基于血小板膜碎片的仿生纳米制剂及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010872640.7 (22)申请日 2020.08.26 (71)申请人 山东大学 地址 250012 山东省济南市历下区文化西 路44号 (72)发明人 栾玉霞李倩 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 宋海海 (51)Int.Cl. A61K 45/06(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 31/52(2006.01) A61K 31/704(2006.01) 。

2、A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种基于血小板膜碎片的仿生纳米制剂及 其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供一种基于血小板膜碎片的仿生 纳米制剂及其制备方法和应用， 属于医药技术领 域。 本发明通过细胞周期蛋白依赖性激酶5 (Cdk5)抑制剂和化疗药物联合用药， 一方面， 通 过化疗杀伤肿瘤细胞， 活化免疫系统从而恢复 IFN含量， 减轻术后应激带来的免疫抑制， 另 一方面， 通过Cdk5抑制剂下调PDL1， 缓解IFN 相关的免疫耐药， 二者结合， 改变IFN的两面 性， 将其下游的免疫抑制作用解除， 使其正向作 用得以发挥； 同时利用血小板的生物趋向特性解 决。

3、手术后靶向给药难题， 且通过改进制备方法， 使得基于血小板膜碎片的仿生纳米粒制备方法 简单， 且载药效率高， 因此具有良好的实际应用 之价值。 权利要求书2页 说明书8页 附图3页 CN 111789958 A 2020.10.20 CN 111789958 A 1.Cdk5抑制剂联合化疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用。 2.如权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述Cdk5抑制剂选自siRNA、 shRNA、 抗体、 小分 子化合物和肽段； 优选的， 所述CDK5抑制剂选自： Roscovitine， 奥罗莫星及其衍生物， Dinaciclib(MK- 7965， SCH727965)， AT。

4、7519， CIP， p5和Cpd1； 更优选的， 所述CDK5抑制剂为Roscovitine； 所述化疗药物包括烷化剂、 植物生物碱类、 抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、 铂类药物、 抗代 谢类药物； 优选的， 所述化疗药物选自： 多柔比星、 磷酰胺、 米托蒽醌、 甲氨蝶呤、 长春新碱、 长春地 辛、 依托泊苷、 替尼泊苷、 地塞米松、 顺铂、 卡铂、 奥沙利铂、 紫杉醇、 多西他赛和吉西他滨； 更优选的， 所述化疗药物为多柔比星； 当所述Cdk5抑制剂为Roscovitine， 所述化疗药物为多柔比星时， 二者质量比为13： 1； 优选为1： 1。 3.如权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述抗。

5、肿瘤药物至少具有如下任一种或多种用 途： 1)缓解术后应激带来的免疫抑制； 2)缓解适应性免疫耐药； 3)提高抗肿瘤效力； 其中， 用途1)和2)均与IFN-相关。 4.一种仿生纳米制剂， 其特征在于， 所述仿生纳米制剂的药物活性成分包含Cdk5抑制 剂和化疗药物。 5.如权利要求4所述的仿生纳米制剂， 其特征在于， 所述仿生纳米制剂的剂型为纳米 粒； 更进一步为基于血小板膜碎片的仿生纳米粒； 血小板膜碎片尺寸为1040nm； 具体的， 所述仿生纳米制剂由Cdk5抑制剂、 化疗药物和血小板膜碎片制成； 其中， 所述Cdk5抑制剂为Roscovitine， 所述化疗药物为多柔比星， 二者质量比为。

6、13： 1； 优选为1： 1。 6.权利要求4或5所述仿生纳米制剂的制备方法， 包括： 将Cdk5抑制剂和化疗药物分别溶解后混合均匀， 加入含有血小板膜碎片的水溶液中搅 拌处理， 透析后即得。 7.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 溶解选用溶剂为二甲基亚砜， 混合采用 超声处理； 加入采用滴加方式进行； 搅拌处理时间为1040min； 透析处理时间为48h。 8.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 血小板膜碎片由以下方法制备得到： 收集抗凝血后， 采用梯度离心法提取血小板后， 通过反复冻融循环得到血小板膜， 再采 用探头超声的方式进行破碎处理， 从而获得血小板膜碎片。 9.权。

7、利要求4或5所述仿生纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。 10.如权利要求9所述应用， 其特征在于， 所述肿瘤包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤； 所述 权利要求书 1/2 页 2 CN 111789958 A 2 恶性瘤包括实体瘤和血液瘤； 其中， 实体瘤包括黑色素瘤。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111789958 A 3 一种基于血小板膜碎片的仿生纳米制剂及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及一种基于血小板膜碎片的仿生纳米制剂及其 制备方法和应用。 背景技术 0002 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以。

8、任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 0003 手术切除是目前癌症治疗的一线方案， 但是术后难免存在残留的肿瘤细胞， 且部 分细胞会游离进入外周血液循环， 形成循环肿瘤细胞， 从而造成大量患者发生术后复发和 转移。 越来越多的证据表明肿瘤手术应激破坏了宿主免疫系统， 造成了包括Th1型细胞因子 的下降， 尤其是干扰素(IFN-)下调等在内的多种应激应答的发生， 促进了术后肿瘤的 生长。 化疗是肿瘤术后的主要治疗方式， 可以通过活化免疫系统有效提高IFN-的分泌从 而缓解手术造成的应激反应。 0004 但是， IFN-在抗肿瘤免疫应答过程中扮演者双面性的角色， 肿。

9、瘤细胞对干扰素 产生负反馈同样不可忽视。 具体地， IFN-通过与肿瘤细胞表面的干扰素-受体结合， 启动干扰素调节因子1(IRF-1)， 后者通过与程序性死亡配体-1(PD-L1)的转录启动子结合， 上调PD-L1表达， 这种现象称之为适应性免疫耐药。 因此， 消除IFN-的负反馈并使其发挥 积极作用有利于抑制肿瘤复发。 然而， 无论是对术后残留的肿瘤病灶或者循环肿瘤细胞的 药物递送， 均无法有效通过普通的纳米药物递送系统完成。 因为一旦通过手术根除了大多 数肿瘤， 残留的肿瘤组织(0.1g)肯定会太小而无法产生EPR效应。 循环肿瘤细胞由于量微 则更难被捕获。 因此， 如何将药物有效递送至靶。

10、部位是手术后给药亟需解决的难题。 发明内容 0005 为了克服上述技术问题， 本发明提供一种基于血小板膜碎片的仿生纳米制剂及其 制备方法和应用。 本发明通过细胞周期蛋白依赖性激酶5(Cdk5)抑制剂和化疗药物联合用 药， 一方面， 通过化疗杀伤肿瘤细胞， 活化免疫系统从而恢复IFN-含量， 减轻术后应激带 来的免疫抑制， 另一方面， 通过Cdk5抑制剂下调PD-L1， 缓解IFN-相关的免疫耐药， 二者结 合， 改变IFN-的两面性， 将其下游的免疫抑制作用解除， 使其正向作用得以发挥； 同时利 用血小板的生物趋向特性解决手术后靶向给药难题， 且通过改进制备方法， 使得基于血小 板膜碎片的仿生。

11、纳米粒制备方法简单， 且载药效率高， 因此具有良好的实际应用之价值。 0006 为实现上述技术目的， 本发明采用的技术方案如下： 0007 本发明的第一个方面， 提供Cdk5抑制剂联合化疗药物在制备抗肿瘤药物中的应 用。 0008 所述Cdk5抑制剂可以选自siRNA、 shRNA、 抗体、 小分子化合物和肽段； 0009 进一步的， 所述CDK5抑制剂选自： Roscovitine(Rosco)， 奥罗莫星(olomoucine)及 说明书 1/8 页 4 CN 111789958 A 4 其衍生物， Dinaciclib(MK-7965， SCH727965)， AT7519， CIP， 。

12、p5和Cpd1等； 0010 更优选的， 所述CDK5抑制剂为Roscovitine； 0011 所述化疗药物包括但不限于烷化剂、 植物生物碱类、 抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、 铂 类药物、 抗代谢类药物。 0012 更优选的， 所述化疗药物可以选自： 多柔比星(DOX)、 磷酰胺、 米托蒽醌、 甲氨蝶呤、 长春新碱、 长春地辛、 依托泊苷、 替尼泊苷、 地塞米松、 顺铂、 卡铂、 奥沙利铂、 紫杉醇、 多西他 赛和吉西他滨等； 0013 更优选的， 所述化疗药物为多柔比星。 0014 当所述Cdk5抑制剂为Roscovitine， 所述化疗药物为多柔比星时， 二者质量比为1 3： 1； 当多柔比。

13、星与Roscovitine的质量比为1： 1为时， 抗肿瘤效果最佳。 0015 所述抗肿瘤药物至少具有如下任一种或多种用途： 0016 1)缓解术后应激带来的免疫抑制； 0017 2)缓解适应性免疫耐药； 0018 3)提高抗肿瘤效力。 0019 其中， 用途1)和2)均与IFN-相关。 0020 本发明的第二个方面， 提供一种仿生纳米制剂， 所述仿生纳米制剂的药物活性成 分包含上述Cdk5抑制剂和化疗药物。 0021 进一步的， 所述仿生纳米制剂的剂型为纳米粒； 更进一步为基于血小板膜碎片的 仿生纳米粒。 0022 本发明的第三个方面， 提供上述仿生纳米制剂的制备方法， 包括： 0023 将。

14、Cdk5抑制剂和化疗药物分别溶解后混合均匀， 加入含有血小板膜碎片的水溶液 中搅拌处理， 透析后即得。 0024 本发明的第四个方面， 提供上述仿生纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。 0025 上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于： 0026 (1)上述技术方案首次制备了一种纳米尺寸的血小板细胞膜碎片， 该结构具有稳 定剂的功能， 能使得纳米制剂的纳米结构稳定存在； 0027 (2)上述技术方案首次通过 “一步法” 制得仿生纳米制剂， 其结构区别于目前已有 的仿生纳米制剂， 且简化了仿生纳米制剂的制备流程； 0028 (3)上述技术方案制备得到的仿生纳米制剂对肿瘤细胞显示较强的细胞毒性， 。

15、且 对肿瘤细胞的靶向性高， 细胞毒性较低， 为增强体内抗肿瘤选择性提供可能； 0029 (4)上述技术方案仿生纳米制剂利用免疫治疗和化疗联合治疗， 解除了肿瘤手术 切除后的免疫应激， 缓解了适应性免疫耐药， 提高了体内抗肿瘤效果， 因此上述技术方案具 有良好的实际应用之价值。 附图说明 0030 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解， 本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明， 并不构成对本发明的不当限定。 0031 图1为本发明实施例2的透射电镜图片； 0032 图2为本发明实施例4的PMFDR的外观形态照片； 说明书 2/8 页 5 CN 111789958 A 。

16、5 0033 图3为本发明实施例4表征的PMFDR形态的透射电镜照片； 0034 图4为本发明实施例5的PMFDR体外细胞毒性实验表征图； 0035 图5为本发明实施例6的PMFDR体内抗肿瘤活性实验表征图。 具体实施方式 0036 应该指出， 以下详细说明都是例示性的， 旨在对本发明提供进一步的说明。 除非另 有指明， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。 0037 需要注意的是， 这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式， 而非意图限制根 据本发明的示例性实施方式。 如在这里所使用的， 除非上下文另外明确指出， 否则单数形式 也意图包括复。

17、数形式， 此外， 还应当理解的是， 当在本说明书中使用术语 “包含” 和/或 “包 括” 时， 其指明存在特征、 步骤、 操作、 器件、 组件和/或它们的组合。 应理解， 本发明的保护范 围不局限于下述特定的具体实施方案； 还应当理解， 本发明实施例中使用的术语是为了描 述特定的具体实施方案， 而不是为了限制本发明的保护范围。 0038 如前所述， 由于同时递送靶向不同类型细胞或甚至细胞不同部位的免疫治疗药物 并且使其各司其职互不干扰非常困难。 0039 有鉴于此， 发明人研究发现， Cdk5在多种肿瘤细胞中高度活跃， 研究表明， 通过抑 制Cdk5， 可以有效抑制PD-L1下调， 且PD-L。

18、1表达量不再受干扰素-的刺激而回弹， 从而真 正的缓解的适应性免疫耐药。 因此， 与标准的PD-L1阻断抗体相比， CdK5抑制剂可以发挥更 彻底的作用， 同时靶点位于细胞内， 避免了药物共递送靶点不一致的问题。 因此， 本发明通 过联用化疗药多柔比星(Dox)和Cdk5抑制剂Roscovitine(Rosco)， 一方面， 通过化疗杀伤肿 瘤细胞， 活化免疫系统从而恢复IFN-含量， 减轻术后应激带来的免疫抑制， 另一方面， 通 过Rosco下调PD-L1， 缓解IFN-相关的免疫耐药， 二者结合， 改变IFN-的两面性， 将其下 游的免疫抑制作用解除， 使其正向作用得以发挥。 同时， 利用。

19、血小板的生物趋向特性解决手 术后靶向给药的难题。 血小板膜具有靶向血管破损内皮胶原蛋白的作用， 利用这一特性， 有 助于实现对术后残留肿瘤组织部位的血管的靶向蓄积， 同时， 由于血小板膜表面P- selection可以与肿瘤细胞表面CD44结合， 可有效捕获循环肿瘤细胞， 从而实现对体内残留 肿瘤的全面靶向。 但是， 现有的基于细胞膜的仿生纳米制剂通常是使用挤压或者超声的方 法， 将细胞膜连续的完整的包覆在疏水内核儿表面， 载药效率较低且制备方法复杂。 0040 为了解决现有技术的不足， 本发明提供基于血小板膜碎片的仿生纳米粒的制备方 法及其抗肿瘤应用， 该纳米制剂与目前已有的仿生纳米制剂相比。

20、， 制备过程简单且载药效 率高的优点， 可以有效靶向残留肿瘤组织和循环肿瘤细胞， 实现缓解术后应激、 解除适应性 免疫耐药的治疗效果， 从而完成本发明。 0041 因此， 本发明的一个典型具体实施方式中， 提供Cdk5抑制剂联合化疗药物在制备 抗肿瘤药物中的应用。 0042 所述Cdk5抑制剂可以选自siRNA、 shRNA、 抗体、 小分子化合物和肽段； 0043 本发明的又一具体实施方式中， 所述CDK5抑制剂选自： Roscovitine(Rosco)， 奥罗 莫星(olomoucine)及其衍生物， Dinaciclib(MK-7965， SCH727965)， AT7519， CIP。

21、， p5和Cpd1 等； 说明书 3/8 页 6 CN 111789958 A 6 0044 本发明的又一具体实施方式中， 所述CDK5抑制剂为Roscovitine； 0045 本发明的又一具体实施方式中， 所述化疗药物包括但不限于烷化剂、 植物生物碱 类、 抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、 铂类药物、 抗代谢类药物。 0046 本发明的又一具体实施方式中， 所述化疗药物可以选自： 多柔比星(DOX)、 磷酰胺、 米托蒽醌、 甲氨蝶呤、 长春新碱、 长春地辛、 依托泊苷、 替尼泊苷、 地塞米松、 顺铂、 卡铂、 奥沙 利铂、 紫杉醇、 多西他赛和吉西他滨等； 0047 本发明的又一具体实施方式中， 。

22、所述化疗药物为多柔比星。 0048 当所述Cdk5抑制剂为Roscovitine， 所述化疗药物为多柔比星时， 二者质量比为1 3： 1； 当多柔比星与Roscovitine的质量比为1： 1为时， 抗肿瘤效果最佳。 0049 本发明的又一具体实施方式中， 所述抗肿瘤药物至少具有如下任一种或多种用 途： 0050 1)缓解术后应激带来的免疫抑制； 0051 2)缓解适应性免疫耐药； 0052 3)提高抗肿瘤效力。 0053 本发明的又一具体实施方式中， 用途1)和2)均与IFN-相关。 0054 本发明的又一具体实施方式中， 提供一种仿生纳米制剂， 所述仿生纳米制剂的药 物活性成分包含上述Cd。

23、k5抑制剂和化疗药物。 0055 本发明的又一具体实施方式中， 所述仿生纳米制剂的剂型为纳米粒； 更进一步为 基于血小板膜碎片的仿生纳米粒。 0056 本发明的又一具体实施方式中， 所述仿生纳米制剂由Cdk5抑制剂、 化疗药物和血 小板膜碎片制成。 0057 本发明的又一具体实施方式中， 所述Cdk5抑制剂为Roscovitine， 所述化疗药物为 多柔比星， 二者质量比为13： 1； 当多柔比星与Roscovitine的质量比为1： 1为时， 抗肿瘤效 果最佳。 0058 本发明的又一具体实施方式中， 提供上述仿生纳米制剂的制备方法， 包括： 0059 将Cdk5抑制剂和化疗药物分别溶解后混。

24、合均匀， 加入含有血小板膜碎片的水溶液 中搅拌处理， 透析后即得。 0060 本发明的又一具体实施方式中， 溶解选用溶剂为二甲基亚砜， 其溶解效果更佳； 同 时， 为了使Cdk5抑制剂和化疗药物混合更为均匀， 优选采用超声方式， 以提高二者的混合均 匀度。 0061 本发明的又一具体实施方式中， 加入采用滴加方式进行； 从而使得抗肿瘤药物成 分分散更为均匀； 0062 搅拌处理时间为1040min； 0063 透析处理时间为48h。 0064 本发明的又一具体实施方式中， 所述血小板膜碎片(该细胞膜碎片尺寸为10 40nm)由以下方法制备得到： 0065 收集抗凝血后， 采用梯度离心法提取血小。

25、板后， 通过反复冻融循环得到血小板膜， 再采用探头超声的方式进行破碎处理， 从而获得血小板膜碎片。 0066 其中， 抗凝血通过加入抗凝血剂获得， 所述抗凝剂血剂可以为EDTA， 其浓度优选为 说明书 4/8 页 7 CN 111789958 A 7 27mM， 抗凝血效果最佳。 0067 提取血小板的步骤包括： 0068 将收集的抗凝血在室温下进行低速离心， 分离去除红细胞和白细胞， 得到富血小 板血浆； 0069 将富血小板血浆在相同条件下离心进行纯化。 0070 向纯化的富血小板血浆中加入EDTA和前列腺素E1， 在室温下高速离心得到血小板 沉淀； 0071 将血小板沉淀重新分散至含有E。

26、DTA和蛋白酶抑制剂的溶液中， 冷冻保存。 0072 本发明中所述室温是指室内的温度， 为1530。 0073 本发明的又一具体实施方式中， 低速离心的转速为80150g， 当转速为100g时， 分 离效果更好； 低速离心的时间为1530min， 当离心时间为20min时， 分离效果更好。 0074 本发明的又一具体实施方式中， EDTA的浓度为0.52mM， 浓度为1mM时效果更好； 前列腺素E1的浓度为14 M， 浓度为2 M时效果更好。 0075 本发明的又一具体实施方式中， 高速离心的转速为7001000g， 当转速为800g时， 分离效果更好； 高速离心的时间为1530min， 当离。

27、心时间为20min时， 分离效果更好。 0076 本发明的又一具体实施方式中， 所述蛋白酶抑制剂可以是市售的蛋白酶抑制剂 片， 蛋白酶抑制剂片的浓度为515mL/片， 浓度为10mL/片时效果更好。 0077 本发明的又一具体实施方式中， 血小板最终重新分散的溶剂为PBS。 0078 本发明的又一具体实施方式中， 收集血小板膜的步骤为： 将分离得到的血小板进 行多次反复的冻融循环后， 室温下高速离心， 反复清洗后得到血小板膜。 0079 本发明的又一具体实施方式中， 反复冻融的循环数为310次， 循环次数为7时， 提 取效果更好。 0080 本发明的又一具体实施方式中， 高速离心的转速为300。

28、05000g， 当转速为4000g 时， 分离效果更好； 高速离心的时间为110min， 当离心时间为3min时， 分离效果更好。 0081 本发明的又一具体实施方式中， 清洗剂为去离子水。 0082 本发明的又一具体实施方式中， 制备血小板细胞膜碎片的步骤为： 将血小板细胞 膜采用探头超声的方式进行物理破坏， 得到血小板膜碎片。 0083 本发明的又一具体实施方式中探头超声的功率幅度为1030， 当功率幅度为 20时， 破碎效果更好； 探头超声的时间为30120s， 当离心时间为60s时， 破碎效果更好； 探头超声的时间间隔为开： 26s； 关： 14s； 当时间间隔为开： 4s； 关： 2。

29、s时， 破碎效果更好。 0084 本发明的又一具体实施方式中， 提供上述仿生纳米制剂在制备抗肿瘤药物中的应 用。 0085 所述抗肿瘤药物至少具有如下任一种或多种用途： 0086 1)缓解术后应激带来的免疫抑制； 0087 2)缓解适应性免疫耐药； 0088 3)提高抗肿瘤效力。 0089 本发明的又一具体实施方式中， 用途1)和2)均与IFN-相关。 0090 同时， 需要说明的是， 肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用， 其 包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。 良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、 转移性肿瘤的细 说明书 5/8 页 8 CN 111789958 A 8 胞过度增殖。

30、。 反之， 恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转 移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。 0091 本发明的又一具体实施方式中， 本发明的药物可用于治疗恶性瘤。 可用本发明的 药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。 实体瘤可以是例如乳腺、 膀胱、 骨、 脑、 中枢 和外周神经系统、 结肠、 内分泌腺(如甲状腺和肾上腺皮质)、 食道、 子宫内膜、 生殖细胞、 头 和颈、 肾、 肝、 肺、 喉和下咽的肿瘤、 间皮瘤、 卵巢、 胰腺、 前列腺、 直肠、 肾、 小肠、 软组织、 睾 丸、 胃、 皮肤(如黑色素瘤)、 输尿管、 阴道和外阴的肿瘤。 恶性瘤包括遗传性癌症， 。

31、例如视网 膜母细胞瘤和肾母细胞瘤(Wilmstumor)。 此外， 恶性瘤包括在所述器官中的原发性肿瘤及 在远端器官中的相应继发性肿瘤(肿瘤转移)。 血液瘤可以是例如侵略性和无痛形式的白血 病和淋巴瘤， 即非霍奇金病、 慢性和急性髓样白血病(CML/AML)、 急性淋巴细胞性白血病 (ALL)、 霍奇金病、 多发性骨髓瘤和T-细胞型淋巴瘤。 还包括骨髓增生异常综合征、 浆细胞 瘤、 类肿瘤综合征和未知原发部位的癌症及AIDS相关的恶性瘤。 0092 以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。 以下各实施例中所用的原 料都可通过商购获得， 所用的设备均为现有设备。 0093 实施例1： 血。

32、小板膜碎片的制备 0094 1)小鼠外周血提取： 固定小鼠后用镊子夹取眼球并快速摘取， 并使血液从眼眶内 流入使用EDTA润洗过的EP管中。 0095 2)提取血小板： 将收集的全血样品在室温下100g离心20min， 分离去除红细胞和白 细胞， 得到富血小板血浆。 再在相同条件下重复离心一次进行纯化。 向纯化的富血小板血浆 中加入EDTA和前列腺素E1， 在室温下800g离心20min得到血小板沉淀。 将血小板沉淀重新分 散至含有EDTA和蛋白酶抑制剂片(Roche)的PBS中， 冷冻保存。 0096 3)制备血小板细胞膜碎片： 将血小板细胞膜采用探头超声的方式进行物理破坏， 探头超声的功率。

33、幅度为20， 时间为60s， 间隔为开： 4s， 关： 2s。 最终得到血小板膜碎片。 0097 实施例2： 透射电镜(TEM)鉴定血小板膜碎片的纳米结构 0098 用移液枪吸取20 L血小板膜碎片溶液， 碳膜铜网上， 滤纸吸去多余液体， 室温下干 燥后置于透射电镜下观察。 结果如图1所示， 透射电镜图片可以证实， 新制备的血小板膜碎 片的尺寸为20nm， 且大小均一， 分散性良好。 0099 实施例3： PMFDR仿生纳米制剂的制备 0100 本实施例提供基于该细胞膜碎片的仿生纳米制剂， 包括上述血小板膜碎片、 多柔 比星和Cdk5抑制剂Roscovitine。 0101 具体制备方法包括：。

34、 分别精密称取多柔比星和Cdk5抑制剂Roscovitine， 使用二甲 基亚砜溶解至40mgmL-1。 各取25 L后在超声条件下混合均匀， 缓慢滴加至搅拌中的2mL血 小板膜碎片水溶液中， 搅拌30min后进行透析， 6h后获得仿生纳米制剂， 即为PMFDR纳米粒 溶液。 0102 实施例4： PMFDR仿生纳米制剂的外观及纳米聚集体形态 0103 为更直观的观察与比较， 对实施例3制备得到的PMFDR仿生纳米制剂进行拍照观 察。 在图2中， aPD-L1HC/PM外观均一， 无分层且无絮凝产生， 且具有明显的丁达尔效应。 吸 取20 L纳米聚集体混悬液滴于碳膜铜网上， 滤纸吸去多余液体，。

35、 室温下干燥后置于透射电 镜下观察PMFDR仿生纳米制剂的纳米聚集体形态。 电镜照片如图3， 结果显示PMFDR可在水 说明书 6/8 页 9 CN 111789958 A 9 中聚集成大小均匀的纳米球结构， 且球体表面覆盖有明亮的壳层， 说明血小板膜碎片成功 稳定纳米粒， 且聚集体形态均匀， 稳定性良好， 聚集体尺度适用于静脉注射。 0104 实施例5： PMFDR体外细胞毒性实验 0105 1.细胞的培养 0106 选取鼠源黑色素瘤细胞株B16F10作为研究对象。 取冻存细胞， 用培养基于37、 5CO2条件下培养， 待细胞生长至高密度时传代， 按比例转移至培养瓶中继续培养并进行 细胞计数。

36、。 0107 2.细胞毒性实验 0108 B16F10细胞用于评估不同浓度Dox， Rosco， Dox+Rosco和PMFDR的细胞毒性。 用培 养基将待测目标化合物Dox， Dox+Rosco和PMFDR各按照Dox的量稀释至1、 2、 4、 8、 12 g mL-1。 收集对数生长期的B16F10细胞， 细胞以8103个/孔的浓度加入96孔板中， 孵育过夜后， 加 入不同浓度的目标化合物溶液200 L， 设3个复孔。 将细胞在37下培养24h， 然后洗涤， 换新 鲜培养基， 每孔加入0.5的MTT溶液10 L， 继续孵育4h， 然后弃去孔内液体， 每孔加120 LDMSO溶解， 用酶标仪。

37、测定490nm处吸光度， 用下式计算细胞抑制率： 0109 0110 几种样品在不同浓度下的细胞抑制率实验结果如图4。 由图4可以看出， Dox和PMF DR展现出浓度依赖性。 PMFDR对B16F10细胞的抑制作用明显强于Dox和Dox+Rosco。 0111 由此， 得出结论， PMFDR仿生纳米制剂对黑色素瘤细胞株B16F10细胞有理想的抑 制作用， 起效快， 杀伤力强。 0112 实施例6 PMFDR体内抑瘤研究 0113 1.动物模型建立 0114 6至8周雌性C57BL/6小鼠用于建立体内抗肿瘤模型。 B16F10细胞悬液(每只小鼠1 106个细胞)皮下接种到6-8周C57BL/6。

38、雌性小鼠的右后肢处来建立肿瘤。 0115 2.动物体内抑瘤实验 0116 肿瘤达到800mm3后， 对小鼠肿瘤进行不完全切除。 此时， 称重小鼠， 随机分成4 组： 生理盐水作为对照， Dox， Rosco， PMFDR后3组作为实验组， 每2天给予一次治疗， 共治疗5 次。 每两天测量肿瘤体积， 并根据以下等式计算肿瘤体积： 0117 0118 L表示最大直径(mm)， 而W表示最小直径(mm)。 0119 在各种治疗结束后， 处死小鼠以取出肿瘤称重。 并根据以下公式计算每组小鼠肿 瘤的抑制率： 0120 0121 Wc表示生理盐水组的平均肿瘤重量， 而Wt表示其他组的最终肿瘤重量。 012。

39、2 本发明首次制备了一种血小板膜碎片， 这种细胞膜碎片结构充分发挥稳定剂作 用， 简化了仿生纳米制剂的制备流程， 同时解决了目前仿生纳米制剂载药量低的缺点。 同 时， 血小板膜碎片、 Dox和Rosco共组装后的形成PMFDR仿生纳米制剂， 可在水中自组装形成 结构均一的纳米球， 稳定性好， 易于储存与运输， 为工业生产提供可能。 细胞实验表明PMF 说明书 7/8 页 10 CN 111789958 A 10 DR仿生纳米制剂对黑色素瘤细胞的杀伤力强， 选择性好。 同时， 体内实验证明PMFDR仿生纳 米制剂良好的肿瘤抑制作用。 0123 最后应该说明的是， 以上所述仅为本发明的优选实施例而。

40、已， 并不用于限制本发 明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的技术人员来说， 其依然 可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分进行等同替换。 凡在本发 明的精神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围 之内。 上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述， 但并非对本发明保护范围的限制， 所 属领域技术人员应该明白， 在本发明的技术方案的基础上， 本领域技术人员不需要付出创 造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。 说明书 8/8 页 11 CN 111789958 A 11 图1 图2 说明书附图 1/3 页 12 CN 111789958 A 12 图3 图4 说明书附图 2/3 页 13 CN 111789958 A 13 图5 说明书附图 3/3 页 14 CN 111789958 A 14 。