SO4静置干燥， 使用石油醚:乙酸乙酯3:2作为洗脱剂， 得到白色胶状固体 化合物6a(151mg， 收率94)。 0051 化合物6a的1H NMR和13C NMR数据:1H NMR(400MHz,CDCl3): ppm:8.06(d,J 7.9Hz,1H),7.22(d,J7.9Hz,1H),5.46(dd,J18.0Hz,J23.9Hz,1H),5.04(s,2H),3.93 (s,3H),3.79(s,3H),2.07-1.97(m,1H),1.80-1.69(m,1H),1.58-1.41(m,2H),0。

29、.98(t,J 说明书 5/9 页 8 CN 111763216 A 8 7.4Hz,3H) .13C NMR(400MHz,CDCl3): ppm:169.1,167.3,165.8,156.6,156.2,137.5, 126.6,118.5,117.2,80.5,71.6,52.7,52.2,36.7,18.2,13.8. 0052 (7)化合物7的合成 0053 0054 以产物7a的合成为例， 量取5mL高效液相甲醇于50mL反应瓶中， 少量分批加入钠块 (43.2mg， 1.88mmol)。 待钠块完全反应之后， 磁力搅拌下将用CH3OH溶解的原料6a(483mg， 1.5mmol。

30、)， 滴加到反应瓶中。 在65下进行回流反应3小时后， TLC监测反应， 待原料消耗完， 开始处理反应。 减压蒸除CH3OH， 加入适量蒸馏水溶解反应瓶中残余物， 用1N HCl调节溶液 PH2时， 析出大量白色固体。 静置6h之后， 滤纸过滤， 得到白色固体化合物7a(255mg， 收率 88)。 化合物7a的1H NMR和13C NMR数据:1H NMR(400MHz,DMSO): ppm:11.26(s,1H),8.28 (d,J8.2Hz,1H),7.57(d,J8.2Hz,1H),5.76(dd,J18.0Hz,J23.6Hz,1H),3.86(s, 3H),2.14-2.04(m,。

31、1H),1.77-1.66(m,1H),1.48-1.29(m,2H),0.93(t,J7.4Hz,3H).13C NMR(400MHz,DMSO): ppm:166.7,159.4,153.1,147.6,147.1,128.2,128.1,123.1,117.1, 110.5,81.7,51.5,35.9,18.0,13.7. 0055 (8)化合物8的合成 0056 0057 以产物8a的合成为例， 取原料7a(203mg， 0.7mmol)、 二甲基亚砜(DMSO)(3mL)、 H2O (2mL)于50mL反应瓶中， 搅拌下加入LiOH(147mg， 3.5mmol)。 在75下进行回。

32、流反应4小时 后， TLC监测反应， 待原料消耗完， 开始处理反应。 将混合物冷却至室温后， 用饱和NH4Cl水溶 液淬灭。 用三氯甲烷萃取3次， 合并有机相， 用饱和NaCl水溶液洗涤， 向有机相中加入无水 Na2SO4静置干燥， 再经过滤， 最后将滤液减压蒸馏浓缩后通过硅胶柱层析分离纯化， 使用石 油醚:乙酸乙酯3:2作为洗脱剂， 得到浅黄色固体化合物8a(130mg， 收率80)。 0058 化合物8a的1H NMR和13C NMR数据:1H NMR(400MHz,CDCl3): ppm:7.98(d,J 7.9Hz,1H),7.18(d,J7.9Hz,1H),5.58(dd,J18.1。

33、Hz,J23.9Hz,1H),4.85(s,2H),2.13- 2.03(m,1H),1.86-1.75(m,1H),1.65-1.44(m,2H),1.01(t,J7.4Hz,3H). 13C NMR(400MHz, CDCl3): ppm:197.2,170.8,166.9,161.1,130.7,123.0,115.7,112.7,82.1,76.4,36.7, 18.4,14.0. 0059 (9)化合物9的合成 说明书 6/9 页 9 CN 111763216 A 9 0060 0061 以产物9a的合成为例， 称量原料8a(162mg， 0.7mmol)， 碱性氧化铝(714mg，。

34、 7mmol) 于100mL反应瓶中， 加入15mL丙酮， 室温下反应60min之后， TLC监测反应， 待原料基本反应完 时， 开始处理反应。 将反应瓶中混合物用滤纸过滤， 丙酮洗涤， 向有机相滤液用中加入无水 Na2SO4静置干燥， 再次过滤， 最后将滤液减压蒸馏浓缩后通过硅胶柱层析分离纯化， 使用二 氯甲烷/丙酮/甲醇100:1:1作为洗脱剂， 得到浅黄色固体化合物9a(162mg， 收率80)。 0062 化合物9a的1H NMR和13C NMR数据:1H NMR(400MHz,CDCl3): ppm:7.95(d,J 7.9Hz,1H),7.15(d,J7.9Hz,1H),5.55(。

35、dd,J18.5Hz,J24.0Hz,1H),4.61(s,1H),2.82 (s,1H),2.12-2.01(m,1H),1.88-1.74(m,1H),1.67-1.51(m,2H),1.43(s,3H),1.37(s,3H), 1.02(t,J7.3Hz,3H). 13C NMR(400MHz,CDCl3): ppm:198.5,169.8,166.8,161.5,130.9, 123.8,115.7,112.4,91.6,82.1,72.8,36.9,25.4,25.1,18.7,14.0.61.5,130.9,123.8, 115.7,112.4,91.6,82.1,72.8,36.。

36、9,25.4,25.1,18.7,14.0. 0063 (10)化合物10的合成 0064 0065 以产物10a的合成为例， 称取原料9a(203mg， 0.7mmol)、 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)(76.5mg， 0.21mmol)、 Ru-1(R， R)(8.9mg， 0.0014mmol)、 甲酸钠(238mg， 3.5mmol)于 50ml两颈瓶中， 用注射器量取CH2Cl2(2mL)和H2O(2mL)加到反应瓶。 在氩气保护下， 量取 CH2Cl2(2mL)和H2O(2mL)用注射器加到反应瓶中， 常温下反应12小时后， TLC监测反应， 待原 料消耗完， 开始处理反应。。

37、 向反应瓶中加入水稀释混合物， 有机相用二氯甲烷萃取2次， 合并 有机相， 用饱和NaCl水溶液洗涤， 向有机相中加入无水Na2SO4静置干燥再经过滤， 最后将滤 液减压蒸馏浓缩后通过硅胶柱层析分离纯化， 使用石油醚:乙酸乙酯3:2作为洗脱剂， 得 到无色晶体化合物10a(163mg， 收率80)。 0066 化合物10a的1H NMR和13C NMR数据:1H NMR(400MHz,MeOD): ppm:7.71(d,J 7.6Hz,1H),7.07(d,J7.6Hz,1H),5.56(dd,J17.9Hz,J23.8Hz,1H),5.39(d,J6.2Hz, 1H),4.48(d,J6.3。

38、Hz,1H),2.11-2.01(m,1H),1.78-1.64(m,1H),1.52(s,3H),1.50(s, 3H),1.49-1.28(m,2H),0.99(t,J7.4Hz,3H). 13C NMR(400MHz,MeOD): ppm:170.7,158.9, 154.9,133.7,133.6,115.4,110.2,94.2,83.6,73.4,72.0,38.2,27.1,26.6,19.4,14.4. 0067 实施例2： Annullatins在治疗糖尿病血管并发症中的应用 0068 (1)实验细胞： 实验采用人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)。 0069 (2)主要实验试。

39、剂与仪器： Annullatins(本发明化合物)， 葡萄糖溶液(Sigma公 司)， CCK8(Med Chem Express公司)， 细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公 说明书 7/9 页 10 CN 111763216 A 10 司)， GSH/ROS检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)， JC-1/Mito Tracker red(碧云天生 物技术有限公司)， 酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)， 荧光显微镜(日本尼康公司)。 0070 (3)高糖诱导的HUVEC损伤模型的建立： 选取对数生长期的第3-4代HUVEC铺板， 待 细胞贴壁后， 换无血清培养液处理12h， 然后。

40、按以下分组处理细胞： 正常组(5.5mM葡萄糖)、 高糖组(33mM葡萄糖)、 药物组(33mM葡萄糖+Annullatin)， 继续培养48h后测定各项指标。 0071 (4)检测指标和检测方法 0072 1)CCK8检测细胞活力： 按以上各组处理方法继续培养48h后， 每孔加入10 l的 CCK8， 继续培养4h。 然后用酶标仪测定450nm的吸光度值(OD值)， 计算细胞存活率。 0073 2)流式细胞术检测细胞凋亡： 收集细胞， 用不含EDTA的胰蛋白酶消化， 用PBS缓冲 液重悬洗涤， 1000rmp， 离心5min， 离心弃上清， 依次加入适量Binding Buffer、 Ann。

41、exin- FITC、 和Propidium Iodide试剂， 室温避光反应10min后， 在流式细胞仪上进行检测。 0074 3)细胞内ROS和GSH水平检测： 根据活性氧检测试剂盒说明书检测细胞内ROS水平。 收集细胞后， 取部分单细胞悬液经过超声破碎处理后， 测定蛋白浓度， 同时取一部分单细胞 悬液加入DCFH-DA(10 mol/L)工作液， 在37避光孵育30min， 检测各组细胞的ROS水平， 结 果计算表示为荧光度值/毫克蛋白； 根据谷胱甘肽试剂盒说明书检测细胞内GSH水平。 收集 细胞后， 加入适量PBS溶液重悬各组HUVEC细胞， 超声破碎仪破碎细胞， 用BCA法蛋白定量试。

42、 剂盒检测样品中蛋白含量。 离心取上清200 l， 酶标仪测定420nm各组吸光度值。 0075 4)线粒体膜电位检测： JC-1检测线粒体膜电位， 按以上分组处理48h后， 吸除培养 液， PBS洗涤2次， 加入1ml细胞培养液， 然后再加入1ml JC-1染色工作液， 充分混匀， 37孵 育20分钟。 最后用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次， 加入2ml细胞培养液， 于荧光显微镜下观 察。 红色荧光显示JC-1聚集在线粒体的基质中， 线粒体膜电位较高， 绿色荧光显示线粒体膜 去极化后膜电位下降， 通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化； Mito-Tracker Red CMXRos。

43、检测线粒体膜电位， 用无水DMSO溶解Mito-Tracker Red CMXRos粉末， 得到储备 液。 加入一定量的PBS充分混匀， 配制Mito-Tracker Red CMXRos工作液。 把配制好的工作液 加入去除细胞培养液6孔板中， 避光37孵育20分钟。 最后去除工作液， 加入37预温的新 鲜培养液， 立即于荧光显微镜下观察。 0076 (5)统计学处理 0077 实验结果以均数标准差来表示， 组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)， 若方差齐用t检验， 且在P0.05时认为差异具有统计学意义。 0078 (6)检测结果 0079 1)CCK8检测细胞活力： CC。

44、K8实验表明， 与正常组相比， 高糖组HUVEC细胞活力降低； 与高糖组相比， Annullatin组细胞活力提高。 结果如图1所示。 正常组(control)、 高糖组 (33mM葡萄糖)、 给药组(100 M Annullatin/200 M Annullatin)。 与正常组相比， *P0.05； 与高糖组相比， #P0.05。 0080 2)流式细胞术检测细胞凋亡： 流式细胞仪进一步检测发现， 在高糖条件下培养的 HUVEC细胞凋亡率高于正常培养的HUVEC细胞凋亡率， 与高糖组相比， 在细胞培养基中加入 Annullatin可减弱高糖诱导的HUVEC凋亡。 结果如图2所示。 0081。

45、 3)细胞内ROS和GSH水平检测： 通过细胞内GSH和ROS检测数据表明Annullatin可以 缓解高糖引起的HUVEC细胞内氧化应激水平的升高， 高糖组ROS水平较正常组显著升高， 与 说明书 8/9 页 11 CN 111763216 A 11 高糖组相比， 药物组ROS水平明显降低； 与正常组相比， 高糖组GSH含量明显下降， 与高糖组 相比， 药物组GSH含量明显升高。 结果如图3所示。 0082 正常组(control)、 高糖组(33mM葡萄糖)、 给药组(100 M Annullatin/200 M Annullatin)。 与正常组相比， *P0.05； 与高糖组相比，#P。

46、0.05。 0083 4)线粒体膜电位检测： 通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变、 Mito-Tracker Red CMXRos的荧光强度可以检测线粒体膜电位的变化， 与正常组相比， 高糖能够降低HUVEC 中线粒体的膜电位， 与高糖组相比， Annullatin处理能够恢复HUVEC中线粒体的膜电位。 结 果如图4所示。 0084 综上所述， 长期的高血糖导致血管内皮细胞损伤及功能紊乱使患心血管疾病的风 险加倍。 因此， 保护血管内皮细胞免受高糖诱导的损伤在治疗糖尿病血管并发症中起重要 作用。 本发明通过全合成Annullatins系列天然物， 解决其原料来源和在化学结构上的问 题， 。

47、并探讨这类化合物对高血糖诱导的内皮细胞损伤的影响， 得出Annullatins是通过保护 线粒体功能、 维持线粒体膜电位、 减轻细胞的氧化应激状态、 减少细胞凋亡， 从而有效改善 高糖诱导的血管内皮细胞损伤， 为糖尿病血管并发症的防治提供新的思路和理论基础。 0085 虽然， 上文中已经用一般性说明、 具体实施方式及试验， 对本发明作了详尽的描 述， 但在本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见 的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的 范围。 说明书 9/9 页 12 CN 111763216 A 12 图1 图2 说明书附图 1/2 页 13 CN 111763216 A 13 图3 图4 说明书附图 2/2 页 14 CN 111763216 A 14 。