远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010575263.0 (22)申请日 2020.06.22 (71)申请人 西南林业大学 地址 650224 云南省昆明市盘龙区白龙寺 300号 (72)发明人 华燕谭大聪王军民郭磊 (74)专利代理机构 北京众泽信达知识产权代理 事务所(普通合伙) 11701 代理人 张艳萍 (51)Int.Cl. A61K 36/69(2006.01) A61P 19/06(2006.01) (54)发明名称 远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及 应用 (57)摘要 本发明公开了远志。

2、属植物中总口山酮的提 取纯化方法及应用， 将远志风干粉碎过筛； 置于 平底烧瓶中， 加入乙醇， 水浴加热回流提取两次， 提取液过滤后合并， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏； 称取大孔吸附树脂， 湿法装柱， 取浸膏样品溶解 上样， 进行动态吸附2次， 待吸附完全后， 用水洗 脱至洗脱液不浑浊， 再用的30体积浓度乙醇洗 脱至洗脱液不浑浊， 最后用90乙醇洗脱， 收集 洗脱液， 在60下回收乙醇后， 减压浓缩、 干燥； 用水和乙酸乙酯充分溶解得到的样品， 然后进行 萃取24次， 取乙酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的 总口山酮。 该方法操作简单、 省时、 成本低、 无污 染。 权利要求书1页 说明书14页。

3、 附图4页 CN 111803541 A 2020.10.23 CN 111803541 A 1.远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 按照以下步骤进行： S1， 将新鲜的远志风干， 用粉碎机粉碎过筛， 得到远志粉末； S2， 称取一定量S1中的远志粉末， 置于平底烧瓶中， 加入乙醇， 水浴加热回流提取两次， 提取液过滤后合并， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏； S3， 称取一定量的大孔吸附树脂， 湿法装柱， 取S2中浸膏样品溶解上样， 进行动态吸附2 次， 待吸附完全后， 用水洗脱至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液， 再用的30体积浓度乙醇洗脱 至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液， 最后用90。

4、乙醇洗脱， 收集洗脱液， 在60下回收乙醇后， 减 压浓缩、 干燥； S4， 用一定比例的水和乙酸乙酯充分溶解S3中得到的样品， 然后进行萃取2-4次， 取乙 酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的总口山酮。 2.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 所述S1 中， 用粉碎机粉碎过40-80目筛。 3.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 所述S2 中， 称取2.0g的远志粉末， 置于平底烧瓶中， 加入料液比为1:(10-50)的60-80体积浓度的 乙醇， 水浴加热40-80的条件下回流提取1-5h， 提取两次， 提取液过滤后合并，。

5、 减压浓缩回 收乙醇， 得浸膏。 4.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 所述S3 中， 称取5.0g的AB-8大孔吸附树脂， 湿法装柱， 取S2得到的浸膏， 配置成5-25mg/ml的浸膏样 品液40-60mL， 以0.5-4ml/min的流速进行动态吸附2次， 待吸附完全后， 用5BV水洗脱至洗脱 液不浑浊， 弃去洗脱液， 再用0.5-4ml/min流速的30乙醇5BV洗脱， 弃去洗脱液， 0.5-4ml/ min流速的90乙醇15BV洗脱， 收集洗脱液， 在60下回收乙醇后， 减压浓缩、 干燥。 5.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方。

6、法， 其特征在于， 所述S4 中， 用体积比1:3的水和乙酸乙酯配置50-200mL充分溶解S3得到经树脂纯化后的样品， 然后 进行萃取2-4次， 取乙酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的总口山酮。 6.根据权利要求3所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 加入料 液比1:30的70体积浓度的乙醇。 7.根据权利要求3所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 水浴加 热温度70条件下回流提取90min。 8.根据权利要求4所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 所述浸 膏样品液为50mL， 浓度为20mg/ml。 9.根据权利要求4所述的远志属植物。

7、中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在于， 以1mL/ min的流速进行洗脱。 10.一种采用如权利要求1-9任一项所述远志属植物中总口山酮的提取纯化方法得到 的总口山酮在制备用于治疗和/或预防通风的药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111803541 A 2 远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及应用 技术领域 0001 本发明属于药用植物提取及纯化技术领域， 涉及一种远志属植物中总口山酮的提 取纯化方法及应用。 背景技术 0002 远志属植物有顺气化痰、 活血止痛、 补心安神， 用于心悸、 失眠多梦、 咳嗽痰少、 虚 痨气弱等功效。 到目前为止， 已从远志属植物中分离得到数百个。

8、单体化合物， 其中以口山酮 类、 皂苷类以及糖脂类化合物为主。 远志属多数口山酮化合物具有酚性官能团， 所以表现出 广泛的生物和药理活性， 主要表现在： 止痛、 抗真菌、 MAO抑制以及抗突变、 抗癌、 兴奋中枢神 经系统等方面， 以往人们关注的重点是远志皂苷， 但目前研究结果已表明， 口山酮类成分也 在一定程度上代表了远志的生理活性。 0003 现有提取技术主要是利用超临界CO2萃取， 硅胶柱层析、 高压液相色谱进行纯化， 使得设备要求较高， 操作复杂， 耗时长； 此外， 现有应用方面口山酮主要用于防治食管癌、 抗 抑郁与抗老年痴呆症、 抗菌药物、 防治宫颈癌、 胰腺癌和肺癌、 糖尿病及由糖。

9、尿病所引起的 并发症、 抗肝纤维化和肝硬化、 抑制乙型肝炎病毒、 抗肿瘤、 抑制神经元细胞的凋亡等方面； 并未发现口山酮具有治疗和预防痛风的作用。 发明内容 0004 为实现上述目的， 本发明提供一种远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 操作 简单、 省时、 成本低、 无污染。 0005 本发明的另一目的在于口山酮在制备用于治疗和/或预防通风的药物中的应用。 0006 本发明所采用的技术方案是， 远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 其特征在 于， 按照以下步骤进行： 0007 S1， 将新鲜的远志风干， 用粉碎机粉碎过筛， 得到远志粉末； 0008 S2， 称取一定量S1中的远志粉末， 置于。

10、平底烧瓶中， 加入乙醇， 水浴加热回流提取 两次， 提取液过滤后合并， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏； 0009 S3， 称取一定量的大孔吸附树脂， 湿法装柱， 取S2中浸膏样品溶解上样， 进行动态 吸附2次， 待吸附完全后， 用水洗脱至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液， 再用的30体积浓度乙醇 洗脱至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液， 最后用90乙醇洗脱， 收集洗脱液， 在60下回收乙醇 后， 减压浓缩、 干燥； 0010 S4， 用一定比例的水和乙酸乙酯充分溶解S3中得到的样品， 然后进行萃取2-4次， 取乙酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的总口山酮。 0011 进一步的， 所述S1中， 用粉碎机粉碎过40。

11、-80目筛。 0012 进一步的， 所述S2中， 称取2.0g的远志粉末， 置于平底烧瓶中， 加入料液比为1: (10-50)的60-80体积浓度的乙醇， 水浴加热40-80的条件下回流提取1-5h， 提取两次， 提取液过滤后合并， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏。 说明书 1/14 页 3 CN 111803541 A 3 0013 进一步的， 所述S3中， 称取5.0g的AB-8大孔吸附树脂， 湿法装柱， 取S2得到的浸膏， 配置成5-25mg/ml的浸膏样品液40-60mL， 以0.5-4ml/min的流速进行动态吸附2次， 待吸附 完全后， 用5BV水洗脱至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液， 再。

12、用0.5-4ml/min流速的30乙醇5BV 洗脱， 弃去洗脱液， 0.5-4ml/min流速的90乙醇15BV洗脱， 收集洗脱液， 在60下回收乙醇 后， 减压浓缩、 干燥。 0014 进一步的， 所述S4中， 用体积比1:3的水和乙酸乙酯配置50-200mL充分溶解S3得到 经树脂纯化后的样品， 然后进行萃取2-4次， 取乙酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的总口山酮。 0015 进一步的， 加入料液比1:30的70体积浓度的乙醇。 0016 进一步的， 水浴加热温度70条件下回流提取90min。 0017 进一步的， 所述浸膏样品液为50mL， 浓度为20mg/ml。 0018 进一步的， 以。

13、1mL/min的流速进行洗脱。 0019 本发明的有益效果： 本发明通过回流提取的方法， 利用正交实验优化提取工艺， 从 远志中提取总口山酮， 并通过大孔吸附树脂和萃取相结合的方法对其进行纯化， 使得操作 简单， 设备要求低， 节省时间， 成本低， 对环境污染小。 口山酮用于抑制黄嘌呤氧化酶的活 性， 减少嘌呤类和次黄嘌呤转化为尿酸， 从而减低血尿酸的水平， 从而达到治疗和预防痛风 的效果。 附图说明 0020 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本。

14、领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以 根据这些附图获得其他的附图。 0021 图1是芦丁标准曲线图。 0022 图2是S1标准曲线图。 0023 图3是S2标准曲线图。 0024 图4是乙醇体积分数对总口山酮、 两个山口酮提取量的影响图。 0025 图5是提取时间对总口山酮、 两个山口酮提取量的影响图。 0026 图6是提取温度对总口山酮、 两个山口酮提取量的影响图。 0027 图7是料液比对总口山酮、 两个山口酮提取量的影响图。 0028 图8是乙醇体积分数对总口山酮、 两个山口酮的影响图。 0029 图9是上样质量浓度对总口山酮、 两个山口酮的影响图。 0030 图。

15、10是上样体积流量对总口山酮、 两个山口酮的影响图。 0031 图11是最大上样量对总口山酮、 两个山口酮的影响图。 0032 图12是洗脱剂(乙醇)用量对总口山酮、 两个山口酮的影响图。 0033 图13是洗脱剂体积流量对总口山酮、 两个山口酮的影响图。 0034 图14是不同萃取因素对总口山酮纯化效果的影响图。 具体实施方式 0035 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 说明书 2/14 页 4 CN 111803541 A 4 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技。

16、术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 0036 远志属植物中总口山酮的提取纯化方法， 具体按照以下步骤进行： 0037 S1， 原料处理： 将新鲜的远志风干， 用粉碎机粉碎过筛， 得到远志粉末； 0038 优选地， 步骤S1中经粉碎机粉碎的远志粉末为过40-80目的筛粉； 过40-80目筛使 远志和溶剂充分接触， 加速提取速率。 0039 S2， 醇提： 称取一定量S1中的远志粉末， 置于平底烧瓶中， 加入乙醇， 水浴加热回流 提取两次， 提取液过滤后合并， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏； 0040 优选地， 步骤S2中称取2.0g的远志粉末， 置。

17、于平底烧瓶中， 加入料液比为1:(10- 50)的60-80体积浓度的乙醇， 在水浴温度40-80的条件下回流提取1-5h， 提取两次， 提 取液过滤后合并， 减压浓缩回收乙醇， 得浸膏。 0041 最优选的， 乙醇体积分数70， 料液比为1： 30， 回流提取时间90min， 温度70。 0042 经过多次实验验证， 料液比的选择对总口山酮提取量有较大影响， 如果不在该范 围提取量会大幅度降低； 当水浴反应在40-80时， 受热均匀， 加速分子间的作用， 使得口山 酮更容易溶出； 而小于40提取速度慢， 提取量太小， 大于80会使化合物降解， 影响提取 量和生物活性。 0043 S3， 大孔。

18、吸附树脂纯化工艺参数的优选： 准确称取一定量的大孔吸附树脂， 湿法装 柱， 取S2中浸膏样品溶解上样， 进行动态吸附2次， 待吸附完全后， 用水洗脱至洗脱液不浑 浊， 弃去洗脱液， 再用的30体积浓度乙醇洗脱至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液， 最后用90 乙醇洗脱， 收集洗脱液， 在60下回收乙醇后， 减压浓缩、 干燥； 0044 优选地， 步骤S3中称取5.0g的AB-8大孔吸附树脂， 湿法装柱， 取S2中浸膏， 配置成 5-25mg/ml的浸膏样品液40-60mL， 最优50mL， 以0.5-4ml/min的流速进行动态吸附2次， 待吸 附完全后， 用5BV水洗脱至洗脱液不浑浊， 弃去洗脱液，。

19、 再用0.5-4ml/min流速的30乙醇 5BV洗脱， 0.5-4ml/min流速的90乙醇15BV洗脱， 收集洗脱液， 在60下回收乙醇后， 减压 浓缩、 干燥； 其中， BV表示柱体积。 0045 浸膏样品液浓度过低流动就较快， 不利于吸附， 浓度过高， 树脂吸附饱和， 有多余 口山酮泄露， 影响总口山酮得率， 最佳工艺下是5g树脂上样20mg/ml的样品50ml。 0046 流速越慢吸附越完全， 考虑到时间成本及效果， 最佳选择1ml/min流速洗脱。 0047 30体积浓度乙醇洗脱为了除去远志中的皂苷类化合物， 因为要的是小极性的口 山酮， 乙醇浓度大于30可能洗去部分口山酮； 最后。

20、用90乙醇， 是为了洗脱下来需要小极 性的口山酮， 乙醇浓度小于90不能完全洗脱。 0048 S4， 萃取： 用一定比例的水和乙酸乙酯充分溶解S3中的样品， 然后进行萃取2-4次， 取乙酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的总口山酮。 0049 优选地， 步骤S4中用体积比1:3的水和乙酸乙酯配置50-200mL充分溶解S3中经树 脂纯化后的样品， 然后进行萃取， 取乙酸乙酯部分， 浓缩旋干得纯化的总口山酮。 0050 经测定， 总口山酮达到65.67以上。 0051 本发明工艺的验证过程： 0052 1.1研究方法 说明书 3/14 页 5 CN 111803541 A 5 0053 采用单因素、 。

21、正交试验的方法， 结合紫外分光光度法和HPLC法， 测量西南远志中总 口山酮酮的含量和两个指标性口山酮的含量， 来确定口山酮的提取量， 从而优化提取工艺 参数； 根据预实验结果， 乙醇体积分数、 提取时间、 提取温度和料液比对提取率影响较大， 因 此选择此4因素做单因素试验； 根据单因素试验结果做L9(34)的正交试验。 0054 1.2试验材料、 仪器、 试剂及植物来源 0055 1.2.1试验材料 0056 表2-17种大孔吸附树脂的型号、 极性、 级别和粒径范围 0057 0058 1.2.2试验仪器 0059 Evolution300紫外分光光度计(美国ThermoFisher公司)；。

22、 GZX-9070MBE型数显鼓 风干燥箱(上海博迅技术公司)； 德国HeidolphDigital旋转蒸发仪(德国HeidolphGroup公 司)； BK-300GDE超声波清洗器(陕西凯德力环保科技有限公司)； 恒温水浴锅(国华电器有限 公司) ； 玻璃干燥器(北京天连和谐仪器仪表有限公司) ； Milli-Q超纯水系统(德国 Millipore公司)； 十万分之一电子天平(德国赛多利斯集团)； 高效液相色谱仪(HPLC)1200 为Agilent产品； HPLC分析柱(AgilentAnalyticalEclipseXDB-C18， 4.6150mm， 5 m)。 0060 1.2.3。

23、实验试剂 0061 工业纯乙醇、 色谱纯甲醇、 色谱纯乙腈、 分析纯磷酸、 芦丁、 NaN02、 NaOH均为分析 纯， Al(N03)3化学纯， 以上试剂均购于美国Sigma公司； 1， 2， 3-三甲氧基-6， 8-二羟基口山酮 (S1)、 1， 3， 6-三羟基-2， 7， 8-三甲氧基口山酮(S2)， 实验室自制， 经HPLC-DAD分析， 纯度均大 于98。 0062 1.2.4植物来源 0063 西南远志采自云南省云县， 由西南林业大学林学院杜凡教授鉴定为远志科 (Polygalaceae)植物西南远志(PolygalacrotalarioidesBuch.-Ham.exDC)， 。

24、标本保存在西 南林业大学林学院植物资源利用系药用植物教研室。 0064 1.3标准曲线的测定 0065 1.3.1芦丁标准曲线 0066 精密称取120条件下干燥至恒重的芦丁4.0mg， 置于10mL容量瓶中， 加入适量 80的乙醇， 超声处理使之溶解， 用80的乙醇定容至10mL， 摇匀， 配制成浓度为0.4mg/mL 说明书 4/14 页 6 CN 111803541 A 6 的芦丁标准溶液， 精确量取0.4mg/mL芦丁标准溶液0.0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0mL分置10mL 容量瓶中， 加入5NaNO2溶液0.3mL， 摇匀， 放置6min， 加入10Al(NO。

25、3)3溶液0.3mL， 摇匀显 色， 定容， 放置6min后， 以零管为空白。 在最大波长510nm处测定吸光度， 结果进行直线回归， 根据标准曲线， 计算样品中总口山酮的含量。 0067 1.3.2化合物S1、 S2标准曲线 0068 以西南远志中两个活性指标性成分(1,3,6-三羟基-2,7,8-三甲基口山酮(S1)、 1, 2,3-三甲基-6,8-二羟基口山酮(S2)为标准品， 准确称取经干燥锅干燥至恒重的化合物 S1、 S2对照品1mg， 置于10mL容量瓶中， 加适量甲醇使其溶解并稀释至刻度线， 将其摇匀， 得到 0.10mg/mL标准溶液， 将标准溶液分别稀释为0.00125、 0。

26、.0025、 0.005、 0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.10mg/mL， 过0.45 m微孔滤膜， 得滤液。 进HPLC检测， 设置进样量为10 L， 在 230nm紫外光下测定。 以口山酮浓度为X轴， 以HPLC法测得的峰面积为Y轴， 绘制两个口山酮 标准曲线。 0069 HPLC检测条件： 色谱柱： AgligentZORBAXSB-C18(4.6mm250mm， 5 m)； 流动相： 乙 腈-0.5磷酸水； 流速： 0.8mL/min； 检测波长： 230nm； 柱温： 251； 进样量： 20 L。 0070 1.4提取单因素试验 0071 准确称取。

27、2.0g干燥的西南远志粉末(60目)， 置于250mL平底烧瓶中， 采用不同的实 验方法进行提取。 改变提取条件料液比、 乙醇浓度、 提取温度和提取时间以确定提取因素变 化范围以及各因素的较佳值， 具体的因素及水平见表2-2。 提取两次， 两次提取液过滤合并 后置于100mL容量瓶， 定容， 然后取1mL溶液置于10mL容量瓶中， 加入显色剂， 定容， 按芦丁标 准曲线测定方法， 利用紫外分光光度法测量西南远志中总口山酮的含量， 总口山酮含量的 计算方法如公式(2-1)。 0072 准确称取2.0g干燥的西南远志粉末(60目)， 置于250mL平底烧瓶中， 改变提取条件 料液比、 乙醇浓度、 。

28、提取温度和提取时间， 提取两次， 两次提取液过滤合并， 用旋转蒸发仪蒸 干得浸膏， 取一定量浸膏置于10mL容量瓶中， 加适量色谱甲醇使其溶解并稀释至刻度线， 超 声混匀， 过0.45 m微孔滤膜， 得样品液。 进HPLC检测， 设置进样量为10 L， 在230nm紫外光下 测定两个指标性口山酮化合物的提取量， 计算公式如公式(2-2)。 0073 总口山酮的计算公式： 总口山酮提取量()(CV/V0)/M100(2-1) 0074 其中C表示测量溶液的浓度； V表示样液定容后的体积； V0表示测定吸光度所用V中 样液的体积； M表示称取西南远志样品重量。 0075 两个指标性口山酮计算公式：。

29、 口山酮含量()CiV(M1/M2)/M3100(2-2) 0076 其中Ci表示测量溶液中S1、 S2的浓度； V表示测定HPLC用样液的体积； M1表示总浸膏 质量； M2表示测定HPLC称取的浸膏质量； M3表示称取西南远志样品质量。 0077 表2-2回流提取总口山酮的影响因素及水平 说明书 5/14 页 7 CN 111803541 A 7 0078 0079 1.5正交试验设计 0080 在提取单因素试验的基础上， 采用正交实验优化工艺条件。 以乙醇浓度、 提取温 度、 提取时间、 料液比作为考察对象， 选取各单因素较优的3个水平， 选用L9(34)表， 并安排试 验， 每组试验平。

30、行重复3次， 取平均值， 优化工艺条件， 以确定总口山酮的最佳提取条件。 0081 2总口山酮的纯化工艺研究 0082 2.1研究方法 0083 以吸附率和解吸率为指标， 利用静态吸附试验对7种大孔吸附树脂进行筛选， 确定 了吸附分离西南远志中总口山酮的最佳树脂， 并以西南远志中总口山酮和两个指标性口山 酮含量为指标， 通过与动态吸附相结合的方法， 考察确定了该树脂纯化西南远志中总口山 酮的最佳工艺条件。 0084 2.2大孔吸附树脂的选择 0085 2.2.1树脂的预处理 0086 大孔吸附树脂用95乙醇浸泡24h， 充分溶胀后， 用95乙醇淋洗至流出液与水 (1:3)混合不呈白色浑浊为止，。

31、 然后以大量蒸馏水洗尽乙醇， 以吸水纸吸去树脂表面水分， 备用。 0087 2.2.2大孔吸附树脂静态吸附率和解吸率的测定 0088 准确称取7种大孔吸附树脂(S-8、 NKA-9、 HZ806、 AB-8、 D-101、 X-5、 HP-20)各5.0g至 150mL锥形瓶中， 在每个锥形瓶中加入70mL的20mg/mL的样品溶液， 根据 “1.4” 项下方法测定 原样液中总口山酮含量和两个指标性口山酮含量， 用保鲜膜将锥形瓶口适当包扎， 以防在 震荡时溶液溅出， 设置恒温恒速振荡器的温度为27， 时间为24h， 待震荡时间到， 将溶液过 滤， 瓶中树脂保留， 将所得滤液按 “1.4” 项下。

32、方法进行检测， 按公式(2-1)计算总口山酮含 量， 公式(2-2)计算两个指标性口山酮含量， 从而根据公式(2-3)计算每个型号树脂的静态 吸附率。 将吸附饱和的树脂放在滤纸上晾干， 再置于锥形瓶中， 加入95的乙醇70mL， 设置 恒温恒速振荡器的时间为6h， 温度为27， 待充分洗脱后， 过滤， 得滤液， 将所得滤液按 “1.4” 项下方法进行检测， 按公式(2-1)计算总口山酮含量， 公式(2-2)计算两个指标性口山 酮含量， 根据公式(2-4)计算每个型号树脂的静态解吸率。 0089 吸附率(吸附前口山酮质量-吸附后口山酮质量)/吸附前口山酮质量100 (2-3) 0090 解吸率解。

33、吸附后总口山酮质量/(吸附前总口山酮质量-吸附后总口山酮质量) 100 (2-4) 0091 富集口山酮回收率吸附率解吸率100 (2-5) 0092 以吸附率为主要影响因素， 结合回收率， 选出较优的几种大孔吸附树脂进行下一 说明书 6/14 页 8 CN 111803541 A 8 步的动态吸附实验。 0093 2.2.3动态吸附-洗脱性能试验 0094 取处理好的大孔吸附树脂各5.0g， 进行湿法装柱， 装于450mm15mm玻璃柱内， 将 10mg/mL的上样液50mL加于柱顶(树脂吸附饱和)， 动态吸附的体积流量以1.0mL/min进行， 为保证吸附充分， 过柱液重吸附1次。 加5B。

34、V水以1.0mL/min的体积流量洗脱， 收集过柱液和 水洗液， 定容。 用30乙醇以1.0mL/min的体积流量洗脱至不再有样品流出， 除去皂苷等大 极性成分， 再用90乙醇以1.0mL/min的体积流量洗脱至不再有总口山酮流出， 按 “2.2.2” 项下方法测定并计算吸附率及解吸率。 根据实验结果选出效果最好的树脂进行下一步的纯 化实验。 0095 2.3大孔吸附树脂纯化工艺的优选 0096 2.3.1洗脱剂体积分数的考察 0097 精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g， 湿法装柱， 冲洗多次， 备用。 取10mg/mL的样 品液50mL进行动态吸附两次， 吸附完全后， 接液。 先用100。

35、mL蒸馏水进行洗脱， 再依次以 30、 60、 90乙醇各100mL进行梯度洗脱， 各洗脱液分两次50mL收集， 取1mL溶液置于 10mL容量瓶中， 按 “1.4” 项下方法测定各部分中总口山酮的含量和两个指标性口山酮的含 量。 0098 2.3.2上样质量浓度的确定 0099 精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g， 5份， 湿法装柱。 分别制备5种浓度的上柱 液， 浓度分别为5、 10、 15、 20、 25mg/mL， 将5种不同浓度的上柱液分别通过树脂柱(柱体积为 5mL)进行动态吸附两次， 保证吸附完全， 接液。 先用5BV水洗脱， 去除远志中含有的糖酯类物 质， 再用5BV乙醇(3。

36、0)洗脱， 去除远志中含有的皂苷类物质， 最后用乙醇(90)洗脱至洗 脱液无色， 收集乙醇(90)洗脱液， 同上步骤测定90乙醇洗脱部分口山酮含量。 0100 2.3.3吸附流速的考察 0101 精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g， 装柱。 将 “2.3.2” 的上样浓度的上柱液通过 树脂柱分别以滴0.5、 1、 2、 3、 4mL/min的流速进行动态吸附， 进行2次吸附， 接液。 先用5BV水 洗脱， 再用5BV乙醇(30)洗脱， 最后用乙醇(90)洗脱至洗脱液无色。 收集乙醇(90)洗 脱液， 同上步骤测量90乙醇洗脱部分口山酮含量。 0102 2.3.4最大上样量的考察 0103 精。

37、密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g， 装柱。 将 “2.3.2” 上样浓度的上柱液通过树 脂柱， 以 “2.3.3” 的吸附流速进行动态吸附， 分段收集残留液。 以5mL每次接收残留液， 相同 方法测定每段残留液的紫外吸光值， 测定各分段残留液中总口山酮的量。 以 “2.3.2” 上样浓 度的样品溶液40、 45、 50、 55、 60mL通过树脂柱， 以 “2.3.3” 的吸附流速进行动态吸附。 先用 5BV水洗脱， 再用5BV乙醇(30)洗脱， 最后用乙醇(90)洗脱至洗脱液无色。 收集各部分的 洗脱液， 测定两个指标性口山酮的含量。 0104 2.3.5洗脱剂用量的考察 0105 精密称。

38、取处理好的大孔吸附树脂5.0g， 装柱。 将 “2.3.2” 上样浓度的 “2.3.4” 中量 的上柱液通过树脂柱， 以 “2.3.3” 的吸附流速进行2次动态吸附， 吸附完全后， 先用5BV水洗 脱， 再用5BV乙醇(30)洗脱， 最后用乙醇(90)进行解吸， 每5mL接收一次流出液， 测量紫 外吸光值， 测定各份流出液中总口山酮含量， 当口山酮含量为0， 口山酮基本洗脱完全。 以 说明书 7/14 页 9 CN 111803541 A 9 “2.2.3.2” 上样浓度，“2.3.4” 中量的上柱液通过树脂柱， 以 “2.3.3” 中的吸附流速进行动态 吸附两次。 先用5BV水洗脱， 再用5。

39、BV乙醇(30)洗脱， 最后用5、 10、 15、 20、 25BV的90乙醇 进行解吸， 收集各部分的洗脱液， 测定两个指标性口山酮的含量。 0106 2.3.6洗脱流速的考察 0107 精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g， 装柱。 将 “2.3.2” 的上样浓度 “2.3.4” 中量 的上柱液通过树脂柱， 分别以 “2.3.3” 中的流速进行动态吸附， 进行2次吸附， 接液。 先用5BV 水洗脱， 去除远志中含有的糖酯类物质， 再用5BV乙醇(30)洗脱， 去除远志中含有的皂苷 类物质， 最后用 “2.3.5” 中量的乙醇(90)以0.5、 1、 2、 3、 4mL/min的流速进行洗脱。

40、， 收集乙 醇(90)洗脱液， 同上步骤测量90乙醇洗脱部分总口山酮的含量和两个指标性口山酮的 含量。 0108 2.4萃取纯化工艺的优选 0109 2.4.1萃取溶剂的选择 0110 准确称取树脂纯化后的浸膏1.0g于烧杯中， 加入20mL蒸馏水制成50mg/mL提取物 水溶液， 分别取3mL水溶液5份， 以等体积的不同比例混合溶剂萃取2次， 收集两相溶液， 按 “2.1.4” 项下方法检测吸光值， 按公式2-1计算总口山酮含量。 0111 2.4.2萃取工艺优化 0112 准确吸取50mg/mL提取物水溶液3mL， 以筛选的较优纯化口山酮的溶剂为萃取剂， 分别对萃取次数(1、 2、 3、 。

41、4、 5次)、 水相-有机相体积比(1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 5)和萃取剂的 用量(20、 50、 100、 200、 300mL)进行研究， 以总口山酮萃取率为评价指标， 选择最佳口山酮萃 取工艺。 0113 3结果与分析 0114 3.1标准曲线的制作 0115 3.1.1芦丁的标准曲线 0116 以浓度(mg/mL)为横坐标， 吸光度为纵坐标绘制芦丁的标准曲线， 见图1， 得回归方 程： y0.407x+0.007， R20.9991。 结果表明在0.2-1mg/mL范围内呈良好的线性关系。 0117 3.1.2化合物S1、 S2的标准曲线 0118 以浓度(mg/mL。

42、)为横坐标， 峰面积为纵坐标绘制两个口山酮的标准曲线， 如图2和 图3， 经线性回归， 对照品S1、 S2的回归方程分别为y21517x+27.886， R20.9996； y 32487x-18.572， R20.9999。 对照品S1、 S2定量测定的线性范围分别为0.002525-0.101mg/ mL和0.0015-0.12mg/mL， 两个标准品在此范围内有良好的线性关系。 0119 (1)精密度试验 0120 吸取制备的对照品储备液， 重复进样5次， 结果芦丁吸光值和两个口山酮对照品峰 面积的RSD分别为1.23， 1.45， 1.09。 0121 (2)重复性实验 0122 取西。

43、南远志粉末5份， 精确称取各约2.0g， 制备成供试品溶液， 按样品含量测定方 法操作， 测定并计算含量， 芦丁、 S1和S25次测定值的RSD分别为1.36， 0.89， 1.14， 重复 性良好。 0123 (3)稳定性实验 0124 将上述供试品溶液连续2d进样共6次， 依本实验方法测定， 芦丁吸光度和S1、 S2峰面 说明书 8/14 页 10 CN 111803541 A 10 积6次测定值的RSD分别为1.42， 1.13， 1.25， 说明供试品溶液在2d内保持稳定。 0125 (4)加样回收实验 0126 取已知含量的西南远志样品溶液6份， 每份10mL， 分别加入对照品溶液母。

44、液1mL， 按 上述标曲条件测定吸光度和峰面积， 计算芦丁和2个口山酮化合物的回收率， 测定结果， 平 均加样回收率均在95105置信区间， 符合要求。 0127 3.2西南远志中口山酮类化合物提取工艺的优选 0128 3.2.1乙醇体积分数对口山酮提取量的影响 0129 由图4可知， 总口山酮含量在乙醇体积分数60-80范围内随乙醇体积分数的升高 而增加(左图)， 当乙醇体积分数高于80以后， 总口山酮含量反而逐渐减少； 两个指标性口 山酮的含量在60-75范围内随乙醇体积分数的升高而增加(右图)， 当乙醇体积分数高于 75以后， 两个指标性口山酮含量反而逐渐减少； 综上， 选择70、 75。

45、、 80进行下一步的 正交试验。 0130 3.2.2提取时间对口山酮提取量的影响 0131 由图5可知， 口山酮提取量(左图)、 两个口山酮含量(右图)随时间的增加而升高， 在120min以后含量增加不显著， 表明在120min左右口山酮大致提取完全， 故此选择90、 120、 150min做下一步的正交试验。 0132 3.2.3提取温度对口山酮提取量的影响 0133 如图6所示， 总口山酮(左图)提取量在提取初期， 随着温度的增加而增加， 在提取 过程中， 高温有助于加剧分子扩散运动， 加速溶液原料间的相互作用， 使细胞结构能更好的 被破坏， 口山酮能够更有效的溶出， 提取量在70达到最。

46、大， 但是当提取温度高于70时， 随后总口山酮提取量不再上升， 反呈现出下降的趋势， 两个指标性口山酮(右图)的含量在 提取温度高于60时就开始下降， 温度过高可使口山酮分子遭到破坏， 从而降低口山酮提 取量， 因此选择50、 60、 70做正交试验。 0134 3.2.4料液比对口山酮提取量的影响 0135 图7反映了不同的料液比提取对口山酮提取量的影响， 由结果可知， 随着料液比的 增加口山酮提取量(左图)有了明显的上升趋势， 当料液比为1:30时， 口山酮提取量达到最 大， 持续增大料液比后， 总口山酮含量大致趋于稳定； 当料液比大于1:30后， 两个指标性口 山酮提取量(右图)呈下降的。

47、趋势， 料液比的增加有助于原料的浸提， 从而加速口山酮的溶 出， 但溶剂量持续加大可使固液两相混合不彻底， 传质不均匀， 从而造成提取量下降。 故选 1:20、 1:30、 1： 40做下一步正交试验。 0136 3.2.5正交试验结果与分析 0137 根据单因素试验， 选择因素中提取量较优3水平做下一步的正交试验， 正交实验的 因素及水平见表2-3。 由表2-4可知， 各因素对总口山酮提取量的影响程度依次为C(提取温 度)A(乙醇体积分数)B(提取时间)D(料液比)； 较优组合为A1B1C3D1； 对表2-4中的数 据进行SPSS分析， 不同因素水平间总口山酮的含量进行方差分析见表2-5， 。

48、方差分析可知， A (乙醇体积分数)的P0.05， 影响显著； B(提取时间)的P0.05， 影响显著； C(提取温度)P0.05， 影响不显著。 表2-6方差分析结果表明， 不同处理组合 间西南远志中总口山酮的含量有极显著差异(P0.01)。 0138 表2-3正交实验的因素水平表 说明书 9/14 页 11 CN 111803541 A 11 0139 0140 0141 表2-4正交试验结果及极差分析 0142 说明书 10/14 页 12 CN 111803541 A 12 0143 表2-5总口山酮含量不同因素水平间的方差分析 0144 0145 0146 注:F0.05(2， 2)。

49、19.00， F0.01(2， 2)99.00 0147 表2-6总口山酮含量不同组合间的方差分析 0148 变异来源平方和自由度均方F显著性 处理间2.87580.359104.845* 误差1.335180.074 总变异4.21126 0149 由表2-4可知， 各因素对总口山酮提取量的影响程度依次为A(乙醇体积分数)C (提取温度)D(料液比)B(提取时间)； 较优组合为A2B1C3D2。 对表2-4中的数据进行SPSS 分析， 不同因素水平间两个指标性口山酮的含量进行方差分析见表2-7， 方差分析可知， A (乙醇体积分数)的P0.01， 影响极显著； B(提取时间)的P0.05， 。

50、影响显著； C(提取温度)P 0.01， 影响极显著； D(料液比)P0.05， 影响显著。 表2-8方差分析结果表明， 不同处理组合间 西南远志中总口山酮的含量有极显著差异(P0.01)。 0150 表2-7两个指标性口山酮含量不同因素水平间的方差分析 0151 来源离均差平方和自由度均方F比F临界值显著性 A0.00320.002105.89199* B0.0012021.63819* C0.00720.004230.0799* D0.00220.00168.48819* 0152 注:F0.05(2， 2)19.00， F0.01(2， 2)99.00 0153 表2-8两个指标性口山酮。