杆状病毒表达系统及其构建方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010716613.0 (22)申请日 2020.07.23 (71)申请人 云舟生物科技 （广州） 有限公司 地址 510000 广东省广州市广州高新技术 产业开发区科学城掬泉路3号广州国 际企业孵化器 （D区） D301-D309号房 (72)发明人 施金秀罗燕林映君蒙伟能 叶知晟蓝田 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 戴志攀 (51)Int.Cl. C12N 15/866(2006.01) C12N 5/10(2006.01。

2、) C12P 21/00(2006.01) (54)发明名称 杆状病毒表达系统及其构建方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种杆状病毒表达系统及其构 建方法和应用， 包括杆状病毒穿梭载体、 辅助载 体和供体载体； 所述杆状病毒穿梭载体上含有 Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒； 所述辅助载 体上含有抗毒素蛋白基因表达盒， 所述抗毒素蛋 白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素 蛋白的毒性， 所述辅助载体和所述供体载体的复 制子均为温敏型复制子， 所述供体载体包含转座 子Tn7的左右侧翼序列。 利用本发明的杆状病毒 表达系统， 可快速直接地提取得到一种能够直接 用于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的。

3、重组 阳性杆状病毒载体。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 111808884 A 2020.10.23 CN 111808884 A 1.一种杆状病毒表达系统， 其特征在于， 包括杆状病毒穿梭载体、 辅助载体和供体载 体； 所述杆状病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒； 所述辅助载体上含有 抗毒素蛋白基因表达盒， 所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白 的毒性； 所述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子； 所述供体载体包含转 座子Tn7的左右侧翼序列。 2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统， 其特征在于， 所述温敏型复制子为pSC101。

4、 ori、 pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复制子。 3.根据权利要求1所述的杆状病毒表达系统， 其特征在于， 所述毒素蛋白选自RelE、 MazF、 ParE、 Doc、 YafQ、 VapC、 HicA、 CcdB、 Axe、 YefM、 RelJ、 HigB和HipA中的一种， 所述抗毒素 蛋白对应地选自RelB、 MazE、 ParD、 Phd、 DinJ、 VapB、 HicB、 CcdA、 Txe、 YoeB、 RelK、 HigA和HipB 中的一种。 4.根据权利要求3所述的杆状病毒表达系统， 其特征在于， 所述毒素蛋白为CcdB， 所述 抗毒素蛋白为CcdA。 5.根据。

5、权利要求1所述的杆状病毒表达系统， 其特征在于， 所述杆状病毒穿梭载体上还 含有第一抗生素抗性基因， 所述供体载体上还含有第二抗生素抗性基因。 6.根据权利要求5所述的杆状病毒表达系统， 其特征在于， 所述第一抗生素抗性基因为 卡那霉素抗性基因， 所述第二抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。 7.一种权利要求16任一项所述的杆状病毒表达系统的构建方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 提供Bacmid载体、 pHelper载体和pFastBac载体； 将所述pHelper载体和所述pFastBac载体的复制子均替换为所述温敏型复制子； 在所述pHelper载体中插入所述抗毒素蛋白基因表达盒； 将。

6、所述Bacmid载体上的LacZ 片段替换为毒素蛋白基因表达盒。 8.权利要求16任一项所述的杆状病毒表达系统在表达目的蛋白中的应用。 9.一种蛋白表达试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求16任一项所述的杆状病毒表达 系统和感受态制备试剂。 10.一种目的蛋白的表达方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提供权利要求16任一项所述的杆状病毒表达系统； 将目的蛋白的基因序列插入所述供体载体； 将所述杆状病毒穿梭载体、 所述辅助载体和含有所述目的蛋白的基因序列的所述供体 载体转化到细菌中， 接种后在所述温敏型复制子能够复制的温度条件下培养1224小时； 挑取单克隆接种， 然后在所述温敏型复制子不能复。

7、制的温度条件下培养1224小时； 收集培养产物并进行质粒提取， 然后转染到昆虫细胞中进行目的蛋白的表达。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111808884 A 2 杆状病毒表达系统及其构建方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及蛋白表达技术领域， 特别是涉及一种杆状病毒表达系统及其构建方法 和应用。 背景技术 0002 基于苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System,BE。

8、VS)是一种可在昆虫细胞中大规模表达外源重组蛋白的最 通用和最强大的真核表达系统之一， 自1985年在该系统中首次实现IL-2蛋白的大规模生产 以来便得到了广泛的应用。 与其他重组蛋白表达系统相比， 重组杆状病毒表达系统具有明 显的优势： 1)安全性高： 宿主局限于特定的无脊椎动物， 对哺乳动物和植物无致病性； 2)易 于扩大生产规模： 可用初始得到的重组杆状病毒感染更多的昆虫细胞， 从而获得更高的病 毒滴度； 3)高水平及可溶性表达： 可实现外源蛋白的高水平表达， 在大多数情况下， 重组蛋 白是可溶的， 且易于从感染细胞中纯化回收； 4)修饰及折叠的准确性： 重组杆状病毒载体可 利用昆虫细胞。

9、的翻译后修饰系统对外源蛋白进行正确的修饰及折叠， 从而得到具有生物活 性的重组蛋白； 5)悬浮培养： 现有的细胞系在悬浮培养中生长良好， 因此可在大规模生物反 应器中生产重组蛋白； 6)低成本： 昆虫细胞无血清培养大大降低了生产成本。 0003 杆状病毒穿梭载体系统是目前应用最广泛的一种基于Tn7转座的BEVS克隆系统， 也被称为Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统。 该系统包括三个主要成分： 1)杆状病毒穿梭 载体， 又称为Bacmid载体， 含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因 编码区的mini-attTn7位点， 可在大肠杆菌中进行复制增殖； 2)辅助载体p。

10、Helper， 表达Tn7 转座酶； 3)pFastBac供体载体， 包含转座位点Tn7R和Tn7L， 以及两者之间的庆大霉素抗性基 因(Gen)表达盒和外源基因表达盒。 Bacmid和辅助载体pHelper共存于DH10Bac菌株中， 当克 隆了外源基因的pFastBac转化到DH10Bac菌株后， 辅助载体pHelper表达的转座酶可介导 pFastBac载体上Tn7R和Tn7L的之间的区域转座到Bacmid中的mini-attTn7位点， 然后通过 庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆。 0004 但是， 利用传统的Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统所得到的表达外源基因的 。

11、Bacmid DNA是一种混合的质粒， 其中包含了供体载体、 辅助载体、 未转座的Bacmid载体以及 重组阳性Bacmid载体。 若直接用于转染昆虫细胞进行杆状病毒包装， 污染质粒(供体载体和 辅助载体)会以高达25的非同源重组率整合到Bacmid病毒基因组中， 引起病毒基因组的 大片段缺失， 并被包装到子代病毒颗粒中。 同时， 这也不利于计算杆状病毒包装过程中 Bacmid DNA的精确加入量， 导致包装体系非最优。 虽然将转座重组产物提纯后重新电转感 受态能够筛选得到纯化的菌株， 然而该过程操作繁琐， 耗时费力， 大大降低了工作效率。 发明内容 0005 基于此， 有必要提供一种可快速直。

12、接得到高纯度重组Bacmid载体的杆状病毒表达 说明书 1/7 页 3 CN 111808884 A 3 系统。 0006 一种杆状病毒表达系统， 包括杆状病毒穿梭载体、 辅助载体和供体载体； 所述杆状 病毒穿梭载体上含有Tn7靶位点和毒素蛋白基因表达盒； 所述辅助载体上含有抗毒素蛋白 基因表达盒， 所述抗毒素蛋白能够与所述毒素蛋白结合从而中和所述毒素蛋白的毒性， 所 述辅助载体和所述供体载体的复制子均为温敏型复制子； 所述供体载体包含转座子Tn7的 左右侧翼序列。 0007 本发明的杆状病毒表达系统的作用机制如下： 在温敏型复制子能够复制的体系温 度的情况下， 将克隆了目的基因的供体载体转化。

13、到含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的大 肠杆菌中， 通过辅助载体表达的转座酶介导的重组反应， 将目的基因表达盒转座到杆状病 毒穿梭载体中。 重组反应完成后， 将体系温度变化为温敏型复制子不能复制的温度， 辅助载 体与供体载体会停止复制， 从而随着大肠杆菌的分裂增殖而逐渐丢失。 此时， 由于辅助载体 丢失引起的抗毒素蛋白缺失， 使得杆状病毒穿梭载体表达的毒素蛋白无法被中和， 从而导 致含有未发生转座重组的杆状病毒穿梭载体的菌株产生致死效应。 而已发生转座重组的阳 性杆状病毒穿梭载体上的毒素蛋白基因无法正常表达， 那么存活下来的菌株中仅仅包含已 发生转座重组的阳性杆状病毒穿梭载体， 最终可快速直接地。

14、提取得到一种能够直接用于下 游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。 0008 在其中一个实施例中， 所述温敏型复制子为pSC101 ori、 pBBR1MCS2-Ts复制子或 RK2复制子。 0009 在其中一个实施例中， 所述毒素蛋白选自RelE、 MazF、 ParE、 Doc、 YafQ、 VapC、 HicA、 CcdB、 Axe、 YefM、 RelJ、 HigB和HipA中的一种， 所述抗毒素蛋白对应地选自RelB、 MazE、 ParD、 Phd、 DinJ、 VapB、 HicB、 CcdA、 Txe、 YoeB、 RelK、 HigA和HipB中的一种。 001。

15、0 在其中一个实施例中， 所述毒素蛋白为CcdB， 所述抗毒素蛋白为CcdA。 0011 在其中一个实施例中， 所述杆状病毒穿梭载体上还含有第一抗生素抗性基因， 所 述供体载体上还含有第二抗生素抗性基因。 0012 在其中一个实施例中， 所述第一抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因， 所述第二 抗生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。 0013 本发明还提供了一种上述杆状病毒表达系统的构建方法， 包括以下步骤： 0014 提供Bacmid载体、 pHelper载体和pFastBac载体； 0015 将所述pHelper载体和所述pFastBac载体的复制子均替换为所述温敏型复制子； 0016 在所述pH。

16、elper载体中插入所述抗毒素蛋白基因表达盒； 0017 将所述Bacmid载体上的LacZ 片段替换为毒素蛋白基因表达盒。 0018 本发明还提供了一种上述杆状病毒表达系统在表达目的蛋白中的应用。 0019 本发明还提供了一种蛋白表达试剂盒， 包括上述杆状病毒表达系统和感受态制备 试剂。 0020 本发明还提供了一种目的蛋白的表达方法， 包括以下步骤： 0021 提供上述杆状病毒表达系统； 0022 将目的蛋白的基因序列插入所述供体载体； 0023 将所述杆状病毒穿梭载体、 所述辅助载体和含有所述目的蛋白的基因序列的所述 供体载体转化到细菌中， 接种后在所述温敏型复制子能够复制的温度条件下培。

17、养1224小 说明书 2/7 页 4 CN 111808884 A 4 时； 0024 挑取单克隆接种， 然后在所述温敏型复制子不能复制的温度条件下培养1224小 时； 0025 收集培养产物并进行质粒提取， 然后转染到昆虫细胞中进行目的蛋白的表达。 附图说明 0026 图1为实施例1中改造Bacmid载体的流程示意图； 0027 图2为实施例1和对比例1中的克隆流程示意图； 0028 图3为实施例1和对比例1提取的重组产物电泳图。 具体实施方式 0029 为了便于理解本发明， 下面将对本发明进行更全面的描述， 并给出了本发明的较 佳实施例。 但是， 本发明可以以许多不同的形式来实现， 并不限。

18、于本文所描述的实施例。 相 反地， 提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。 0030 除非另有定义， 本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的 技术人员通常理解的含义相同。 本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的， 不是旨在于限制本发明。 本文所使用的术语 “和/或” 包括一个或多个相 关的所列项目的任意的和所有的组合。 0031 术语解释 0032 转座酶， 执行转座功能的酶， 通常由转座子编码， 识别转座子两端的特异序列， 能 把转座子从相邻序列中脱离出来， 再插入到新的DNA靶位点， 无同源性要求。 0033 转座子，。

19、 又称跳跃基因， 一段可以从原位上单独复制或断裂下来， 环化后插入另一 位点， 并对其后的基因起调控作用的DNA序列。 0034 Tn7转座子， 是大肠杆菌中的一种位点特异性的转座子， 其必须的元件为Tn7-L(约 150bp)和Tn7-R(约90bp)。 任何片段只要带上了Tn7-L和Tn7-R这两个元件， 就可以在Tn7转 座蛋白的辅助下完成转座过程。 Tn7-L与Tn7-R序列不同， 它们决定了转座子插入的方向， Tn7的每个末端都含有约22bp的转座酶结合位点。 Tn7编码5个转做蛋白， 分别是TnsA,TnsB, TnsC,TnsD,TnsE。 其中TnsA和TnsB形成转座酶， 特。

20、异性识别转座子的末端， 并将Tn7从供体 上剪切下来， 形成转座酶双链DNA断裂， 然后将这些末端插入到目标位点中。 TnsC非特异的 结合DNA， 在ATP存在下， 会协助TnsA和TnsB完成剪切和插入过程。 0035 Gibson克隆技术， 非常适合用于拼接多个线性DNA片段， 也适合将目的DNA插入载 体中。 首先， 需要在DNA片段的末端加上同源片段(通过PCR法加上)； 然后， 将这些DNA片段和 一种master mix(含有三种酶)混合孵育一个小时。 这种master mix含有三种不同类型的 酶： 一种外切酶， 从5 端开始对DNA进行消化， 产生长的黏性末端， 这样便于与另。

21、外的同源末 端进行配对结合； 一种聚合酶， 用于修补gap； 一种DNA连接酶， 实现无痕拼接， 形成完整的 DNA分子。 0036 本发明一实施例的杆状病毒表达系统， 包括杆状病毒穿梭载体(Bacmid(ccdB)、 辅助载体(pHelper(ts+ccdA)和供体载体(pFastBac(ts)。 杆状病毒穿梭载体上含有Tn7 靶位点和毒素蛋白基因表达盒， 辅助载体上含有抗毒素蛋白基因表达盒， 抗毒素蛋白能够 说明书 3/7 页 5 CN 111808884 A 5 与毒素蛋白结合从而中和毒素蛋白的毒性。 辅助载体和供体载体的复制子均为温敏型复制 子， 供体载体包含转座子Tn7的左右侧翼序列。

22、。 0037 本发明为了能快速直接地得到高纯度、 无污染的重组阳性Bacmid载体， 对Bac-to- Bac杆状病毒表达载体系统进行了一系列改造， 包括引入温敏型复制子和毒素蛋白-抗毒素 蛋白系统。 一方面， 将供体载体和辅助载体的普通复制子替换为温敏型复制子， 携带该类型 复制子的质粒只能在特定温度范围稳定存在于大肠杆菌中， 当体系温度不在特定范围时， 该质粒会停止复制， 从而随着大肠杆菌的分裂增殖而逐渐丢失。 另一方面， 在重组前的 Bacmid载体中插入毒素蛋白基因表达盒， 在辅助载体中插入抗毒素蛋白基因表达盒。 当毒 素蛋白基因在大肠杆菌中单独表达时， 会使宿主菌株产生致死效应。 然。

23、而， 当毒素蛋白基因 和抗毒素蛋白基因在大肠杆菌中同时表达时， 两种蛋白会形成结构紧密的复合物， 从而中 和毒素蛋白的毒性， 使宿主菌株存活下来。 0038 综上所述， 改造后的杆状病毒表达系统的作用机制如下： 在温敏型复制子能够复 制的体系温度下， 将克隆了目的基因的供体载体转化到含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体 的大肠杆菌中， 通过辅助载体表达的转座酶介导的重组反应， 将目的基因表达盒转座到杆 状病毒穿梭载体中。 重组反应完成后， 将体系温度变化为温敏型复制子不能复制的温度， 辅 助载体与供体载体会停止复制， 从而随着大肠杆菌的分裂增殖而逐渐丢失。 此时， 由于辅助 载体丢失引起的抗毒素蛋白。

24、缺失， 使得杆状病毒穿梭载体表达的毒素蛋白无法被中和， 从 而导致含有未发生转座重组的杆状病毒穿梭载体的菌株产生致死效应。 而已发生转座重组 的阳性杆状病毒穿梭载体上的毒素蛋白基因无法正常表达， 那么存活下来的菌株中仅仅包 含已发生转座重组的阳性杆状病毒穿梭载体， 最终可快速直接地提取得到一种能够直接用 于下游杆状病毒包装的高纯度无污染的重组阳性杆状病毒载体。 0039 在一个具体示例中， 温敏型复制子选自pSC101 ori、 pBBR1MCS2-Ts复制子或RK2复 制子。 可以理解， 温敏型复制子的选择不限于此， 可根据需要调整。 0040 在一个具体示例中， 毒素蛋白选自RelE、 M。

25、azF、 ParE、 Doc、 YafQ、 VapC、 HicA、 CcdB、 Axe、 YefM、 RelJ、 HigB和HipA中的一种， 抗毒素蛋白对应地选自RelB、 MazE、 ParD、 Phd、 DinJ、 VapB、 HicB、 CcdA、 Txe、 YoeB、 RelK、 HigA和HipB中的一种。 优选地， 毒素蛋白为CcdB， 抗毒素 蛋白为CcdA。 0041 在一个具体示例中， 杆状病毒穿梭载体上还含有第一抗生素抗性基因， 供体载体 上还含有第二抗生素抗性基因。 可选地， 第一抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因， 第二抗 生素抗性基因为庆大霉素抗性基因。 可以理解， 。

26、抗性基因的选择不限于此， 可根据需要调 整。 0042 本发明一实施例的杆状病毒表达系统的构建方法， 包括以下步骤S1S4： 0043 S1、 提供Bacmid载体、 pHelper载体和pFastBac载体。 0044 S2、 将pHelper载体和pFastBac载体的复制子均替换为温敏型复制子。 0045 具体地， 可以采用Gibson克隆技术将供体载体pFastBac和辅助载体pHelper的普 通复制子替换为温敏型复制子。 0046 S3、 在pHelper载体中插入抗毒素蛋白基因表达盒。 0047 S4、 将Bacmid载体上的LacZ 片段替换为毒素蛋白基因表达盒。 0048 在。

27、一个具体示例中， 利用基于 噬菌体Red /Red /Red的DNA同源重组技术将 说明书 4/7 页 6 CN 111808884 A 6 Bacmid载体上的LacZ 片段替换为毒素蛋白基因表达盒。 具体地， 首先通过同源重组将 Bacmid载体上的LacZ 片段替换为两端包含同源臂的ccdB cassette-FRT-Amp cassette- FRT片段， 然后通过Flpe介导的位点特异性重组将FRT之间的Amp cassette删除。 0049 在一个具体示例中， 杆状病毒穿梭载体的构建方法包括以下步骤： 将同源重组酶 表达质粒pRed/ET(四环素抗性Tc)电转到仅含有Bacmid。

28、质粒(卡那抗性Kan)的DB3.1感受态 中， 加入SOC培养基于30复苏培养1小时； 复苏培养产物涂布到含有Tc+Kan抗生素的LB板 上， 30培养两天， 挑克隆PCR鉴定出同时含有pRed/ET和Bacmid质粒的阳性克隆； 挑取阳性 克隆接种到含有Tc+Kan抗生素的LB液体培养基中， 30过夜培养； 将过夜培养物按照1:100 的比例接种到含有Tc+Kan抗生素的新鲜LB培养基中， 30培养至OD600约0.3， 加入0.3 0.4的L-阿拉伯糖， 置于37诱导培养45分钟1小时； 将诱导产物制备成电转感受态， 加 入带同源臂的ccdB cassette-FRT-Amp casset。

29、te-FRT PCR产物进行电转， 加入SOC培养基 于37复苏培养1小时； 复苏培养产物涂布到含有Kan+Amp抗生素的LB板上， 37过夜培养， 挑克隆PCR鉴定出重组阳性克隆； 将707-FLPe(四环素抗性Tc)电转到上一步获得的阳性菌 株感受态细胞中， 加入SOC培养基于30复苏培养1小时； 复苏培养产物涂布到含有Kan+Tc 的LB板上， 30培养两天， 分别挑取几个克隆加入到含有Kan抗生素的LB培养液中， 30培 养23h； 将复苏培养产物在含有Kan抗生素的LB板上划线， 37过夜培养； 挑几个单克隆一 式两份， 分别加入到分别含有Kan、 Amp的2种LB培养基中， 37过。

30、夜培养； 取在含Amp的LB中 不长， 而在含Kan的LB液体中生长的克隆进行PCR鉴定， PCR阳性克隆即为改造后的杆状病毒 穿梭载体。 0050 在一个具体示例中， 构建方法还包括以下步骤： 将杆状病毒穿梭载体和辅助载体 共电 转感受态 ， PCR鉴定阳性克隆菌株 ， 得到优化型的Bac-to-Bac克隆菌株VB UltraDH10Bac， 保存甘油菌。 0051 本发明一实施例的目的蛋白的表达方法， 包括以下步骤S1S5： 0052 S1、 提供上述杆状病毒表达系统。 0053 S2、 将目的蛋白的基因序列插入供体载体。 0054 可选地， 利用Gibson克隆技术将目的蛋白的基因序列克。

31、隆到供体载体中。 0055 S3、 将杆状病毒穿梭载体、 辅助载体和含有目的蛋白的基因序列的供体载体转化 到细菌中， 接种后在温敏型复制子能够复制的温度条件下培养1224小时。 0056 S4、 挑取单克隆接种， 然后在温敏型复制子不能复制的温度条件下培养1224小 时。 0057 S5、 收集培养产物并进行质粒提取， 然后转染到昆虫细胞中进行目的蛋白的表达。 0058 可选地， 细菌为大肠杆菌， 昆虫细胞为Sf9细胞或Sf21细胞。 0059 以下通过具体实施例对本发明做进一步详细的描述。 0060 实施例1 0061 一、 构建杆状病毒表达载体系统 0062 采用Gibson克隆方法将pF。

32、astBac和pHelper的普通复制子替换为温敏型的pSC101 ori复制子， 然后在温敏型辅助质粒的基础上插入ccdA表达框， 即构建出优化型供体载体 pFastBac(ts)和辅助载体pHelper(ts+ccdA)。 0063 如图1所示， 将同源重组酶表达质粒pRed/ET(四环素抗性Tc)电转到仅含有Bacmid 说明书 5/7 页 7 CN 111808884 A 7 载体(卡那抗性Kan)的DB3.1感受态中， 加入SOC培养基于30复苏培养1小时。 0064 复苏培养产物涂布到含有Tc+Kan抗生素的LB板上， 30培养两天， 挑克隆PCR鉴定 出同时含有pRed/ET和B。

33、acmid载体的阳性克隆。 0065 挑取阳性克隆接种到含有Tc+Kan抗生素的LB液体培养基中， 30过夜培养。 0066 将过夜培养物按照1:100的比例接种到含有Tc+Kan抗生素的新鲜LB培养基中， 30 培养至OD6000.3， 加入0.30.4的L-阿拉伯糖， 置于37诱导培养45分钟1小 时。 0067 将诱导产物制备成电转感受态， 加入带同源臂的ccdB cassette-FRT-Amp cassette-FRT PCR产物进行电转， 加入SOC培养基于37复苏培养1小时。 0068 复苏培养产物涂布到含有Kan+Amp抗生素的LB板上， 37过夜培养， 挑克隆PCR鉴 定出重。

34、组阳性克隆。 0069 将707-FLPe(四环素抗性Tc)电转到步骤6获得的阳性菌株感受态细胞中， 加入SOC 培养基于30复苏培养1小时。 0070 复苏培养产物涂布到含有Kan+Tc的LB板上， 30培养两天。 分别挑取几个克隆加 入到含有Kan抗生素的LB培养液中， 30培养23h。 0071 将复苏培养产物在含有Kan抗生素的LB板上划线， 37过夜培养。 0072 挑几个单克隆一式两份， 分别加入到分别含有Kan、 Amp的2种LB培养基中， 37过 夜培养。 0073 取在含Amp的LB中不长， 而在含Kan的LB液体中生长的克隆进行PCR鉴定， PCR阳性 克隆即为改造后的Ba。

35、cmid(ccdB)载体。 0074 将纯化后的Bacmid(ccdB)和pHelper(ts+ccdA)质粒共电转DH10B感受态， PCR鉴定 含有两种质粒的阳性克隆菌株， 即得到优化型的Bac-to-Bac克隆菌株VB UltraDH10Bac， 保 存甘油菌。 0075 二、 应用 0076 首先利用Gibson克隆技术将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因克隆到供体载体 pFastBac(ts)中， 构建出pFastBac-EGFP(ts)， 然后转化到VB UltraDH10Bac菌株中进行转 座重组反应， 提取重组后DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳， 观察DNA形态。 结合图2所示， 。

36、具体操 作步骤如下： 0077 采用Gibson克隆技术构建pFastBac-EGFP(ts)。 0078 按照常规化学感受态制备方法制备VB UltraDH10Bac感受态。 0079 取浓度为10ng/ L的pFastBac-EGFP(ts)质粒1 L到VB UltraDH10Bac感受态中混 匀。 0080 冰浴30分钟， 42热激45秒， 立即冰浴2分钟。 0081 加入900 L SOC培养基， 30、 250rpm震荡培养4小时。 0082 取100 L复苏产物涂布到含有Kan+Gen抗生素的LB平板上， 30培养20小时。 0083 挑单克隆PCR鉴定阳性重组子。 0084 挑取。

37、阳性重组克隆接种到含有Kan+Gen抗生素的液体LB中， 37过夜培养。 0085 将过夜培养产物按照常规BAC抽提方法进行质粒提取。 0086 取1 L的质粒提取物进行琼脂糖凝胶电泳。 说明书 6/7 页 8 CN 111808884 A 8 0087 对比例1 0088 利用Gibson克隆技术将EGFP克隆到改造前供体载体pFastBac中， 构建出 pFastBac-EGFP， 然后转化到DH10Bac菌株中进行转座重组反应， 提取重组后DNA产物进行琼 脂糖凝胶电泳， 观察DNA形态。 如图2所示， 具体操作步骤如下： 0089 采用Gibson克隆技术构建pFastBac-EGFP。

38、。 0090 按照常规化学感受态制备方法制备DH10Bac感受态。 0091 取浓度为10ng/ L的pFastBac-EGFP质粒1 L到DH10Bac感受态中混匀。 0092 冰浴30分钟， 42热激45秒， 立即冰浴2分钟。 0093 加入900 L SOC培养基， 30、 250rpm震荡培养4小时。 0094 取100 L复苏产物涂布到含有Kan+Gen抗生素的LB平板上， 30培养20小时。 0095 挑单克隆PCR鉴定阳性重组子。 0096 挑取阳性重组克隆接种到含有Kan+Gen抗生素的液体LB中， 37过夜培养。 0097 将过夜培养产物按照常规BAC抽提方法进行质粒提取。 。

39、0098 分别取1 L的质粒提取物进行琼脂糖凝胶电泳。 0099 如图3所示， 泳道13为对比例1得到的三个不同的Bacmid-EGFP克隆， 泳道46为 实施例1得到的三个不同的Bacmid-EGFP克隆， 从中可以看到对比例1得到的质粒为混合物， 而实施例1得到的则是单一无污染的Bacmid-EGFP质粒。 0100 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合， 为使描述简洁， 未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述， 然而， 只要这些技术特征的组合不存 在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。 0101 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护 范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 7/7 页 9 CN 111808884 A 9 图1 说明书附图 1/3 页 10 CN 111808884 A 10 图2 说明书附图 2/3 页 11 CN 111808884 A 11 图3 说明书附图 3/3 页 12 CN 111808884 A 12 。