新型冠状病毒及其培养方法以及新型冠状病毒灭活疫苗.pdf

《新型冠状病毒及其培养方法以及新型冠状病毒灭活疫苗.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新型冠状病毒及其培养方法以及新型冠状病毒灭活疫苗.pdf（17页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010864354.6 (22)申请日 2020.08.25 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:V202039 2020.07.28 (71)申请人 广东省疾病预防控制中心 地址 511400 广东省广州市番禺区大石镇 群贤路160号 申请人 广东省公共卫生研究院 华兰生物疫苗股份有限公司 (72)发明人 袁润余柯昌文周平平柯碧霞 安文琪马小伟张海燕黎薇 武婕 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 林青中 (51)Int.Cl.。

2、 C12N 7/00(2006.01) C12N 7/06(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 新型冠状病毒及其培养方法， 以及新型冠状 病毒灭活疫苗 (57)摘要 本发明涉及疫苗领域， 具体而言， 涉及新型 冠状病毒及其培养方法， 以及新型冠状病毒灭活 疫苗。 该新型冠状病毒， 其于2020年7月28日保藏 于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCC NO:V202039， 毒株名称为2019nCoV/KT13。 本发 明提供了一种新型冠状病毒的毒株， 该毒株的培。

3、 养效价高、 增值快， 并且传代稳定性好， 即便传代 18代以上毒株的抗原决定蔟(RBD)区域序列依然 无明显变化， 因而可适于病毒的大规模培养， 并 适合用作疫苗株进行使用。 本发明还确定了该毒 株的最佳灭活条件， 并首次获得新型冠状病毒灭 活疫苗。 权利要求书1页 说明书7页 附图8页 CN 111763659 A 2020.10.13 CN 111763659 A 1.新型冠状病毒， 其于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCC NO:V202039， 毒株名称为2019-nCoV/K-T13。 2.权利要求1所述新型冠状病毒的培养方法， 包括将所述新。

4、型冠状病毒接种于细胞中， 于合适的培养条件下进行培养， 并收获如此培养得到的病毒。 3.根据权利要求2所述的培养方法， 所述细胞为Vero细胞。 4.根据权利要求3所述的培养方法， 所述Vero细胞的浓度为(1.03.0)105个/mL， 所 述新型冠状病毒以0.0050.015MOI接种于所述Vero细胞中； 所述细胞所用的培养液为MEM营养液； 在培养的第24天收获病毒。 5.权利要求1所述的新型冠状病毒的灭活方法， 包括： 将所述新型冠状病毒与 -丙内酯按照1:(30005000)的比例共孵育6小时以上。 6.根据权利要求5所述的灭活方法， 所述共孵育的温度为28。 7.权利要求5或6所。

5、述的灭活方法制备得到的灭活病毒。 8.新型冠状病毒灭活疫苗， 其包含权利要求7所述的灭活病毒。 9.根据权利要求8所述的疫苗， 其还包括可以药用的载体、 稀释剂以及免疫佐剂中的至 少一种。 10.成套试剂盒， 其包含权利要求8或9所述的疫苗， 以及用于接种所述疫苗的容器。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111763659 A 2 新型冠状病毒及其培养方法， 以及新型冠状病毒灭活疫苗 技术领域 0001 本发明涉及疫苗领域， 具体而言， 涉及新型冠状病毒及其培养方法， 以及新型冠状 病毒灭活疫苗。 背景技术 0002 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2， 或译为严重急性呼吸综合征冠状病毒2、 。

6、严 重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2)是一种具有包膜的正链单股RNA病毒， 属于冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急 性呼吸道综合征相关冠状病毒种。 它的基因序列和SARS病毒及MERS病毒属于同一谱系但不 同进化枝， 是已知的第七种可感染人类的冠状病毒。 病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物， 它造成了于2019年底暴发的2019冠状病毒病(COVID-19)。 SARS-CoV-2病毒可通过人类上呼 吸道入侵人体， 以多种细胞表面表达的ACE2为受体达到感染， 主要感染器官包括肺部、 。

7、心 脏、 肾脏等多个主要器官。 0003 疫苗作为预防新冠病毒感染的手段之一， 是目前全球都在攻克的难题。 灭活疫苗 具有安全性和免疫原性好等特点， 是新冠病毒预防的重要手段。 新型冠状病毒作为一种新 发传染病， 目前尚未有可供人使用的新型冠状病毒灭活疫苗上市生产。 发明内容 0004 为了实现本发明的上述目的， 特采用以下技术方案： 0005 本发明涉及一种新型冠状病毒， 其于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏 中心， 保藏编号为： CCTCC NO:V202039， 毒株名称为2019-nCoV/K-T13。 0006 根据本发明的一方面， 还涉及如上所述新型冠状病毒的培养方法，。

8、 包括将所述新 型冠状病毒接种于细胞中， 于合适的培养条件下进行培养， 并收获如此培养得到的病毒。 0007 本发明还涉及如上所述的新型冠状病毒的灭活方法， 包括： 0008 将所述新型冠状病毒与 -丙内酯按照1:(30005000)的比例共孵育6小时以上。 0009 本发明还涉及一种新型冠状病毒灭活疫苗， 其包含如上所述的灭活病毒。 0010 本发明还涉及一种成套试剂盒， 其包含如上所述的疫苗， 以及用于接种所述疫苗 的容器。 0011 本发明的有益效果为： 0012 (1)本发明提供了一种新型冠状病毒的毒株， 该毒株的培养效价高、 增值快， 并且 传代稳定性好， 即便传代18代以上毒株的抗。

9、原决定蔟(RBD)区域序列依然无明显变化， 因而 可适于病毒的大规模培养， 并适合用作疫苗株进行使用。 0013 (2)通过摸索， 确定了该毒株的最佳灭活条件， 并首次获得新型冠状病毒灭活疫 苗。 说明书 1/7 页 3 CN 111763659 A 3 附图说明 0014 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案， 下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前 提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。 0015 图1为本发明一个实施例中10。

10、倍显微镜下新冠病毒感染Vero细胞的病变图； 0016 图2为本发明一个实施例中10倍显微镜下Vero细胞的阴性对照图； 0017 图3为本发明一个实施例中新冠病毒K-T13疫苗株的电镜图； 0018 图4A和图4B为本发明一个实施例中连续传代的K-T13疫苗株的抗原决定蔟(RBD) 区域序列的序列比对图； 0019 图5为本发明一个实施例中连续传代的K-T13疫苗株的进化树； 0020 图6为本发明一个实施例中新冠病毒的生长曲线图； 0021 图7为本发明一个实施例中新冠病毒的生长曲线图； 0022 图8为本发明一个实施例中图10倍显微镜下的灭活后的细胞图； 0023 图9为本发明一个实施例。

11、中10倍显微镜下的病毒对照细胞图； 0024 图10为本发明一个实施例中10倍显微镜下的阴性对照细胞图； 0025 图11为本发明一个实施例中灭活的新冠病毒K-T13疫苗株电镜图。 0026 本申请提供的新型冠状病毒， 毒株名为2019-nCoV/K-T13， 保藏于中国典型培养物 保藏中心， 地址为中国武汉的武汉大学， 保存编号CCTCC NO:V202039， 该毒株于2020年7月 28日由保藏中心收到并登记入册； 经保藏中心于2020年8月3日检测为存活毒株。 具体实施方式 0027 现将详细地提供本发明实施方式的参考， 其一个或多个实例描述于下文。 提供每 一实例作为解释而非限制本发。

12、明。 实际上， 对本领域技术人员而言， 显而易见的是， 可以对 本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。 例如， 作为一个实施方式的部 分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中， 来产生更进一步的实施方式。 0028 因此， 旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变 化。 本发明的其它对象、 特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。 本领域普 通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述， 而非意在限制本发明更广阔的方 面。 0029 本发明涉及一种新型冠状病毒， 其于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏 中心， 保藏编号为： CCTC。

13、C NO:V202039， 毒株名称为2019-nCoV/K-T13。 0030 该毒株的培养效价高、 增值快， 并且传代稳定性好， 即便传代18代以上毒株的抗原 决定蔟(RBD)区域序列依然无明显变化， 因而可适于病毒的大规模培养， 并适合用作疫苗株 进行使用。 0031 本发明请求保护上述保藏编号的新型冠状病毒毒株， 以及在适度范围内发生突变 或改造的变体毒株。 0032 所谓 “变体毒株” ， 可由现有技术的病毒经公知的基因编辑技术将保藏编号为 CCTCC NO:V202039经适度改造或适度突变， 或将保藏编号为CCTCC NO:V202039所示的病毒 说明书 2/7 页 4 CN 。

14、111763659 A 4 与其它病毒进行融合而得到的实质上相同的毒株。 0033 在本发明中， 表述 “实质上相同的毒株” 可以通过基因组方面高度类似涵盖： 0034 一种病毒毒株的基因组同2019-nCoV/K-T13毒株的基因组相比， 包含至多150个突 变事件， 优选包含至多140个、 130个、 120个、 110个、 100个、 90个、 80个、 70个、 60个、 50个、 40 个、 30个或20个突变事件。 突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、 缺失， 及 两者的组合)。 按如下方式确定突变事件的数量： 将2019-nCoV/K-T13毒株的基因组视。

15、为对 照， 鉴定存在于突变株基因组中的突变事件， 每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事 件(即， 例如， 插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。 在该语境中， 本发明的突 变株的基因组序列由同2019-nCoV/K-T13毒株相比所含突变事件的数量限定， 除这种限定 方式外， 还可额外由其与2019-nCoV/K-T13毒株的基因组序列的同一性百分比限定， 其中同 一性百分比在本文表示在一种毒株的基因组中发现存在于另一种毒株的基因组中的序列 的百分比， 具体地讲： a)在2019-nCoV/K-T13毒株的基因组中发现并存在于突变毒株的基因 组中的序列的百分比， 或b)在突。

16、变毒株的基因组序列中发现并存在于2019-nCoV/K-T13毒 株的基因组中的序列的百分比。 因此， 与2019-nCoV/K-T13毒株的不同之处只有插入(一个 或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变毒株， 具有的基因组与2019-nCoV/K-T13毒株的基 因组的同一性百分比为100， 因为在一种毒株的基因组中完全发现了另一种毒株的整个 基因组序列。 在一个具体实施例中， 由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列， 与2019-nCoV/K-T13的基因组序列的同一性百分比为至少90、 为至少91、 为至少92、 为至少93、 为至少94、 为至少95、 为至少96、 为至少97。

17、、 为至少98、 为至少99、 为至少99.1、 为至少99.2、 为至少99.3、 为至少99.4、 为至少99.5、 为至少 99.6、 为至少99.7、 为至少99.8、 为至少99.9、 为至少99.92、 为至少99.94、 为 至少99.96、 为至少99.98或为至少99.99， 其中同一性百分比表示在一种毒株的基因 组中发现并存在于另一种毒株的基因组中的序列的百分比； 同一性是按照将两种基因组序 列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的， 并且可使用基于Needleman- Wunsch算法的任一种程序来计算。 0035 本发明还涉及如上所述新型冠状病毒的培养方法。

18、， 包括将所述新型冠状病毒接种 于细胞中， 于合适的培养条件下进行培养， 并收获如此培养得到的病毒。 0036 在一些实施方式中， 所述细胞为禽类和哺乳动物的细胞， 包括它们的卵(蛋)或胚 胎细胞等。 0037 禽类例如野生或经过驯化的鸡、 鸭、 鹅、 天鹅、 大雁、 鸽子、 鹌鹑。 0038 哺乳动物例如人、 猴、 猪、 马、 猫、 犬、 海豹、 鲸鱼等。 0039 在一些实施方式中， 人的细胞选自CHO细胞， COS细胞， NSO细胞， HeLa细胞， BHK细 胞， HEK 293细胞。 0040 在一些实施方式中， 犬的细胞选自MDCK细胞。 0041 在一些实施方式中， 猴的细胞选自。

19、Vero细胞。 0042 在一些实施方式中， 所述Vero细胞的浓度为(1.03.0)105个/mL， 所述新型冠 状病毒以0.0050.015MOI(还可以选择0.008、 0.01、 0.012)接种于所述Vero细胞中。 0043 在一些实施方式中， 所述细胞所用的培养液为MEM营养液。 0044 在一些实施方式中， 在培养的第24天收获病毒， 也可以选择3天。 说明书 3/7 页 5 CN 111763659 A 5 0045 本发明还涉及如上所述的新型冠状病毒的灭活方法， 包括： 0046 将所述新型冠状病毒与 -丙内酯按照1:(30005000)的比例共孵育6小时以上。 0047 。

20、所述方法灭活病毒操作方便， 且灭活完全， 所得疫苗具有很好的安全性。 0048 在一些实施方式中， 所述新型冠状病毒与 -丙内酯按照1:(35004500)的比例共 孵育。 0049 在一些实施方式中， 所述新型冠状病毒与 -丙内酯按照1:(37004300)的比例共 孵育。 0050 在一些实施方式中， 所述新型冠状病毒与 -丙内酯按照1:4000的比例共孵育。 0051 在一些实施方式中， 所述共孵育的温度为28； 也可以选择4或6。 0052 本发明还涉及如上所述的灭活方法制备得到的灭活病毒。 0053 本发明还涉及一种新型冠状病毒灭活疫苗， 其包含如上所述的灭活病毒。 0054 在一些。

21、实施方式中， 所述灭活病毒以液体的或干燥的形式保存于所述疫苗中。 0055 在一些实施方式中， 所述新型冠状病毒是冷冻的。 0056 在一些实施方式中， 其还包括可以药用的载体、 稀释剂以及免疫佐剂中的至少一 种。 0057 适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对所述重组流感病毒中B细胞表位的抗体 反应的佐剂， 以及可增强细胞介导的针对所述重组流感病毒中T细胞表位的反应的佐剂。 这 些佐剂是本领域所熟知的。 0058 在一些实施方式中， 所述佐剂选自角鲨烯、 胞壁酰二肽、 MF59、 AS03、 单磷脂酰脂质 A， 鞭毛蛋白、 CpG-ODN、 Poly(I： C)， 以及铝或钙盐的小分子中的一。

22、种或多种。 可与本发明所 述重组流感病毒一起应用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如， 氢氧化物或磷酸盐)。 尤其适 用于本发明的优选佐剂是氢氧化铝凝胶， 诸如AlhydrogelTM。 对氢氧化铝凝胶而言， 是将所 述嵌合体蛋白与该佐剂混合， 使每一剂量含有大约50到大约800微克铝， 优选含有大约400 到大约600微克铝。 另一种尤其优选的佐剂是可获得自SuperfosBiosector， Denmark的商标 为Adju-PhosTM的磷酸铝。 初期的磷酸铝颗粒具有板状形态， 直径为大约50到大约100nm， 产 物中的最终颗粒尺寸为大约0.5到大约10m。 磷酸钙毫微粒(CAP)是由Bio。

23、sante， Inc (Lincolnshire， IL)研制的一种佐剂。 0059 在一些实施方式中， 所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。 0060 在一些实施方式中， 所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。 0061 本发明还涉及一种成套试剂盒， 其包含如上所述的疫苗， 以及用于接种所述疫苗 的容器。 0062 典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种， 但本发明还考虑了口腔和皮下 (SC)、 肌内(IM)、 静脉内(IV)、 腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。 0063 上述疫苗是以与剂量配方相容的方式， 以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的 用量被施用的。 施用量取决于接受治疗。

24、的对象、 该对象的免疫系统合成抗体的能力， 以及预 期的保护程度。 需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断， 个体不同， 用量也不同。 最初施用和加强接种的合适方案也可变化， 但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周 或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。 0064 本发明进一步提供了保护动物免于SARS-CoV-2感染的方法， 其包括给所述动物施 说明书 4/7 页 6 CN 111763659 A 6 用有效量的根据本发明的疫苗。 0065 在一些实施方式中， 所述动物为人。 0066 有效量定义为在它被施用的个体中将诱导免疫应答的所述疫苗的量， 导致在个体 中针对所述疫苗的分泌、。

25、 细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。 针对疫苗的所述分泌、 细 胞和/或抗体介导的免疫应答针对用强毒流感病毒株的攻击也是有效的。 0067 所述有效量优选经口或口鼻或肌内施用。 0068 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。 0069 实施例1 K-T13毒株的分离、 培养与鉴定 0070 一、 样品处理 0071 本发明请求保护的K-T13毒株分离自新冠病毒感染者的样本。 0072 在生物安全三级实验室中， 对标本进行相应的处理： 0073 将送检的新冠病毒感染者痰标本加入适量的MEM于痰瓶中， 漩涡振荡器振荡23 分钟， 使痰液充分匀化， 室温放置。 如未加抗生素者， 直接加。

26、入双抗至终浓度为1000U/mL， 转 移入冻存管中。 0074 二、 实验溶液的配置 0075 0076 备注： 如果MEM培养基中含有谷氨酰胺， 可不再添加； 如果MEM培养基中不含有谷氨 酰胺， 需加入1(V/V)浓度为200mM谷氨酰胺溶液。 0077 三、 病毒分离 0078 1.新型冠状病毒分离： 0079 将形态良好、 长成80-95单层细胞(经显微镜检查)的Vero培养管， 倒掉培养液， 每管接种200uL待检标本， 每份标本接种2管， 置37培养箱培养， 同时设正常细胞对照； 0080 2.细胞病变观察 0081 从本发明所保藏的K-T13接种样本的次日起逐日在倒置显微镜下观。

27、察细胞形态变 化， 细胞多从边缘出现病变(CPE)， 细胞出现不规则形态， 细胞间颗粒增多， 病变细胞圆缩、 脱落(图1)， 而正常对照细胞形态良好(图2)， 此时将培养细胞置于-80冻存待鉴定。 同时 将分离的病毒进行电镜观察(图3)。 0082 四、 鉴定及序列测定 0083 新型冠状病毒等冠状病毒主要采用荧光定量PCR、 RT-PCR、 rRT-PCR或间接免疫荧 光方法检测鉴定， 目前常用荧光定量PCR的方法进行快速鉴定。 0084 新型冠状病毒等冠状病毒细胞分离物， 选择有细胞病变的细胞分离物， 从病毒分 离物中提取核酸(核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系参考相关厂家试剂盒说明)。

28、， 用新型 冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(ORF1a/b)和核壳蛋白(nucleocapsidprotein， N)作为 鉴定基因。 在实验室要确认病毒培养物为阳性， 需满足新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、 N)特 说明书 5/7 页 7 CN 111763659 A 7 异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。 0085 将本发明所保藏的K-T13毒株连续传代， 每一代都进行鉴定和2代测序。 分析结果 如图4A和图4B所示， 即便传代18次以上， 连续传代的疫苗株的抗原决定蔟(RBD)区域序列依 然无变化。 从序列进化来看， 随着疫苗株代次的增加， 高代次的毒株序列主要位于进化树。

29、右 侧且进化树无明显的稳定节点分支(图5)。 0086 五、 病毒株效价滴定 0087 1.细胞的制备： 0088 Vero细胞悬液的制备： 将细胞吹打均匀后， 取样计数， 将细胞稀释成10-15104/ mL。 0089 2.病毒稀释 0090 从K-T13病毒原液作10倍系列稀释至10-8， 稀释时， 每个稀释度要换吸管， 吸管尖部 的0.1mL不用， 或用300 L吸头稀释， 每个稀释度亦要换吸头。 0091 3.病毒接种 0092 每个试验孔接种0.1mL细胞悬液， 然后按上述稀释度以同法接种病毒， 每孔0.1mL， 摇匀后置CO2培养箱内培养。 4天初步观察CPE， 7天以+、 判定。

30、结果， 按Reed-Muench的方法 计算TCID50。 发明人分离的新型冠状病毒有多株， 以K16和4276作为示例比较例。 0093 选取的候选毒株结果如图6所示， K16、 K-T13和4276三个不同的新冠毒株在增殖的 第34天滴度最高， 是最适合新冠病毒收获的时间。 同时， 从图上所示， KT13毒株的增殖的 滴度稳定性较好， K16和4276毒株在增殖的第三天以后滴度越来越低。 因此， 本申请选择K- T13进行噬斑纯化。 0094 六、 噬斑纯化 0095 (1)挑选生长状态好的Vero细胞， 消化后制备成均匀的细胞悬液接种于6孔板中， 培养至基本单层待用。 0096 (2)对。

31、要进行蚀斑纯化的病毒进行10倍递增系列稀释。 0097 (3)将6孔板中的细胞生长液弃去， 把系列稀释后的样品接种于相应孔中， 440 L/ 孔。 同时每块板设定细胞对照孔； 将加样后的细胞板标记后于37、 5CO2培养箱中吸附60 分钟， 间隔20分钟摇板一次。 0098 (4)按照每孔4ml的量计算最终覆盖层所用液体量。 0099 (5)待病毒吸附60分钟后向6孔板中加覆盖液， 待基本凝固后于37、 35CO2培 养箱进行培养。 0100 7.病毒株效价滴定 0101 具体操作同五， 如图7中所示， 毒株经过两次噬斑纯化后， 滴度明显的比纯化前提 高了100倍。 0102 将经过噬斑纯化后。

32、的毒株进行保藏。 0103 实施例2新冠病毒灭活 0104 (1)病毒收获液(收获时为37)， 加灭活剂前先平衡至2-8； 0105 (2) -丙内酯(保存在-20)， 使用时放在冰上确保温度在2-8以下， 使用后迅速 放回-20； 0106 (3)灭活剂 -丙内酯按照不同比例加入病毒收获液(2-8)中， 摇晃均匀后， 用无 说明书 6/7 页 8 CN 111763659 A 8 菌移液管转移至新的储液瓶中； 0107 (4)设立阴性对照， 按照不同比例将灭活剂( -丙内酯)加入细胞维持液中， 摇晃均 匀后， 用无菌移液管转移至新的储液管中； 0108 (5)将加灭活剂后的样品置于2-8进行。

33、灭活， 间隔一定时间摇晃一次， 刚开始时 频次高些； 0109 (6)灭活适当的时间后， 进行37水浴作用2小时； 0110 (7)进行灭活验证， 注意调节灭活病毒收获液的pH值达7.2。 0111 将灭活后病毒液接种于Vero细胞， 培养器皿为斜面管， 置37培养7天， 观察细胞 病变情况， 同时设定病毒阳性对照和细胞对照。 如图811所示， 病毒对照应出现细胞病变， 细胞对照与完全灭活的病毒液应不出现细胞病变。 0112 从下表中可以看出， 使用1:4000灭活剂( -丙内酯)灭活6小时以上可以将新冠病 毒完全灭活。 0113 新冠病毒灭活效果观察 0114 0115 从图11可见， 灭活。

34、后的新冠病毒结构完整。 0116 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合， 为使描述简洁， 未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述， 然而， 只要这些技术特征的组合不存 在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。 0117 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护 范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 7/7 页 9 CN 1117636。

35、59 A 9 图1 图2 说明书附图 1/8 页 10 CN 111763659 A 10 图3 说明书附图 2/8 页 11 CN 111763659 A 11 图4A 说明书附图 3/8 页 12 CN 111763659 A 12 图4B 说明书附图 4/8 页 13 CN 111763659 A 13 图5 说明书附图 5/8 页 14 CN 111763659 A 14 图6 图7 说明书附图 6/8 页 15 CN 111763659 A 15 图8 图9 说明书附图 7/8 页 16 CN 111763659 A 16 图10 图11 说明书附图 8/8 页 17 CN 111763659 A 17 。