提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010925623.5 (22)申请日 2020.09.04 (71)申请人 武汉生之源生物科技股份有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东湖开发区高 新大道818号高科医疗器械园B11号1 楼、 2楼、 3楼 (72)发明人 李兰芝来祥兵舒芹赵愿安 (74)专利代理机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 11570 代理人 张晓冬 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/574(2006.01) G01N 33/577(200。

2、6.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 33/535(2006.01) G01N 33/58(2006.01) (54)发明名称 一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制 备方法 (57)摘要 本发明提供了一种提高GPC3检测灵敏度的 试剂盒及其制备方法， 属于免疫检测技术领域， 包括试剂M和试剂R， 所述试剂M通过磁珠微粒偶 联鼠抗人GPC3单克隆抗体稀释后制得， 磁珠微粒 直径为0.8m3m； 所述磁珠微粒偶联鼠抗人 G P C 3 单 克 隆 抗 体 的 稀 释 液 成 分 包 括 ： Proclin300、 缓冲液、 表面活性剂和蛋白； 所述试 剂R通过碱性磷酸。

3、酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体 稀释后制得。 该试剂盒具有更高的GPC3检测灵敏 度， 同时具有更宽的线性范围。 本发明还提供了 一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法。 权利要求书2页 说明书12页 CN 112014577 A 2020.12.01 CN 112014577 A 1.一种提高GP03检测灵敏度的试剂盒， 其特征在于， 包括试剂M和试剂R， 所述试剂M通 过磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经稀释后制得， 磁珠微粒直径为0.8 m3 m； 所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释后制成 试剂M， 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括： 。

4、Proclin300、 缓冲液、 表面活性剂和蛋 白； 所述试剂R通过碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体并经碱性磷酸酶标记抗体稀释 液稀释后制得。 2.根据权利要求1所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂M 中， 磁珠微粒与鼠抗人GPC3单克隆抗体的质量比为0.3 (0.20.5)； 所述试剂R中， 碱性磷酸酶与兔抗人GP03多克隆抗体的质量比为(0.250.5)(0.5 1)； 所述磁珠微粒与碱性磷酸酶的质量比为0.3 (0.250.5)。 3.根据权利要求1或2所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒， 其特征在于， 所述磁 珠微粒偶联抗体稀释液各成分的浓度。

5、为： Proclin300 0.030.1， 缓冲液： 0.020.05mol/L， 表面活性剂： 0.22， 蛋 白： 0.10.5， pH为7.08.0； 所述缓冲液包括PB缓冲液、 MOPS缓冲液、 TES缓冲液、 HEPES缓冲液和DIPSO缓冲液中的 任意一种； 所述表面活性剂包括Brij-35、 S9、 EmulgenA90和PEG-6000中的任意一种； 所述蛋 白为BSA或牛球蛋白。 4.根据权利要求3所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂M 中， 磁珠微粒直径为3 m； 所述磁珠微粒、 鼠抗人GPC3单克隆抗体、 碱性磷酸酶和兔抗人GPC3多克隆抗。

6、体的质量 比为0.3 0.5 0.5 0.5； 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括0.05Proclin300、 0.02mol/L的DIPSO缓冲 液、 2PEG-6000、 0.1牛球蛋白， pH7.4； 所述碱性磷酸酶标记抗体稀释液成分包括： 0.9氯化钠、 1mM六水合氯化镁、 0.1mM无 水氯化锌、 0.1牛血清白蛋白、 0.05Proclin300、 0.02MpH7.4的Tris-HCl缓冲液。 5.一种如权利要求1-4中任一项所述的提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法， 其 特征在于， 包括： 直径0.8 m3 m的磁珠微粒采用活化剂活化； 活化后的磁珠微粒加入鼠抗人G。

7、PC3单克隆抗体进行偶联反应； 偶联反应完成后加入甘氨酸溶液淬灭液进行反应， 反应完毕后洗涤、 重悬， 得到磁珠微 粒偶联抗体； 取碱性磷酸酶、 兔抗人GPC3多克隆抗体和戊二醛进行交联反应； 交联反应结束后加入乙醇胺反应， 反应完毕后进行透析， 得到碱性磷酸酶标记抗体。 6.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法， 其特征在于， 所述磁珠微粒在活化前采用PBS缓冲液重复洗涤， 所述活化工艺为： 洗涤完毕的磁珠微粒采 用PBS缓冲液重悬， 加入活化剂EDC反应30min， 活化完成后分离、 弃上清。 7.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法。

8、， 其特征在于， 权利要求书 1/2 页 2 CN 112014577 A 2 所述偶联反应为： 经活化的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体， 在室温进行偶联。 8.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法， 其特征在于， 所述甘氨酸溶液淬灭液浓度为1mol/L， pH8.0。 9.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法， 其特征在于， 所述交联反应为： 取碱性磷酸酶、 兔抗人GPC3多克隆抗体溶于生理盐水中， 加入1的戊二 醛， 在室温120rmp下反应15min后避光反应4h。 10.根据权利要求5所述的一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒。

9、的制备方法， 其特征在 于， 所述乙醇胺浓度为1mol/L， 加入乙醇胺后室温120rmp下反应2h， 反应完毕后， 混合溶液 在PBS缓冲液中4过夜透析， 用含1BSA且与透析后混合物等体积的甘油于-20保存。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112014577 A 3 一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于免疫检测技术领域， 涉及一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒及其制备 方法。 背景技术 0002 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3/Glypican-3(GPC3)是Glypican家族中的一员， 属于膜性硫 酸乙酰肝素多糖蛋白。 在哺乳动物的胚胎期， GPC。

10、3通过影响多个分子信号通路而对组织器 官的发育起到重要的调控作用， 其功能缺失将导致过度生长和畸变综合征(SGBS)。 成人 GPC3的异常表达与多种肿瘤的发生发展关系密切。 GPC3在肝细胞癌(HCC)中表达上调， 与 HCC的生物学特性相关， 在肝癌的早期诊断、 生物治疗和预后评估中具有良好的应用前景。 0003 GP03作为一个有价值的诊断肝癌的标志物已经得到了证实， 并已被 原发性肝癌 规范化病理诊断指南(2015) 、原发性肝癌规范化病理诊断方案专家共识 、原发性肝癌 诊疗规范(2019年版) 、EASL-EORTC Clinical Practice Guidelines： Man。

11、agement of Hepatocellular Carcinoma 和 2010年美国肝病年会(AASLD)肝细胞癌诊疗指南 )等作为 HCC公认的诊断指标。 0004 研究发现， 循环系统中， 游离的GPC3含量与GPC3阳性细胞数量相关， 检测血清中 sGPC3含量可间接反映体内GPC3阳性细胞数量水平。 0005 从目前各项指南的内容来看， 其接受、 推荐和建议的GPC3检测方法学为免疫组化 的方法， 来判断肝癌细胞和癌旁细胞， 以染色结果的阴阳性作为指示标准。 且大部分文献报 道中GPC3物质的检测方法为ELISA方法， 有少量文献中报道采用化学发光的检测方法检测 血清中GPC3的。

12、含量。 化学发光的检测方法灵敏度高、 线性范围广、 定量检测结果精确、 误差 小、 自动化程度高、 操作简便， 检测速度快， 一般30min内， 甚至15min内出结果。 0006 R&D的Human Glypican3检测试剂盒(Quantikine ELISA)厂家说明： 该试剂盒检测 时长4.5h， 血清加样量为(100uL)， 分析灵敏度为20.6pg/mL， 检测范围为78.1- 5000pg/mL， 精密度CV10。 发明内容 0007 为了解决现有GPC3检测试剂盒灵敏度不高的技术问题， 本发明提供了一种提高 GPC3 检测灵敏度的试剂盒， 该试剂盒具有更高的GPC3检测灵敏度，。

13、 同时具有更宽的线性范 围。 0008 本发明还提供了一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法。 0009 本发明通过以下技术方案实现： 0010 一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒， 包括试剂M和试剂R， 所述试剂M通过磁珠微粒 偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经稀释后制得， 磁珠微粒直径为0.8 m3 m； 0011 所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释后 制成试剂M， 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括： Proclin300、 缓冲液、 表面活性剂和 说明书 1/12 页 4 CN 112014577 A 4 蛋白； 0012 所述试剂R通过碱性磷。

14、酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体并经碱性磷酸酶标记抗体 稀释液稀释后制得。 0013 进一步的， 所述试剂M中， 磁珠微粒与鼠抗人GPC3单克隆抗体的质量比为0.3 (0.20.5)； 0014 所述试剂R中， 碱性磷酸酶与兔抗人GPC3多克隆抗体的质量比为(0.250.5) (0.51)； 0015 所述磁珠微粒与碱性磷酸酶的质量比为0.3 (0.250.5)。 0016 进一步的， 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液各成分的浓度为： 0017 Proclin300 0.030.1， 缓冲液： 0.020.05mol/L， 表面活性剂： 0.2 2， 蛋白： 0.10.5， pH为7.08.0； 0。

15、018 所述缓冲液包括PB缓冲液、 MOPS缓冲液、 TES缓冲液、 HEPES缓冲液和DIPSO缓冲液 中的任意一种； 所述表面活性剂包括Brij-35、 S9、 EmulgenA90和PEG-6000中的任意一种； 所 述蛋白为BSA或牛球蛋白。 0019 进一步的， 所述试剂M中， 磁珠微粒直径为3 m； 0020 所述磁珠微粒、 鼠抗人GPC3单克隆抗体、 碱性磷酸酶和兔抗人GPC3多克隆抗体的 质量比为0.3 0.5 0.5 0.5； 0021 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括0.05Proclin300、 0.02mol/L的DIPSO 缓冲液、 2PEG-b000、 0.1牛。

16、球蛋白， pH7.4； 0022 所述碱性磷酸酶标记抗体稀释液成分包括： 0.9氯化钠、 1mM六水合氯化镁、 0.1mM 无水氯化锌、 0.1牛血清白蛋白、 0.05Proclin300、 0.02M pH7.4的Tris-HCl缓冲 液。 0023 一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒的制备方法， 包括： 0024 直径0.8 m3 m的磁珠微粒采用活化剂活化； 0025 活化后的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体进行偶联反应； 0026 偶联反应完成后加入甘氨酸溶液淬灭液进行反应， 反应完毕后洗涤、 重悬， 得到磁 珠微粒偶联抗体； 0027 取碱性磷酸酶、 兔抗人GPC3多克隆抗体和戊。

17、二醛进行交联反应； 0028 交联反应结束后加入乙醇胺反应， 反应完毕后进行透析， 得到碱性磷酸酶标记抗 体。 0029 进一步的， 所述磁珠微粒在活化前采用PBS缓冲液重复洗涤， 所述活化工艺为： 洗 涤完毕的磁珠微粒采用PBS缓冲液重悬， 加入活化剂EDC反应30min， 活化完成后分离、 弃上 清。 0030 进一步的， 所述偶联反应为： 经活化的磁珠微粒加入鼠抗人GPC3单克隆抗体， 在室 温进行偶联。 0031 进一步的， 所述甘氨酸溶液淬灭液浓度为1mol/L， pH8.0。 0032 进一步的， 所述交联反应为： 取碱性磷酸酶、 兔抗人GPC3多克隆抗体溶于生理盐水 中， 加入1。

18、的戊二醛， 在室温120rmp下反应15min后避光反应4h。 0033 进一步的， 所述乙醇胺浓度为1mol/L， 加入乙醇胺后室温120rmp下反应2h， 反应完 说明书 2/12 页 5 CN 112014577 A 5 毕后， 混合溶液在PBS缓冲液中4过夜透析， 用含1BSA且与透析后混合物等体积的甘油 于-20保存。 0034 本发明实施例中的一个或多个技术方案， 至少具有如下技术效果或优点： 0035 本发明提供一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒， 本发明通过调整磁珠微粒直径、 碱性磷酸酶及抗体用量， 并改进磁珠微粒偶联抗体的稀释液， 可在显著提高GPC3检测灵敏 度的同时， 扩。

19、大GPC3检测线性范围， GPC3检出限可达到10pg/mL， 检测范围可达36- 19860pg/mL， 精密度CV5。 具体实施方式 0036 下文将结合具体实施方式和实施例， 具体阐述本发明， 本发明的优点和各种效果 将由此更加清楚地呈现。 本领域技术人员应理解， 这些具体实施方式和实施例是用于说明 本发明， 而非限制本发明。 0037 在整个说明书中， 除非另有特别说明， 本文使用的术语应理解为如本领域中通常 所使用的含义。 因此， 除非另有定义， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领 域技术人员的一般理解相同的含义。 若存在矛盾， 本说明书优先。 0038 除非另有特别说明。

20、， 本发明中用到的各种原材料、 试剂、 仪器和设备等， 均可通过 市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。 0039 本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题， 总体思路如下： 0040 本发明通过调整磁珠微粒直径、 碱性磷酸酶及抗体用量、 优化磁珠微粒偶联抗体 的稀释液， 提高GPC3检测灵敏度的同时， 扩大GPC3检测线性范围。 0041 本发明通过调节磁珠微粒的直径来优化试剂盒的最低检测限， 较小直径的磁珠微 粒在同等质量浓度下提供较大的抗体结合面积， 从而有助于拓宽免疫分析的线性范围。 较 大直径的磁珠微粒将提高反应体系对低浓度样本被检出的性能， 可以优化最低检测限， 但 是直径的。

21、增大会带来固相载体总表面积下降， 导致结合在载体上的抗体量下降， 从而影响 检测上限。 0042 戊二醛交联标记法是以双功能交联剂为桥， 使酶与抗体结合。 最常用的交联剂是 戊二醛。 它具有两个活性醛基， 可分别与酶分子和抗体分子上的氨基结合。 戊二醛法又根据 试剂加入的方法分为一步法和二步法， 本发明中采用一步法， 此法操作简便。 0043 样本中GPC3与已包被抗GPC3单克隆抗体的磁珠微粒以及抗GPC3多克隆抗体-碱性 磷酸酶标记物经过孵育后， GPC3和已包被抗GPC3单克隆抗体的磁珠微粒结合， 同时GPC3另 一个位点与抗GPC3多克隆抗体-碱性磷酸酶标记物结合形成复合物。 反应完成。

22、后， 磁场吸附 磁珠微粒， 清洗未被结合的物质。 加入的发光底物被碱性磷酸酶分解， 磷酸酯基发生水解而 脱去一个磷酸基， 生成一个不稳定的中间体， 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的 金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子， 当其回到基态时产生化学发光， 再通过光电倍增管对反应中的光子数进行测量， 产生的光子数与样本中GPC3的浓度成正 比。 根据校准曲线， 可计算出样本中GPC3的含量。 0044 具体的， 本发明 0045 一种提高GPC3检测灵敏度的试剂盒， 包括试剂M和试剂R， 所述试剂M通过磁珠微粒 偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经稀释后制得， 磁珠微粒直径为0.8 m。

23、3 m； 说明书 3/12 页 6 CN 112014577 A 6 0046 所述磁珠微粒偶联鼠抗人GPC3单克隆抗体并经磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释后 制成试剂M， 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液的成分包括： Proclin300、 缓冲液、 表面活性剂和 蛋白； 0047 所述试剂R通过碱性磷酸酶标记兔抗人GPC3多克隆抗体并经碱性磷酸酶标记抗体 稀释液稀释后制得。 0048 进一步的， 所述试剂M中， 磁珠微粒与鼠抗人GPC3单克隆抗体的质量比为0.3 (0.20.5)； 0049 所述试剂R中， 碱性磷酸酶与兔抗人GPC3多克隆抗体的质量比为(0.250.5) (0.51)； 0050 所。

24、述磁珠微粒与碱性磷酸酶的质量比为0.3 (0.250.5)。 0051 进一步的， 所述磁珠微粒偶联抗体稀释液各成分的浓度为： 0052 Proclin300： 0.030.1， 缓冲液： 0.020.05mol/L， 表面活性剂： 0.2 2， 蛋白： 0.10.5， pH为7.08.0； 0053 所述缓冲液包括PB缓冲液、 MOPS缓冲液、 TES缓冲液、 HEPES缓冲液和DIPSO缓冲液 中的任意一种； 所述表面活性剂包括Brij-35、 S9、 EmulgenA90和PEG-6000中的任意一种； 所 述蛋白为BSA或牛球蛋白。 0054 在磁珠微粒偶联抗体稀释液中： 0055 M。

25、OPSO属于Good s缓冲液， 它的中文名全称3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸， 生物研 究的新型两性离子缓冲液， 缓冲能力在pH6.27.6范围， 是低温生化工作中最常用的缓冲 剂之一； TES中文名全称N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸， 该缓冲体系的缓冲能力在 pH6.88.2范围； HEPES中文名全称4-羟乙基哌嗪乙磺酸， 是一种氢离子缓冲剂， 该缓冲体 系的缓冲能力在pH6.88.2范围； DIPSO中文名全称3-N， N-二(羟乙基)氨基-2-羟基丙磺 酸， 该缓冲体系的缓冲能力在pH7.08.2范围； 这几种缓冲体系能较长时间在pH7.4 附近 范围恒定控制。 0056 。

26、聚乙二醇系列产品可作为酯型表面活性剂， PEG-6000属于相对分子量较低的聚乙 二醇， 可用作溶剂、 助溶剂和稳定剂； 聚氧乙烯月桂醚又称Brij35， 为非离子表面活性剂， 用 作扩散剂， 通过膜渗透有效分离亲水性蛋白质和疏水性蛋白质， 而不改变其生物学活性； 表 面活性剂S9(Tetronic1307)是优良的消泡剂和分散剂， 可减少血液样本的基质效应； 聚氧 乙烯基联苯乙烯化苯基醚又称EmulgenA90， 是一种非离子型表面活性剂， 低泡性表面活性 剂。 0057 与抗原抗体反应无关的蛋白类物质， 例如BSA、 牛球蛋白， 都能起到封闭作用， 减 少非特异性吸附， 降低0点信号值， 。

27、从而增加信噪比， 提高灵敏度。 0058 下面将结合实施例、 对照例及实验数据对本申请一种提高GPC3检测灵敏度的试剂 盒进行详细说明。 0059 实施例 0060 本申请设置14个实施例和4个对比例。 0061 一、 试剂的制备 0062 1.1试剂M的制备： 0063 磁珠微粒偶联抗体中的抗体为鼠抗人GPC3单克隆抗体， 所述磁珠微粒的直径为 说明书 4/12 页 7 CN 112014577 A 7 0.8 m3 m， 取100 L的3mg/mL磁珠微粒到2mL的EP管中， 置于磁分离器上4min， 弃去上清 液； 加入150 L的0.1M PBS缓冲液， 吹打均匀， 置于磁分离器上分离。

28、4min， 弃去上清液， 重复 洗涤3次； 0064 洗涤完毕后， 加入90 L的0.1mol/L PBS缓冲液重悬； 加入10mg/mL的EDC活化剂100 L， 吹打均匀后， 置于振荡器上， 反应30min， 置于磁分离器上分离4min， 弃去上清液； 0065 然后加入20500ug的鼠抗人GPC3单克隆抗体进行偶联， 具体在实验中采用500ug 的鼠抗人GPC3单克隆抗体， 用0.1mol/L PBS缓冲液稀释至总体积为500 L， 室温过夜震荡 后， 置于磁分离器上分离4min， 弃去上清液， PBS缓冲液洗2次； 0066 加入1mol/L pH8.0的甘氨酸溶液淬灭液室温混匀30。

29、min， 加入含0.1吐温20， 0.1BSA的0.01M的PBS缓冲液洗2次， 磁分离去上清后用0.1BSA的PBS缓冲液洗重悬定容 到1mL， 置于28备用。 用磁珠微粒偶联抗体稀释液稀释50倍后可作为试剂M直接使用。 0067 1.2试剂R的制备： 0068 分别取0.250.5mg碱性磷酸酶、 0.51mg兔抗人GPC3多克隆抗体溶于0.5mL生理 盐水中， 加入0.05mL 1的戊二醛， 在室温120rmp下反应15min后避光反应4h， 加入 0.1mL 1M的乙醇胺在室温120rmp下反应2h， 混合溶液在PBS缓冲液中4过夜透析， 用含1BSA且 与透析后混合物等体积的甘油在-。

30、20保存。 用碱性磷酸酶标记抗体稀释液稀释1000倍后 可作为试剂R直接使用。 0069 二、 比对试剂性能测试 0070 以R&D的Human Glypican3检测试剂盒(Quantikine ELISA)作为比对试剂盒， 测试 其灵敏度。 0071 分析灵敏度又称检测限(limit of detection)， 是基于零浓度基础上， 用于区分 从无到有的分析能力。 本发明以低浓度样本的信号值和0点的信号值的比值(用 “信噪比” 表 示)来评价试剂的检测低浓度样本的能力， 信噪比越大说明该样本与0点越能区分开， 检测 限越低。 0072 2.1采用不同浓度的校准品测试比对试剂盒线性， 结果。

31、如表1： 0073 表1比对试剂盒测校准品结果 0074 校准品浓度(pg/mL) 校准品0D值 0 0.110 78.1 0.135 156 0.194 313 0.266 625 0.421 1250 0.812 2500 1.501 5000 2.498 r 0.9931 0075 结论： 比对试剂盒测校准品(检测范围78.1-5000pg/mL)的线性相关系数r 0.9931 0076 2.2比对试剂盒测高低值混合样本的线性。 说明书 5/12 页 8 CN 112014577 A 8 0077 高值样本用低值样本(低值样本接近线性区间的下限)按一定比例稀释成不同浓 度的样本。 用比对。

32、试剂盒分别测定以上样本， 每个稀释浓度测定3次， 分别求出每个稀释浓 度检测0D值结果的均值， 根据校准曲线算出样本浓度平均值。 0078 表2对比试剂测样本结果 0079 0080 结论： 根据厂家提出的分析灵敏度为20.6pg/mL， 以及实际测试结果， 比对试剂盒 无法检测20pg/mL的样本， 超出5000p/mL的样本需要稀释后检测。 0081 三、 实施例和对比例的设置及其灵敏度测试 0082 实施例1-14和对比例1-4通过上述试剂制备方法制得， 试剂盒具体成分或制备原 料如表3、 4所示。 0083 制得的试剂盒进行灵敏度测试， 采用化学发光法并进行了优化， 反应参数为： 50。

33、 L 试剂M、 50 L试剂R、 50 L血清样本(该样本用R&D的ELISA试剂盒检测过浓度)， 37温育 20min， 洗涤磁分离后读数， 结果如表3、 5所述： 0084 3.1优化磁珠微粒直径及碱性磷酸酶与抗体比例提高灵敏度 0085 表3化学发光法优化标记工艺结果 0086 0087 说明书 6/12 页 9 CN 112014577 A 9 0088 表3中， 对比例1及实施例1、 2和4的磁珠微粒偶联抗体稀释液成分与实施例3相同。 0089 结论： 如表3所示， 对比例1使用磁珠微粒直径(0.8 m)， 72/0信噪比为3.15， 4965/ 2489信噪比为1.97， 线性相关。

34、系数r0.9980； 与对比例1比较， 实施例1使用磁珠微粒直径 (1.5 m)， 测得样本的光子值升高， 72/0信噪比为3.55， 4965/2489信噪比为 1.96， 线性相关 系数r0.9987； 实施例2使用磁珠微粒直径(3 m)， 测得样本的光子值升高， 72/0信噪比为 3.89， 4965/2489信噪比为2.00， 线性相关系数r0.9982， 说明直径1.53 m的磁珠微粒可 以进一步提高GPC3的检测灵敏度； 0090 与实施例2比较， 实施例3碱性磷酸酶的用量从0.25mg提高至0.5mg， 72/0信噪比为 4.34,4965/2489信噪比为2.04， 线性相关系。

35、数r0.9996， 说明提高碱性磷酸酶的用量可以 提高GPC3的检测灵敏度； 与实施例2比较， 实施例4提高了碱性磷酸的用量至 0.5mg， 提高了 抗体用量至1mg， 测得样本的光子值升高， 72/0信噪比为4.09,4965/2489 信噪比为2.01， 线 性相关系数r0.9992； 但是实施例4与实施例3比较， 继续提高了抗体用量至1mg， 但是0点 信号值升高了， 信噪比和线性没有进一步提高， 说明抗体浓度太高也会有不利影响。 优化标 记工艺中， 实施例3的条件最佳。 0091 3.2优化磁珠微粒偶联抗体稀释液提高灵敏度 0092 表4优化磁珠微粒偶联抗体稀释液 0093 0094 。

36、0095 表4中， 实施例5-14、 对比例2-4的磁珠微粒直径及碱性磷酸酶与抗体用量均与实 施例3相同。 0096 表5磁珠微粒偶联抗体稀释液优化测试结果 说明书 7/12 页 10 CN 112014577 A 10 0097 0098 结论： 如表5所示， 实施例3(pH7 .4)的光子值、 信噪比和线性均高于对比例2 (pH6.5)、 对比例3(pH8.5)， 说明稀释液适宜pH7.4左右； 实施例3(添加0.1BSA)的光子值、 信噪比和线性均高于对照例4(不添加BSA)； 与实施例3(PB缓冲体系)比较， 实施例5(MOPS缓 冲体系)、 实施例6(TES缓冲体系)、 实施例7(H。

37、EPES缓冲体系)、 实施例8(DIPSO缓冲体系)都 降低0点信号值， 进一步提高信噪比， 其中实施例8 (DIPSO)效果最佳； 与实施例3(不添加表 面活性剂)比较， 实施例9(添加2PEG- 6000)、 实施例10(添加2Brij-35)、 实施例11(添 加0.2S9)、 实施例12(添加 0.2EmulgenA90)能降低0点信号值， 提高其他浓度的信号 值， 从而提高信噪比， 其中实施例9(添加2PEG-6000)效果最佳； 与实施例3(添加0.1 BSA)比较， 实施例13(添加0.1牛球蛋白)也能降低0点信号值， 提高其他浓度的信号值， 从而提高信噪比； 实施例14， 用D。

38、IPSO缓冲体系， 添加2PEG-6000， 添加0.1牛球蛋白， 综合效果更佳。 0099 四、 实施例14与比对试剂盒进行比较 0100 从检测范围和线性、 空白限、 检出限、 分析灵敏度、 精密度来评价两种检测试剂盒。 0101 4.1检测范围和线性 0102 实施例14和R&D试剂盒同时检测浓度10-19860pg/mL的样本， 样本浓度用比对试剂 检测过， 超过比对试剂检测范围(36-4965pg/mL)的浓度是根据稀释比例计算出的理论浓 度。 0103 表6实施例14与比对试剂比对结果 说明书 8/12 页 11 CN 112014577 A 11 0104 样本浓度pg/mL R。

39、&D试剂盒测得0D值 实施例14测得光子值 0 0.115 3256 10 / 4256 20 0.113 7156 36 0.116 13156 72 0.149 26123 162 0.202 46411 360 0.288 119654 635 0.431 211563 1246 0.81 401236 2489 1.457 798456 4965 2.396 1612354 9930 3.265 3256471 19860 3.468 6598731 10/0信噪比 / 1.31 36/0信噪比 1.01 4.04 4965/2489信噪比 1.64 2.02 19860/9930信噪。

40、比 1.06 2.03 (36-4965)r 0.9918 0.9999 (36-19860)r 0.8049 0.9999 0105 结论： 如表6所示， 实施例14， 使用磁珠微粒直径(3 m)， 碱性磷酸酶与抗体比例为 0.5mg： 0.5mg， 磁珠微粒偶联抗体稀释液包含2PEG-6000、 0.1牛球蛋白、 0.05 Proclin300， pH7.4的0.02mol/L DIPSO缓冲液。 反应参数为： 50 L试剂M、 50 L 试剂R、 50 L 血清样本， 37温育20min， 洗涤磁分离后读数。 实施例14测得信噪比和线性相关系数高于 R&D试剂， 样本检测范围比R&D试剂。

41、盒更广。 0106 4.2空白限 0107 用零浓度校准品作为样本进行检测， 重复测定20次， 得出20次测定结果的OD值或 RLU值(相对发光值)， 计算其平均值标准差(SD)和LOB值根据零浓度校 准品和相邻浓度校准品之间的OD值或RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程， 将 即LOB值带入上述方程， 求出对应的浓度值， 即为空白限。 0108 表7空白限测试结果 0109 测定次数 比对试剂测定OD值 实施例14测定RLU值 1 0.111 3256 2 0.112 3321 3 0.109 3150 4 0.114 3210 5 0.108 3012 6 0.111 3412 说明书。

42、 9/12 页 12 CN 112014577 A 12 7 0.109 3214 8 0.104 2108 9 0.102 3510 10 0.113 3245 11 0.104 3175 12 0.106 3026 13 0.105 2964 14 0.104 3126 15 0.117 3071 16 0.113 3148 17 0.113 3254 18 0.115 3164 19 0.112 3058 20 0.109 3192 平均值 0.110 3131 标准差 0.004 274 LOB值 0.118 3680 空白限 11.90 1.54 0110 结论： 比对试剂空白限为1。

43、1.90pg/mL， 实施例14空白限为1.54pg/mL。 实施例14的 空白限低于比对试剂。 0111 4.3检出限 0112 对5份浓度近似检出限(LOD)的低值样本进行检测， 每份样本检测5次， 低于空白限 (LOB)数值的检测结果的数量应小于或等于3个。 0113 表8检出限测试结果 说明书 10/12 页 13 CN 112014577 A 13 0114 0115 结论： 实施例14检出限低于比对试剂， 具有更高灵敏度。 0116 4.4重复性 0117 对3个不同浓度的人血清样本进行测定， 分别重复测定10次， 计算10次测定结果的 平均值和标准差， 计算变异系数(CV)。 0。

44、118 说明书 11/12 页 14 CN 112014577 A 14 0119 0120 结论： 比对试剂CV10， 实施例14的CV5。 0121 4.6结论 0122 本发明采用化学发光的检测方法， 从标记工艺、 磁珠微粒偶联抗体稀释液进行了 优化， 提高检测灵敏度和检测范围。 使用适宜大小直径的磁珠微粒、 适量增加碱性磷酸酶的 用量和抗体用量， 可以显著提高测试光子值和信噪比， 从而提高检测灵敏度。 0123 使用化学发光方法的实施例性能优于ELISA， 其中实施例14最佳， 使用磁珠微粒直 径 (3 m)， 碱性磷酸酶与抗体比例为0.5mg： 0.5mg， 磁珠微粒偶联抗体稀释液包。

45、含2PEG- 6000、 0.1牛球蛋白、 0.05Proclin300、 pH7.4， 0.02M的DIPSO缓冲液。 反应参数为： 50 L试剂M、 50 L试剂R、 50 L血清样本， 37温育20min， 洗涤磁分离后读数， 测得信噪比和线性 相关系数高于R&D ELISA试剂， 样本检测范围比R&D试剂盒更广， 检出限更低， CV更好。 检出 限为10pg/mL， 检测范围为36-19860pg/mL， 精密度CV5。 0124 最后， 还需要说明的是， 术语 “包括” 、“包含” 或者其任何其他变体意在涵盖非排他 性的包含， 从而使得包括一系列要素的过程、 方法、 物品或者设备不仅。

46、包括那些要素， 而且 还包括没有明确列出的其他要素， 或者是还包括为这种过程、 方法、 物品或者设备所固有的 要素。 0125 尽管已描述了本发明的优选实施例， 但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造 性概念， 则可对这些实施例作出另外的变更和修改。 所以， 所附权利要求意欲解释为包括优 选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。 0126 显然， 本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。 这样， 倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内， 则本发明也意图包含这些改动和变型在内。 说明书 12/12 页 15 CN 112014577 A 15 。