短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010646721.5 (22)申请日 2020.07.07 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: M 2020211 2020.06.17 (71)申请人 华熙生物科技股份有限公司 地址 250101 山东省济南市高新技术开发 区天辰大街678号 申请人 山东华熙海御生物医药有限公司 (72)发明人 魏玉洁陆震陈清平毛华 孙元军石艳丽郭学平 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 贾波 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.0。

2、1) A61K 8/99(2017.01) A61K 8/9789(2017.01) A61Q 19/00(2006.01) A61Q 19/02(2006.01) A61Q 19/08(2006.01) C12R 1/24(2006.01) (54)发明名称 一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中 的应用 (57)摘要 本发明提供了一种短乳杆菌及其在西柚发 酵和化妆品中的应用， 以自行筛选的短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） LZ5对西柚进行发 酵， 结合特殊的发酵方法， 所得西柚发酵提取液 具有良好的抗炎、 抗氧化、 美白功效， 在化妆品中 有很好的应用前景。 权利要求书。

3、1页 说明书11页 序列表1页 CN 111808769 A 2020.10.23 CN 111808769 A 1.一种短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） L-Z-5， 其特征是： 保藏号为CCTCC NO: M 2020211。 2.一种权利要求1所述的短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） L-Z-5 CCTCC NO: M 2020211在制备西柚发酵产品中的应用。 3.一种西柚发酵提取液的制备方法， 其特征是： 包括采用权利要求1所述的短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） L-Z-5 CCTCC NO: M 2020211发酵西柚。

4、果浆的步骤。 4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征是包括以下步骤： （1） 将西柚打浆， 所得果浆静置， 自然发酵至pH不再变化； （2） 将上述自然发酵后的果浆、 氮源、 碳源、 无机盐和水混合， 配成含果浆的培养液； （3） 将短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） L-Z-5 CCTCC NO: M 2020211和酶加入上述 含果浆的培养液中， 发酵至pH不再变化， 得发酵液； （4） 将发酵液除杂、 除菌， 得到西柚发酵提取液。 5.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征是： 步骤 （1） 中， 发酵温度为1525； 步骤 （3） 中， 发酵温度为30-37。 。

5、6.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征是： 步骤 （2） 中， 自然发酵后的果浆在含果浆 的培养液中的质量百分含量为10-30wt%， 氮源在含果浆的培养液中的质量百分含量为0.1- 2wt%， 碳源在含果浆的培养液中的质量百分含量为0.1-2wt%， 无机盐在含果浆的培养液中 的质量百分含量为0.02-0.2wt%。 7.根据权利要求4或6所述的制备方法， 其特征是： 步骤 （2） 中， 所述氮源为微生物培养 常用氮源， 优选牛肉膏、 蛋白胨、 酵母粉或大豆肽粉， 所述碳源为微生物培养常用碳源， 优选 葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糊精或果糖， 所述无机盐为磷酸氢二钾或硫酸锰； 步骤 （3） 中。

6、， 所述酶为 纤维素酶和果胶酶， 优选的， 纤维素酶的酶活为5-10万U/g， 果胶酶的酶活为10-20万U/g。 8.根据权利要求7所述的制备方法， 其特征是： 步骤 （3） 中， 纤维素酶和果胶酶的添加量 均为自然发酵后的果浆质量的0.002-0.2%； 短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） L-Z-5菌种 的接种量为含果浆的培养液的0.5-1 wt %。 9.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征是： 短乳杆菌 （Lactobacillus brevis） L-Z- 5菌种通过液体的种子培养基进行扩大培养， 扩大培养后离心去除上清液， 得到短乳杆菌 （Lactobaci。

7、llus brevis） L-Z-5菌种； 优选的， 种子培养基的配方为： 碳源2-5 wt %、 氮源 1.5-3 wt %、 无机盐0.2-0.7 wt %， 水余量； 优选的， 所述碳源为果糖、 蔗糖、 麦芽糊精或葡 萄糖， 所述氮源为牛肉膏、 蛋白胨、 酵母粉或黄豆粉， 所述无机盐为磷酸氢二钾或硫酸锰。 10.按照权利要求3-10中任一项所述的西柚发酵提取液的制备方法制得的西柚发酵提 取液及该西柚发酵提取液在化妆品中的应用， 其特征是： 所述西柚发酵提取液作为化妆品 的抗炎、 抗氧化或美白成分。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111808769 A 2 一种短乳杆菌及其在西柚发酵和。

8、化妆品中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新型的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5， 还涉及该短乳 杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5在西柚发酵中的应用以及所得的西柚发酵产品在化妆 品中的应用， 属于生物发酵技术领域。 技术背景 0002 西柚， 又称葡萄柚， 原产于西印度群岛， 属芸香科柑桔属植物， 由橙和柚天然杂交 而成， 果肉分白色、 红色、 粉红色3种， 其主产国为美国、 以色列、 阿根廷、 南非， 美国的产量居 全世界之首。 我国近些年才开始引种， 它集柚子和甜橙优点于一身， 果实多具特殊香气， 果 肉柔嫩， 味偏酸、 带苦。

9、味及麻舌味， 但口感舒适， 具有较高的营养价值和药用价值， 深受国内 老百姓的喜爱。 李时珍在 本草纲目 中记载：“柚， 功能消食， 解酒毒， 去肠胃中恶气， 长发滋 燥， 疗妊妇不思食口淡” 。 柚中含有多种对人体健康有益的活性物质， 如黄酮类化合物、 柠檬 苦素类化合物和精油等。 现代医学研究表明， 柚皮提取物具有抗氧化、 清除自由基、 抗癌、 抗 衰老、 抑酶、 降血糖和降血压等多种功能活性。 0003 迄今为止， 关于发酵柚子的研究较多， 如中国专利CN201611083380.5公开了一种 美容养颜的柚子果醋及其在化妆品中的应用， 将去皮得到的柚子果浆经过酶解， 加入食用 酒精， 再。

10、经过浸提压榨处理后， 接入醋酸菌进行二级发酵， 得到的滤液即为柚子果醋， 可饮 用及应用到化妆品中。 0004 中国专利CN201611083386.2公开了一种抗衰老柚子保健果酒及其在化妆品中的 应用， 将新鲜柚子去皮打成果浆， 加入柚苷酶脱苦， 再混入双孢蘑菇菌丝粉末， 搅拌均匀后 加入酵母菌发酵， 结束后经过处理、 过滤、 灭菌， 即获得柚子果酒， 可作为一种功效添加剂应 用在化妆品中， 起到营养滋润、 美容功能。 0005 中国专利CN201710816592.8公开了一种美容综合酵素饮品及其制备方法， 将葡萄 柚等水果蔬菜分别单独经过酵母菌、 醋酸菌二次发酵后调配制得， 一方面促进了。

11、水果蔬菜 中原有有效成分的析出， 另一方面水果蔬菜经微生物发酵转化成其他功能因子。 0006 中国专利CN108852957A公开了一种保湿、 美白、 消炎、 抗痘酵素面膜及其制备方 法， 采用西柚皮、 橘子皮、 香蕉皮、 金银花、 菊花叶、 玫瑰花、 金盏花、 薄荷及马齿苋为原料， 酶 解后， 接入酵母菌和乳酸菌的一种或者几种发酵制成水果皮酵素和花草药物酵素， 再与增 稠剂、 成膜剂及生物防腐剂按一定的比例混合搅拌均匀制得保湿、 美白、 消炎、 抗痘酵素面 膜。 此发明使用的原料较多， 菌种不固定， 批次间可能差异性较大， 且没有提供有效的功效 数据， 没有将发酵前后功效进行对比。 0007。

12、 上饶师范学院对马家柚果酒进行了研究， 确定了最佳发酵工艺， 并对比了发酵前 后抗氧化活性， 马家柚果汁、 马家柚果酒及添加马家柚叶芽的果酒对O2-的清除率最高分别 为26.6、 34.5和43.0， 对H2O2的清除率最高分别为21.7、 29.0和37.6。 0008 综上所述， 目前市场上的西柚类的发酵产品主要存在以下不足： 0009 1.原料主要来源是去皮的西柚， 而有着丰富植物黄酮的皮被直接废弃掉； 说明书 1/11 页 3 CN 111808769 A 3 0010 2.西柚类发酵原料主要应用于食品领域， 化妆品领域涉及到的也多为美容饮品； 0011 3.多数西柚类发酵产品常采用食。

13、品领域评价手段仅从外观状态、 口感等为导向来 评价发酵过程， 而忽略了最为重要的以产品的化妆品功效来指导发酵过程， 多数西柚类发 酵产品缺少产品功效数据， 而这些是应用到化妆品领域十分重要因素； 0012 4.已有西柚类发酵专利大都采用多步发酵、 混合发酵， 中间过程难以控制导致工 艺难以放大， 产品稳定性难以保证， 另一方面， 发酵周期普遍较长， 效率不高。 发明内容 0013 针对现有技术中存在的问题， 本发明筛选得到了一株性能优异的短乳杆菌， 使用 这株短乳杆菌制备西柚发酵提取液， 生产周期短、 产品稳定， 且活性物质含量高、 安全健康 符合化妆品原料的要求。 所得西柚发酵提取液具有良好。

14、的抗氧化、 美白、 抗炎效果。 0014 本发 明 从 泡 菜中 经 过自 行 筛 选 得 到 了 一 株发 酵 性能 优 异的 短 乳 杆 菌 (Lactobacillus brevis)， 该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)命名为短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)L-Z-5， 已于2020年6月17日在中国典型培养物保藏中心进行保 藏， 地址： 湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学， 保藏编号CCTCC NO:M 2020211。 该短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)L-Z-5的16s DNA基因序列如SEQ ID NO： 1所示。 0。

15、015 本发明上述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)命名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5， 可以用于西柚发酵产品的制备， 既可以用于发酵西柚皮， 也可以用于发酵西 柚果肉， 发酵得到的西柚产品中有机酸和氨基酸种类和含量多， 与现有其他短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)相比具有更好的抗炎、 美白和抗氧化效果， 性能突出。 0016 进一步的， 该短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5在使用时， 可以通过培养基 进行扩大培养， 以得到所需数量的菌种， 其最佳培养温度为30-37。 在本发明某一具体 实施方。

16、式中， 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种通过液体的种子培养基进行扩 大培养， 扩大培养后离心去除上清液， 得到短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种； 优选的， 种子培养基的配方为： 碳源2-5wt、 氮源1.5-3wt、 无机盐0.2-0.7wt， 水余量。 所述碳源为微生物培养常用碳源， 如果糖、 蔗糖、 葡萄糖、 麦芽糊精等， 所述氮源为微生物培 养常用氮源， 如牛肉膏、 蛋白胨、 酵母粉、 黄豆粉等， 所述无机盐为磷酸氢二钾、 硫酸锰等。 0017 本发明提供了一种西柚发酵提取液的制备方法， 该方法包括采用上述短乳杆菌 (L。

17、actobacillus brevis)L-Z-5发酵西柚果浆的步骤。 0018 进一步的， 上述方法包括以下步骤： 0019 (1)将西柚打浆， 所得果浆静置， 自然发酵至pH不再变化； 0020 (2)将上述自然发酵后的果浆、 氮源、 碳源、 无机盐和水混合， 配成含果浆的培养 液； 0021 (3)将短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5和酶加入上述含果浆的培养液中， 发酵至pH不再变化， 得发酵液； 0022 (4)将发酵液除杂、 除菌， 得到西柚发酵提取液。 0023 进一步的， 步骤(1)中， 以整个西柚为原料， 在打浆之前， 可以将西柚进行清洗的预 处理，。

18、 洗干、 晾干的西柚可以采用榨汁机等器械进行打浆， 所得果浆利用其内生菌进行自然 发酵。 静置的温度为1525， 自然发酵至pH不再变化时停止自然发酵， 所需时间一般为1 说明书 2/11 页 4 CN 111808769 A 4 3d。 0024 进一步的， 自然发酵后的果浆进一步与氮源、 碳源、 无机盐等进行混合， 配成用于 短乳杆菌发酵的含果浆的培养液。 培养液中的自然发酵后的果浆、 氮源、 碳源、 无机盐、 水的 混合顺序随意， 可以先将自然发酵后的果浆与水混合， 再加入氮源、 碳源、 无机盐， 也可以先 将氮源、 碳源、 无机盐加入水中， 再加入自然发酵后的果浆， 还可以将自然发酵后。

19、的果浆、 氮 源、 碳源、 无机盐同时加入水中。 优选的， 先将氮源、 碳源、 无机盐加入水中， 灭菌后再加入自 然发酵后的果浆， 这样既能保护果浆中的营养成分不受破坏， 又能灭除杂菌， 降低染菌概 率， 保证纯种发酵， 稳定产品质量。 灭菌可以采用现有技术中报道的各种可行的灭菌方式， 例如湿热灭菌等。 0025 进一步的， 步骤(2)中， 在配好的含果浆的培养液中， 自然发酵后的果浆的质量百 分含量为10-30， 氮源的质量百分含量为0.1-2， 碳源的质量百分含量为0.1-2， 无机 盐的质量百分含量为0.02-0.2。 其中， 所述氮源为微生物培养常用氮源， 如牛肉膏、 蛋白 胨、 酵母。

20、粉、 大豆肽粉等， 所述碳源为微生物常用碳源， 如葡萄糖、 蔗糖、 果糖、 麦芽糊精等， 所述无机盐为磷酸氢二钾、 硫酸锰等。 0026 进一步的， 步骤(3)中， 短乳杆菌加入含果浆的培养液中用于进一步发酵， 酶加入 含果浆的培养液中用于对果浆中的果胶和纤维素进行酶解， 以充分释放出有效成分。 短乳 杆菌和酶的加入顺序无特别要求， 可以先配好含果浆的培养液， 然后再加入短乳杆菌和酶， 也可以先加入酶或短乳杆菌， 再配成含果浆的培养液， 还可以同时加入短乳杆菌和酶然后 再配成含果浆的培养液。 0027 进一步的， 步骤(3)中， 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌。

21、种的接种量(以 短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5细胞计)为含果浆的培养液的0.5-1wt。 短乳杆 菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5菌种可以通过上述扩大培养的方式得到足够量的菌种。 0028 进一步的， 步骤(3)中， 所述酶为纤维素酶和果胶酶， 优选的， 纤维素酶的酶活为5- 10万U/g， 果胶酶的酶活为10-20万U/g。 在此酶活下， 纤维素酶和果胶酶的添加量均为自然 发酵后的果浆质量的0.002-0.2wt， 纤维素酶和果胶酶的添加量比例为1:100-100:1。 0029 进一步的， 步骤(3)中， 接入菌种后， 在30-37进。

22、行发酵培养， 同时进行酶解， 发酵 至pH不变时结束。 一般发酵时间为4048h。 0030 进一步的， 步骤(4)中， 发酵所得发酵液通过过滤、 离心等方式除杂、 除菌。 0031 进一步的， 按照本发明方法制得的西柚发酵提取液中无机酸和氨基酸含量高、 种 类多， 与采用其他方法发酵得到的提取液相比抗炎、 抗氧化、 美白作用更佳， 对IL-6、 TNF- 、 IL-1 三种炎性因子均具有良好的抑制作用。 因此， 本发明所得的西柚发酵提取液可以用于 化妆品中， 作为化妆品的抗炎、 抗氧化或美白成分。 0032 本发明具有以下优点： 0033 1、 本发明提供的西柚发酵提取液制备方法基于传统发酵。

23、技术进行改进， 先通过西 柚内生菌自然发酵将西柚中不溶性的蛋白等大分子物质转化成了可溶性小分子氨基酸等， 再通过本发明特殊的短乳杆菌发酵， 可产生-氨基丁酸、 有机酸等多种活性成分， 所得发 酵液的抗炎、 抗氧化、 美白效果更佳； 0034 2、 未经发酵的西柚只对炎性因子IL-1 有抑制作用， 对炎性因子IL-6、 TNF- 无抑 制作用， 经本发明发酵后， 发酵液对IL-6、 TNF- 、 IL-1 炎性因子均有良好的抑制作用， 且对 说明书 3/11 页 5 CN 111808769 A 5 IL-1 抑制作用大大提高； 0035 3、 本发明将整个西柚进行液体发酵， 以发酵提取液作为最。

24、终产品， 可将西柚原料 及西柚发酵液全部充分利用， 工艺简单， 操作简便， 成本低， 能实现大规模生产。 0036 保藏信息 0037 本发明所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5已保藏于中国典型培养物保 藏中心， 保藏编号为CCTCC NO:M 2020211， 保藏日期为2020年6月17日， 保藏地址为湖北省 武汉市武昌珞珈山武汉大学。 具体实施方式 0038 下面结合实施例对本发明做进一步说明， 但本发明不受下述实施例的限制。 0039 称取1-5万U/g的纤维素酶和10-20万U/g的果胶酶分别配制成纤维素酶液和果胶 酶酶液， 酶液中纤维素酶活力为5万U/。

25、mL， 果胶酶活力为10万U/mL， 供实施例与对比例中使 用， 纤维素酶和果胶酶为市购。 0040 实施例1短乳杆菌(Lactobacillus brevis)L-Z-5筛选及鉴定过程 0041 以市售泡菜汁、 干酪、 酸乳酒和牛奶为原料， 将市售泡菜汁、 酸乳酒和牛奶用无菌 水稀释100倍， 将干酪用100质量倍无菌水分散， 用涂布器将各溶液均匀涂布在含0.04溴 甲基酚紫的MRS平板上， 于37培养箱中静置培养12d， 挑选菌落周围培养基颜色变为黄 色的单菌落， 接种于MRS试管斜面上， 于37培养箱中静置培养12d， 菌体长好后， 于4冰 箱保藏。 其中， 泡菜汁筛选得到的菌种命名为L。

26、-Z-5， 干酪筛选得到的菌种命名为L-Z-101， 酸乳酒筛选得到的菌种命名为L-Z-1.3， 牛奶筛选得到的菌种命名为L-Z-1.1。 0042 将筛选得到的四株菌种送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因组 测序鉴定， 结果显示这四株菌种均为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)， 其中短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)L-Z-5的16s rDNA基因序列测定结果如SEQ ID NO： 1所示。 0043 实施例2菌种的扩大培养 0044 对上述自行筛选得到的短乳杆菌L-Z-5、 L-Z-101、 L-Z-1.3以及L-Z-1.1进行扩大 培养，。

27、 以用于后续实验。 方法如下： 0045 从试管挑取短乳杆菌L-Z-5、 L-Z-101、 L-Z-1.3和L-Z-1.1， 分别接种于500mL含有 葡萄糖2wt、 蛋白胨1wt、 酵母粉1wt、 磷酸氢二钾0.2wt、 硫酸锰0.02wt的无菌种 子培养液中， 37下静置培养13h， 至对数生长期， 再次接种扩培到5L无菌种子培养液中， 二 次培养10h后至对数期， 以8000rpm离心30min后弃掉上清液， 获得上述四种短乳杆菌鲜细 胞。 0046 实施例3 0047 将整个西柚洗净、 晾干后， 经粉碎机打成浆状， 得到西柚果浆。 将西柚果浆20下 静置2d， 利用其内生菌自然发酵， 。

28、pH不再变化后， 取20kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的 培养液中混匀， 培养液中含1wt蛋白胨， 1wt蔗糖， 0.1wt磷酸氢二钾。 将实施例2中的 短乳杆菌L-Z-5菌体接入， 接种量为1wt， 同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的 0.1wt)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.1wt)， 32发酵44h， pH不再变化后， 发酵结束， 获得发酵液。 发酵液以3000rpm离心去除杂质， 上清液再以0.22 m聚醚砜滤芯过 滤， 得西柚发酵提取液S1。 说明书 4/11 页 6 CN 111808769 A 6 0048 实施例4 0049 将整个西柚洗净， 晾干后， 经粉。

29、碎机打成浆状， 得到西柚果浆。 将西柚果浆15下 静置3d， 利用其内生菌自然发酵， pH不再变化后， 取20kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的 培养液中混匀， 培养液中含2wt大豆肽粉， 0.1wt葡萄糖， 0.2wt磷酸氢二钾。 将实施例 2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入， 接种量为0.5wt， 同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质 量的0.2wt)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.002wt)， 37发酵42h， pH不再 变化后， 发酵结束， 获得发酵液。 发酵液以3000rpm离心去除杂质， 上清液再以0.22 m聚醚砜 滤芯过滤， 得西柚发酵提取液S2。 0050 实施例5。

30、 0051 将整个西柚洗净， 晾干后， 经粉碎机打成浆状， 得到西柚果浆。 将西柚果浆25下 静置1d， 利用其内生菌自然发酵， pH不再变化后， 取10kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的 培养液中混匀， 培养液中含0.1wt酵母粉， 2wt果糖， 0.02wt硫酸锰。 将实施例2中的短 乳杆菌L-Z-5菌体接入， 接种量为0.8wt， 同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的 0.002wt)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.2wt)， 30发酵48h， pH不再变化 后， 发酵结束， 获得发酵液。 发酵液以3000rpm离心去除杂质， 上清液再以0.22 m聚醚砜滤芯 过滤， 得西。

31、柚发酵提取液S3。 0052 实施例6 0053 将整个西柚洗净， 晾干后， 经粉碎机打成浆状， 得到西柚果浆。 将西柚果浆20下 静置2d， 利用其内生菌自然发酵， pH不再变化后， 取30kg果浆加入到100L灭菌冷却至室温的 培养液中混匀， 培养液中含1wt牛肉膏， 1.5wt麦芽糊精， 0.05wt硫酸锰。 将实施例2中 的短乳杆菌L-Z-5菌体接入， 接种量为1wt， 同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的 0.15wt)和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.1wt)， 35发酵40h， pH不再变化 后， 发酵结束， 获得发酵液。 发酵液以3000rpm离心去除杂质， 上清液再以。

32、0.22 m聚醚砜滤芯 过滤， 得西柚发酵提取液S4。 0054 对比例1 0055 将整个西柚洗净， 晾干后， 经粉碎机打成浆状， 得到西柚果浆。 取2kg果浆， 加入到 10L灭菌冷却至室温的无菌水中混匀， 同时添加果胶酶酶液(果胶酶为果浆质量的0.1wt) 和纤维素酶酶液(纤维素酶为果浆质量的0.1wt)， 32反应44h， 获得酶解液。 酶解液以 3000rpm离心去除杂质， 上清液再以0.22 m聚醚砜滤芯过滤， 得西柚提取液C1。 0056 对比例2 0057 将实施例2中的短乳杆菌L-Z-5菌体接入含1wt蛋白胨， 1wt蔗糖， 0.1wt磷酸 氢二钾的无菌培养基中， 32发酵4。

33、4h， 无残糖后， 发酵结束， 获得发酵液。 发酵液以3000rpm 离心去除杂质， 上清液再以0.22 m聚醚砜滤芯过滤， 得L-Z-5菌种发酵提取液C2。 0058 对比例3 0059 按照实施例3的方法制备西柚发酵提取液， 不同的是： 将短乳杆菌L-Z-5菌体替换 为短乳杆菌L-Z-101菌体， 所得西柚发酵提取液命名为西柚发酵提取液C3。 0060 对比例4 0061 按照实施例3的方法制备西柚发酵提取液， 不同的是： 将短乳杆菌L-Z-5菌体替换 为短乳杆菌L-Z-1.3菌体， 所得西柚发酵提取液命名为西柚发酵提取液C4。 说明书 5/11 页 7 CN 111808769 A 7 。

34、0062 对比例5 0063 按照实施例3的方法制备西柚发酵提取液， 不同的是： 将短乳杆菌L-Z-5菌体替换 为短乳杆菌L-Z-1.1菌体， 所得西柚发酵提取液命名为西柚发酵提取液C5。 0064 试验例1有机酸含量检测 0065 以采用GB/T 12456中方法测定上述实施例和对比例所得样品的总酸含量， 结果如 表1所示。 0066 表1不同样品中总酸含量对比 0067 发酵提取液酸度() C10.21 C20.89 C30.92 C40.95 C50.88 S11.19 S21.15 S31.21 S41.12 0068 从表中可以看出， 本发明制备的西柚发酵提取液中的有机酸含量明显高于。

35、传统提 取法获得的样品， 本发明菌种发酵所得的有机酸含量明显高于其他同类型菌种， 有机酸在 化妆品中具有美白、 焕肤、 祛角质等作用， 而且有机酸产量越多， 证明菌种对西柚发酵越充 分。 0069 试验例2氨基酸含量检测 0070 以实施例3中的样品S1与对比例中的样品C1为实验样品， 采用HPLC柱前衍生化法 测定样品中游离氨基酸含量， 结果如表2所示。 0071 表2不同样品中氨基酸含量对比 0072 氨基酸C1(mg/mL)S1(mg/mL) 天冬氨酸0.0450.009 谷氨酸0.0250.085 丝氨酸0.0190.042 组氨酸-0.048 甘氨酸0.0010.018 苏氨酸0.0。

36、010.010 精氨酸0.033- 丙氨酸0.0110.019 酪氨酸-0.041 胱氨酸- 缬氨酸-0.016 甲硫氨酸0.0040.135 甲苯氨酸-0.077 说明书 6/11 页 8 CN 111808769 A 8 异亮氨酸-0.164 亮氨酸0.001- 赖氨酸0.001- 脯氨酸0.0370.072 0073 从上表结果来看， 经本发明菌种发酵后的西柚发酵提取液与传统提取法所得西柚 提取液相比， 绝大多数游离氨基酸含量都增加， 且游离氨基酸种类增加。 0074 试验例3抗炎、 抗氧化、 美白效果评价 0075 本试验旨在对上述实施例及对比例制得的样品进行抗炎、 抗氧化、 美白效果。

37、评价。 0076 1.抗炎活性 0077 采用小鼠巨噬细胞模型， 用LPS刺激其产生炎性因子， 考察样品是否能抑制炎性因 子的分泌。 0078 样品溶液的配制： 以(sigma， 025M4040V， 1万单位/mL)LPS作为稀释液， 分别将实施 例中的样品S1S4及对比例中的样品C1C5配制成体积浓度为3的溶液， 0.22 m滤膜过 滤除菌。 0079 空白对照组： 将Raw264.7细胞以1105个/mL接种于24孔板， 在37、 5CO2条件下 培养24h， 加入无血清培养基， 继续培养24h， 用ELISA试剂盒检测炎性因子。 0080 模型组： 将Raw264.7细胞以1105个/。

38、mL接种于24孔板， 在37、 5CO2条件下培养 24h， 加入与空白对照组无血清培养基等体积的LPS(sigma， 025M4040V， 1万单位/mL)， 继续 培养24h， 用ELISA试剂盒检测炎性因子。 0081 实验组： 将Raw264.7细胞以1105个/mL接种于24孔板， 在37、 5CO2条件下培养 24h， 加入与空白对照组无血清培养基等体积的样品溶液， 继续培养24h， 用ELISA试剂盒检 测炎性因子。 0082 计算各样品对炎性因子的抑制率， 计算方法如下： 0083 0084 试验结果如下： 0085 表3各样品对IL-6分泌的抑制作用 0086 IL-6浓度(。

39、pg/mL)抑制率() C1142.86-56.83 C2101.21-1.07 C3115.33-19.97 C4172.54-96.56 C5122.18-29.14 S155.7159.84 S256.9758.15 S360.0254.07 S461.3852.25 空白对照组25.71- 说明书 7/11 页 9 CN 111808769 A 9 模型组100.41- 0087 表4各样品对TNF- 分泌的抑制作用 0088 0089 0090 表5各样品对IL-1 分泌的抑制作用 0091 IL-1 浓度(pg/mL)抑制率() C118.0229.25 C222.01-2.90 。

40、C316.2143.84 C418.3526.60 C513.9761.89 S113.5865.03 S213.6964.14 S313.7163.98 S413.7163.98 空白对照组9.24- 模型组21.65- 0092 从上述结果来看， 在LPS的刺激下， 小鼠巨噬细胞的IL-6、 TNF- 、 IL-1 这三种促炎 性因子的分泌量有所增加， 经过各样品处理之后， 与未经西柚样品处理的LPS模型组相比， IL-6、 TNF- 、 IL-1 的分泌量有不同程度的变化， 说明样品对IL-6、 TNF- 、 IL-1 具有抑制作 用。 0093 其中， 未经过发酵的西柚提取液C1只对I。

41、L-1 的分泌有抑制作用， 且抑制率仅为 29.25， 经过L-Z-5发酵但是没有西柚做底物的L-Z-5发酵液C2对三种促炎性因子的分泌 均无抑制作用， 采用其他不同短乳杆菌发酵得到的西柚提取液C3-C5也只对IL-1 的分泌有 明显的抑制作用。 而经过本发明短乳杆菌L-Z-5发酵的西柚提取液S1-S4不仅对IL-1 的分 说明书 8/11 页 10 CN 111808769 A 10 泌有明显的抑制作用， 对IL-6、 TNF- 的分泌也产生明显的抑制作用。 由此可以看出， 不同的 处理方法、 不同的菌株对这三种炎性因子的抑制作用不同， 不是所有的菌株发酵西柚后都 能对这三种炎性因子都有良好。

42、的抑制作用。 0094 2.抗氧化活性 0095 2.1清除DPPH自由基试验 0096 0.1mM DPPH溶液配制： 精密称取4.0mg DPPH置100mL棕色容量瓶中， 用95乙醇溶 解并定容。 0097 不同浓度样品溶液配制： 以纯化水作为稀释液， 分别将实施例中的样品S1S4及 对比例中的样品C1C5配制成体积浓度为15的溶液。 0098 分别精密量取0.1mM DPPH溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中， 混 匀。 以等体积的水与95乙醇混合溶液为空白对照。 室温放置30分钟， 于523nm处分别测定 溶液吸光度值。 另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL。

43、和纯化水5.0mL混合， 操作同上。 计算 方法如下： 0099 0100 结果如表6所示。 0101 表6各样品清除DPPH自由基活性 0102 0103 由表中数据可知， 在添加1-5的浓度梯度下， 各样品均具有较高的清除DPPH自 由基的能力， 除了C2和C3外， 其他样品在5浓度时的DPPH自由基清除能力相当， 但在较低 的浓度时， S1-S4的样品表现出更好的DPPH自由基清除能力。 0104 2.2活性氧自由基清除试验 0105 样品溶液的配制： 以无血清DMEM培养液作为稀释液， 分别将实施例中的样品S1 S4和对比例中的样品C1C5配制成体积浓度为15的溶液， 0.22 m滤膜。

44、过滤除菌。 0106 二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针溶液的配制： 按0.375uL DCFH-DA:1mL PBS比 例稀释。 0107 取处于对数生长期的HaCaT细胞， 以5104个/mL密度接种于12孔培养板， 每孔2mL 说明书 9/11 页 11 CN 111808769 A 11 细胞悬液， 置二氧化碳培养箱37、 5CO2常规培养24h。 照射组弃去1mL培养液， 盖保鲜膜， UVA用2000 W/cm2的强度照射2-3h， UVB用700 W/cm2的强度照射7min， 对照组常规培养。 照射 后弃去旧培养液， 实验组加入样品溶液， 对照组加入无血清培养液， 每孔均为。

45、2mL， 继续培养 16h后， 弃去全部培养液， 用PBS洗两遍。 每孔加入1.5mL DCFH-DA溶液， 放入细胞培养箱中继 续孵育30min， 每隔5min混匀一次使探针充分结合。 弃去探针， 用预热的无血清培养基洗两 遍， 每孔加入1ml无血清培养基37孵育10min。 PBS洗一遍后， 胰酶消化细胞， PBS洗两遍， 300 L PBS重悬， 用流式细胞仪双通道检测(上机前细胞需要过滤)， FL1-H通道， 每个样品收 集10000个细胞。 0108 根据1通道(FL1-H)获取的信号数据， 用平均荧光强度(GMEAN)计算ROS清除率， 方 法如下： 0109 0110 统计学分析。

46、采用SPSS 19.0软件， 进行配对t检验。 结果如表7所示。 0111 表7各样品对活性氧自由基(ROS)的清除率 0112 0113 由表中数据可知， 在添加1-5的浓度梯度下， 样品S1S4和C1、 C3C5均对活 性氧自由基具有清除能力， 但本发明样品清除率明显高于其他样品。 0114 3.美白 0115 样品溶液的配制： 以含血清完全培养液作为稀释液， 分别将实施例中的样品S1 S4及对比例中的样品C1C5配制成体积浓度为2的溶液， 0.22 m滤膜过滤除菌。 0116 取对数生长期B16小鼠黑色素瘤细胞， 以2104个/mL密度接种于6孔培养板， 每孔 3mL， 置二氧化碳培养箱。

47、37、 5CO2培养24h， 弃去旧培养液， 正常对照组和模型组加入3mL 含血清培养液， 实验组加入3mL样品溶液， 模型组和实验组每孔再加入60 L毛喉素溶液 (2mM)， 以刺激黑色素的产生， 继续培养72h。 0117 细胞内黑色素含量的测定方法如下： 胰酶消化， 离心去上清， 加入1mol/L(含10 DMSO)的NaOH溶液500uL裂解细胞， 80加热30min后， 3000rpm离心10min， 取上清加入96孔 板， 100uL/孔， 测定450nm吸光度。 说明书 10/11 页 12 CN 111808769 A 12 0118 黑色素总含量抑制率计算方法如下。 0119。

48、 0120 表8各样品对黑色素含量的影响 0121 样品黑色素总含量抑制率/ C15.34 C21.32 C310.09 C411.54 C59.15 S127.35 S225.94 S327.98 S425.49 0122 从表中结果可以看出， 本发明的样品对黑色素总含量抑制率大大提高， 美白效果 明显， 而其他样品的黑色素抑制率不明显。 说明书 11/11 页 13 CN 111808769 A 13 序列表 华熙生物科技股份有限公司、 山东华熙海御生物医药有限公司 一种短乳杆菌及其在西柚发酵和化妆品中的应用 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1500 DNA 短乳杆。

49、菌(Lactobacillus brevisL-Z-5) 1 tcaggacgaa cgctggcggc atgcctaata catgcaagtc gaacgagctt ccgttgaatg 60 acgtgcttgc actgatttca acaatgaagc gagtggcgaa ctggtgagta acacgtggga 120 aatctgccca gaagcagggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaacaa 180 aatccgcatg gattttgttt gaaaggtggc ttcggctatc acttctggat gatcc。

50、cgcgg 240 cgtattagtt agttggtgag gtaaaggccc accaagacga tgatacgtag ccgacctgag 300 agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta 360 gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaatg ccgcgtgagt gaagaagggt 420 ttcggctcgt aaaactctgt tgttaaagaa gaacaccttt gagagtaact gttcaagggt 480 tgacggtatt。