低产正丙醇的基因工程菌及其应用.pdf

《低产正丙醇的基因工程菌及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《低产正丙醇的基因工程菌及其应用.pdf（16页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010933724.7 (22)申请日 2020.09.08 (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开 发区第十三大街29号 (72)发明人 肖冬光王亚平张翠英陈叶福 杜丽平郭学武 (74)专利代理机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理 事务所(普通合伙) 11617 代理人 郭晓迪 (51)Int.Cl. C12N 1/19(2006.01) C12N 15/87(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 15/53(2。

2、006.01) C12G 3/02(2019.01) C12G 3/021(2019.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种低产正丙醇的基因工程菌及其应用 (57)摘要 本发明提供一种低产正丙醇的基因工程菌， 所述基因工程菌是由酿酒酵母将高丝氨酸脱氢 酶基因THR6全部缺失得到。 其中THR6基因编码的 高丝氨酸脱氢酶能够催化苏氨酸生物合成途径 第三步的二聚体酶， 该酶在酿酒酵母苏氨酸的合 成途径中起关键作用。 苏氨酸可以被转化生成2 酮丁酸。 2酮丁酸是酿酒酵母合成正丙醇的必要 前体物质， 直接影响着正丙醇的产量。 本发明所 述基因工程菌应用于液态发酵法生产白。

3、酒中。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图4页 CN 112011474 A 2020.12.01 CN 112011474 A 1.一种基因工程菌， 其特征在于， 所述基因工程菌是由酿酒酵母将高丝氨酸脱氢酶基 因THR6全部缺失得到。 2.如权利要求1所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述THR6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 3.如权利要求1所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述酿酒酵母是酿酒酵母AY15的单倍 体菌株 5。 4.如权利要求3所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述基因工程菌是以酿酒酵母为出发 菌株， 通过同源重组的方法敲除其THR6基因得到。 5.。

4、如权利要求4所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述基因工程菌通过如下步骤得到： (1)以酿酒酵母的基因组为模板， PCR扩增得到THR6基因的上、 下游序列的DNA分子片 段； (2)通过醋酸锂化学转化法， 将步骤(1)所述上、 下游序列的DNA分子片段以及筛选标记 基因转化至所述酿酒酵母中， 通过同源重组得到敲除了THR6基因的重组菌株； (3)采用Cre-loxP重组系统敲除步骤(2)所述重组菌株中的筛选标记基因； (4)传代培养以使步骤(3)引入的游离质粒丢失， 获得酿酒酵母重组菌。 6.如权利要求5所述的基因工程菌， 其特征在于， 所述筛选标记基因为KanMX抗性基因。 7.权利要求1。

5、-6任一项所述基因工程菌在液态发酵法生产白酒中的用途。 8.如权利要求7所述的用途， 其特征在于， 所述液态发酵法生产白酒是以所述基因工程 菌作为生产菌株， 以高粱为原料， 制备高粱水解液作为发酵培养基， 接种所述基因工程菌， 静置发酵。 9.如权利要求8所述的用途， 其特征在于， 所述基因工程菌的接种量为5106CFU/mL， 30 静置发酵。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112011474 A 2 一种低产正丙醇的基因工程菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 涉及工业微生物的育种， 尤其是一种低产正丙醇 的酿酒酵母基因工程菌及其应用。 背景技术 0002 白酒。

6、中的风味物质主要有高级醇类、 酯类、 醛类等。 其中， 高级醇是形成白酒风味 和口感的重要的化学物质之一。 适宜的高级醇含量具有使白酒口感和香气丰满， 酒体柔和 协调的作用， 但过量的高级醇是白酒异杂味的主要来源， 也是导致白酒饮后上头的重要原 因。 作为高级醇中重要的成分之一， 正丙醇对白酒风格有较大的影响， 适量的正丙醇可以给 白酒酒体带来酒香味和甜味， 过量的正丙醇似醚臭、 有苦味。 因而， 在白酒酿造过程中， 应尽 量控制正丙醇的形成。 当前国内大部分白酒生产厂家采用的是液态法酿制白酒， 液态法酿 造白酒具有出酒率高， 成本低， 占地面积少， 机械化程度较高， 节约劳动和原料成本， 改。

7、善生 产条件， 提高酿酒的综合效益， 便于综合利用， 利于自动化等优点。 但是采用此工艺酿造的 白酒在口味上不能很好的表现出其应有的特色， 往往存在高级醇含量较高的问题。 因此， 控 制白酒中高级醇的含量已成为我国白酒产业亟需解决的问题。 而控制液态法白酒中高级醇 的含量， 首先要解决的就是正丙醇含量过高的问题。 液态法白酒中的正丙醇含量一般为固 态法白酒的三倍以上， 饮后副作用明显， 这是阻遏液态法白酒发展的主要原因之一。 工业上 为了降低液态法白酒中正丙醇含量通常会提高酵母接种量， 减少发酵过程中酵母的增殖倍 数， 从而减少增殖过程中高级醇的形成。 但是过高的酵母接种量会使酵母过早的进入衰。

8、亡 期， 发酵提前终止， 这将导致白酒发酵不充分， 严重影响白酒风味物质的形成和品质； 另一 种方式是通过改变发酵工艺， 调节发酵液中的营养物质成分， 发酵培养基中， 如缺乏氮源， 无机盐等营养物质时， 酵母生长受到抑制， 这也会导致发酵不充分， 不仅影响白酒产量， 还 会影响白酒的品质。 0003 酿酒酵母合成正丙醇的代谢途径主要有两条： 一条是 -酮酸分解代谢途径称为埃 尔利希途径， 即氨基酸分解代谢途径； 另一条为 -酮酸合成代谢途径称为哈里斯途径， 即高 级醇合成代谢途径。 已有很多相关的报道针对这两条途径对正丙醇的代谢进行调控， 李维 等(Li,W.,Chen,S.J.,Wang,J。

9、.H.,Zhang,C.Y.,Shi,Y.,Guo,X.W.,Chen,Y.F.,&Xiao,D.G. (2018).Genetic engineering to alter carbon flux for various higher alcohol productions by Saccharomyces cerevisiae for Chinese Baijiu fermentation.Applied microbiology and biotechnology,102(4),17831795.https:/ doi.org/10.1007/s00253-017-8715-5)以白酒酵。

10、母AY15为亲本菌株， 详细研究了ILV1基因 缺失对高级醇代谢的影响。 构建的ILV1基因双敲除重组菌株， 其正丙醇、 活性戊醇、 2-苯乙 醇的浓度分别降低了30.33、 35.58和11.71； 正丁醇和异戊醇的浓度分别提高了 326.39和57.6。 Eden等(Eden,A.,Van Nedervelde,L.,Drukker,M.,Benvenisty,N.,& Debourg,A.(2001).Involvement of branched-chain amino acid aminotransferases in the production of fusel alcohols。

11、 during fermentation in yeast.Applied 说明书 1/7 页 3 CN 112011474 A 3 microbiology and biotechnology,55(3) ,296300.https:/doi.org/10.1007/ s002530000506)发现， 编码氨基转移酶的BAT2基因缺失突变株对正丙醇的生成量有较大的 影响。 这些育种大多是围绕啤酒发酵或固态法白酒发酵酵母进行的， 或在降低正丙醇的情 况下， 导致了其他高级醇含量的升高。 目前针对液态法白酒所用的酿酒酵母高级醇代谢相 关基因的改造与育种鲜有报道。 现代液态法白酒发酵中有很多工艺。

12、方法来降低高级醇含 量， 比如唐取来等人(唐取来,李晶晶,李玲玲,刘彩霞,胡雪娇,肖冬光.(2015).新型液态发 酵生产米香型白酒的研究( )酶制剂在液态发酵米香型白酒中的应用.酿酒科技(9 期),8-11.)通过在液态发酵生产米香型白酒中添加适量的酶制剂， 与传统糖化发酵剂协同 糖化发酵， 来调控液态法白酒中风味物质的形成。 但是在实际的生产中， 不同批次间调控效 果差异较大， 效果并不理想。 因此关注酿酒酵母菌种， 选育出具有适宜高级醇生成量的优良 菌株是调控正丙醇合成的最根本途径。 发明内容 0004 本发明的目的是解决酿酒酵母菌株在液态法白酒生产中产生正丙醇含量较高的 问题， 通过调。

13、控酿酒酵母的苏氨酸合成途径， 构建低产正丙醇的酿酒酵母菌株。 0005 为解决上述技术问题， 本发明技术方案如下： 0006 本发明提供一种基因工程菌， 所述基因工程菌是由酿酒酵母将高丝氨酸脱氢酶基 因THR6全部缺失得到。 0007 其中THR6基因编码的高丝氨酸脱氢酶能够催化苏氨酸生物合成途径第三步的二 聚体酶， 该酶在酿酒酵母苏氨酸的合成途径中起关键作用。 苏氨酸可以被转化生成2-酮丁 酸。 2-酮丁酸是酿酒酵母合成正丙醇的必要前体物质， 直接影响着正丙醇的产量。 0008 优选地， 所述THR6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 所述THR6基因在NCBI中 可查询的Gen。

14、e ID为： 853604。 0009 优选地， 所述酿酒酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15的单倍体菌 株 5。 0010 优选地， 所述基因工程菌是以酿酒酵母为出发菌株， 通过同源重组的方法敲除其 THR6基因得到。 0011 在本发明的一种具体实施方式中， 所述基因工程菌可以通过如下步骤得到： 0012 (1)以酿酒酵母的基因组为模板， PCR扩增得到THR6基因的上、 下游序列的DNA分子 片段； 0013 (2)通过醋酸锂化学转化法， 将步骤(1)所述上、 下游序列的DNA分子片段以及筛选 标记基因转化至所述酿酒酵母中， 通过同源重组得到敲除了T。

15、HR6基因的重组菌株； 0014 (3)采用Cre-loxP重组系统敲除步骤(2)所述重组菌株中的筛选标记基因； 0015 (4)传代培养以使步骤(3)引入的游离质粒丢失， 获得酿酒酵母重组菌。 0016 优选地， 所述筛选标记基因为KanMX抗性基因。 0017 本发明另一目的是提供上述基因工程菌在液态发酵法生产白酒中的应用。 0018 在本发明的一种具体实施方式中， 所述液态发酵法生产白酒是以本发明所述基因 工程菌作为生产菌株， 以高粱为原料， 制备高粱水解液作为发酵培养基， 接种所述基因工程 菌， 静置发酵。 说明书 2/7 页 4 CN 112011474 A 4 0019 有益效果：。

16、 0020 本发明提供的低产正丙醇酿酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下， 抑制 高丝氨酸脱氢酶的表达， 调控酵母代谢中苏氨酸的合成途径， 达到了显著降低正丙醇的效 果， 为酿造风味良好、 口感独特的液态法白酒奠定了理论基础。 0021 本发明基因工程菌的正丙醇生成量显著降低。 在经过液态法发酵后， 原始菌株 5 的正丙醇生成量是25.77mg/L， 本发明得到的缺失THR6基因的重组菌株的正丙醇生成量为 5.69mg/L， 相比较亲本菌株降低了77.92； 同时该重组菌株的高级醇总量较亲本菌株降低 了19.89。 0022 本发明基因工程菌的发酵性能及生长性能良好， 未出现影响重组菌株生。

17、长性能或 其他负面情况。 此外该菌株除正丙醇以外的， 异丁醇， 异戊醇和苯乙醇的含量也表现出不同 程度的降低， 这对调控白酒中高级醇的含量具有重要的意义。 特别地， 本发明提供的缺失 THR6基因的酿酒酵母重组菌株实现了在降低正丙醇的同时提升了酯类物质的含量， 有效降 低了醇酯比， 显著改善了液态法白酒的风味。 附图说明 0023 图1： 实施例中重组菌株 5-THR6-k-p的构建流程图。 0024 图2： 实施例中THR6A、 THR6B、 loxP-KanMX-loxP片段的验证电泳图。 0025 图3： 实施例中重组菌株 5-THR6的验证电泳图。 0026 图4： 实施例中重组菌株 。

18、5-THR6-k(敲除KanMX抗性基因)的验证电泳图。 0027 图5： 实施例中重组菌株 5-THR6-k-p(丢弃pSH-Zeocin质粒)的验证电泳图。 具体实施方式 0028 下面通过具体的实施方案叙述本发明。 除非特别说明， 本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。 另外， 实施方案应理解为说明性的， 而非限制本发明的 范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。 对于本领域技术人员而言， 在不背离本 发明实质和范围的前提下， 对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。 0029 本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒。

19、酵母菌株， 酿酒酵母 5仅为 其中一种较佳的实施方式， 其来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AY15(保藏编 号为No.CICC32315)的单倍体菌株。 0030 实施例1： 缺失THR6基因的酿酒酵母菌株的构建 0031 以酿酒酵母 5(Li W,Wang JH,Zhang CY,Ma HX,Xiao DG(2017b)Regulation of Saccharomyces cerevisiae genetic engineering on the production of acetate esters and higher alcohols during。

20、 Chinese Baijiu fermentation.J Ind Microbiol Biotechnol 44:949-960.)为宿主菌， 通过同源重组的方法构建重组基因工程菌株。 0032 具体的构建步骤详述如下： 0033 (1)以所述出发菌株酿酒酵母 5的基因组为模板， 以THR6A-F和THR6A-R为引物， 利 用PCR扩增得到THR6基因的上游DNA分子片段THR6A(972bp)； 以酿酒酵母 5基因组为模板， 以THR6B-F和THR6B-R为引物利用PCR扩增得到THR6基因的下游DNA分子片段THR6B(724bp)。 说明书 3/7 页 5 CN 11201147。

21、4 A 5 0034 (2)以质粒pUG6为模板， 以THR6K-F和THR6K-R为引物利用PCR扩增得到含有KanMX 标记基因的PCR产物loxP-KanMX-loxP(1663bp)。 KanMX标记基因也可以从其他含有其基因 序列的质粒上获取或者直接合成其DNA分子片段。 0035 附图2是THR6A、 THR6B、 loxP-KanMX-loxP片段的验证电泳图。 其中， M泳道是DL5000 DNA marker； 1泳道是以酿酒酵母 5基因组为模板， THR6A-F和THR6A-R为引物对PCR扩增的 结果(972bp单一条带)； 2泳道是以酿酒酵母 5基因组为模板， THR6。

22、B-F和THR6B-R为引物对 PCR扩增的结果(724bp单一条带)； 3泳道是以质粒pUG6基因组为模板， THR6K-F和THR6K-R为 引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。 0036 (3)通过醋酸锂化学转化法， 将步骤(1)和(2)获得的PCR产物片段THR6A、 THR6B中 间连入loxP-KanMX-loxP转化到所述出发菌株中， 用G418抗性平板筛选转化子， 挑选在G418 抗性平板上生长的酵母菌落， 提取纯化后的酵母菌株的DNA作为模板， 分别以THR6-M1-U/ THR6-M1-D和THR6-M2-U/THR6-M2-D为引物， 利用PCR进行转化子的定。

23、点验证， 分别得到长度 为1758bp和1248bp的正确条带。 即为正确的阳性转化子， 记为重组菌株 5-THR6。 0037 附图3是重组菌株 5-THR6的验证电泳图。 其中， M泳道是DL5000 DNA marker； 1 泳道是以重组菌株 5-THR6的基因组为模板， THR6-M1-U与THR6-M1-D为引物对PCR扩增得 到的片段(1758bp单一片段)； 2泳道是以重组菌株 5-THR6的基因组为模板， THR6-M2-U与 THR6-M2-D为引物对PCR扩增得到的片段(1248bp单一片段)； 3泳道是以 5的基因组为模板， THR6-M1-U与THR6-M1-D为引物。

24、对PCR扩增得到的结果； 4泳道是以 5基因组为模板， THR6- M2-U与THR6-M2-D为引物对PCR扩增得到的结果。 0038 (4)利用Cre/loxP重组系统， 将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤(3) 的重组菌株中， 分别以重组菌株 5-THR6的基因组和转化子的基因组为模板， 以K-F与K-R 为引物利用PCR扩增， 以重组菌株 5-THR6为模板进行PCR扩增得到的片段1613bp， 而在以 转化子的基因组为模板的PCR扩增中， 无条带， 证明得到剔除KanMX抗性标记的转化子， 记为 重组菌株 5-THR6-k。 0039 附图4是重组菌株 5-THR6。

25、-k的验证电泳图。 其中， M泳道是DL5000 DNA marker； 1泳道是以重组菌株 5-THR6的基因组为模板， K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段 (1613bp单一片段)； 2泳道是以 5-THR6-k基因组为模板， K-F与K-R为引物对PCR扩增得到 的结果。 0040 (5)将步骤(4)所得重组菌株 5-THR6-k进行传代培养， 以丢弃其中游离的pSH- Zeocin质粒， 选取第4-5代及以上代数的菌株， 从中提取酵母质粒并以此为模板， 以Zn-F与 Zn-R为引物进行PCR扩增， 此外， 提取pSH-Zeocin质粒为模板并以Zn-F与Zn-R为引物进行 PC。

26、R扩增， PCR结果出现1172bp的条带， 而以传代后菌株的基因组为模板， 无条带。 证明获得 成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株， 记为 5-THR6-k-p。 0041 附图5是重组菌株5-THR6-k-p的验证电泳图。 其中， M泳道是DL5000 DNA marker； 1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板， Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段 (1172bp单一片段)； 2泳道是以 5-THR6-k-p基因组为模板， Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增 得到的结果。 0042 本实施例中所用PCR引物的核苷酸序列如表1所示。 0043 表1 PCR引物序列。

27、表 说明书 4/7 页 6 CN 112011474 A 6 0044 0045 实施例2： 重组菌株 5-THR6-k-p液态法白酒发酵实验 0046 (1)发酵工艺路线： 0047 高粱颗粒粉碎液化、 糖化加入酸性蛋白酶冷却过滤高粱汁糖度调整 分装灭菌接种、 发酵蒸馏； 0048 (2)主要的工艺条件如下： 0049 粉碎条件： 粉碎度以没有整粒的高粱为宜， 粉碎程度不易过细， 以免造成过滤压力 过大； 0050 液化、 糖化条件： 粉碎后的高粱以料水比1:4的比例加入30的温水， 充分搅拌均 匀后， 放置于恒温水浴锅中， 90保持60min， 进行液化。 调节水浴锅温度至60， 保持 3。

28、0min， 进行糖化。 液化和糖化过程中每隔5min充分搅拌一次； 糖化完成后， 调节水浴锅温度 至40， 加入酸性蛋白酶搅拌均匀， 并保持16h， 使蛋白酶充分发挥作用。 0051 过滤条件： 使用双层纱布过滤高粱水解液， 调节高粱水解液糖度为18度。 0052 灭菌条件： 将上述高粱水解液分装至三角瓶中并于115灭菌20min。 冷却至室温， 即为发酵培养基。 0053 (3)发酵实验： 0054 将在相同实验条件下活化好的酿酒酵母出发菌株 5和重组菌株 5-THR6-k-p种 子液分别接种到(2)中制备好的发酵培养基中(接种量为5106CFU/mL)， 在30的培养箱 中静置进行液态法白。

29、酒发酵实验； 发酵期间每隔12h振荡并称重， 记录失重； 发酵96h时， 出 发菌株 5和重组菌株 5-THR6-k-p发酵液的失重不再减小， 认为发酵结束， 停止培养； 测 定发酵液的失重、 酒精度、 残糖、 以及主要香气成分含量。 以失重、 酒精度、 残糖表征其综合 性能， 结果见表2。 主要香气成分含量结果见表3。 0055 4)GC分析测定高级醇和酯含量： 发酵液经蒸馏后， 酒样进行气相色谱分析， 色谱条 件为： 毛细管色谱柱LZP-930， 50m320 m1.0 m， 载气为纯度为99.99的氮气， 分流比1: 10。 进样口温度200， 检测器温度200， 进样量1 L。 采用程。

30、序升温， 50保持8min， 5/ 说明书 5/7 页 7 CN 112011474 A 7 min升温， 升温至150， 保持15min。 为保持数据的准确性， 每个样品进样两次， 取平均值。 在 同一色谱条件下， 用已知的高级醇类和酯类标准品色谱峰的保留时间与样品中高级醇类物 质色谱峰的保留时间对照进行分析。 0056 表2高粱原料液态法白酒发酵的发酵性能 0057 0058 注： 所示数据为三个平行试验结果的平均值， *p0.05,*p0.01。 0059 表2表明： 液态法白酒发酵实验时， 本发明所获得的酿酒酵母重组菌株与原出发菌 株相比， 发酵性能没有明显变化。 这说明本发明中敲除T。

31、HR6基因， 没有对酿酒酵母 5的发酵 性能产生影响。 0060 表3高粱原料液态法发酵的主要香气成分含量(mg/L) 0061 0062 表3表明： 从正丙醇的生成量来看， 原始菌株 5的正丙醇生成量为25.77mg/L， 本发 明重组菌株 5-THR6-k-p的正丙醇生成量为5.69mg/L。 相比较亲本菌株降低了77.92。 这说明本发明重组菌可以在很大程度上降低液态法白酒中正丙醇的含量。 进一步的， 除正 丙醇以外的其他几种高级醇的生成量也表现出不同程度的下降。 本发明得到的敲除THR6基 因的重组菌株 5-THR6-k-p的总高级醇生成量为358.85mg/L， 相比较亲本菌株的总高。

32、级 醇含量降低了19.89。 这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上降低液态法白酒中正 丙醇及总高级醇的含量， 为酿造风味良好， 口感独特的液态法白酒奠定了理论基础。 0063 此外经测定， 酿酒酵母 5所产乙酸乙酯、 乙酸异戊酯含量分别为14.00mg/L以及 15.56mg/L， 总量为29.56mg/L。 本发明中敲除THR6基因的重组菌株 5-THR6-k-p的乙酸乙 酯、 乙酸异戊酯含量分别为22.14mg/L以及17.62mg/L， 总量为39.76mg/L， 较出发菌株 5提 高了34.51。 需要说明的是液态法白酒的醇酯比过高会对白酒的口感产生不好的影响。 在 白酒酿造中， 适。

33、当降低高级醇的生成量以提高醇酯比， 可显著提升白酒的口感。 此基础上， 如能继续保持或者提高酯类物质含量则会更进一步地提高白酒的口感。 本发明中敲除THR6 基因的重组菌株 5-THR6-k-p实现了在降低高级醇的同时还提升了酯类物质的含量， 显 著提高了液态法白酒的风味。 0064 另外， 本发明中， 敲除THR6基因的重组菌株 5-THR6-k-p具有一定的应用价值。 在液态法白酒实际生产中， 可以考虑将重组菌株与出发菌株或其他高产正丙醇且高产酯的 酿酒酵母菌株/非酿酒酵母菌株按照一定比例进行混菌发酵， 可以达到精准调控白酒中正 丙醇含量， 改善白酒香气成分的目的。 例如孟金明(孟金明.液。

34、态发酵生产大麦酒工艺研究 说明书 6/7 页 8 CN 112011474 A 8 D.天津科技大学,2016.)在液态发酵生产大麦酒的工艺中， 采用酿酒酵母和汉逊酵母顺 序接种的混菌发酵方式， 所得酒样酯醇比达到1:1， 白酒的品质有明显提高。 0065 因此， 本发明获得的缺失THR6基因的低产正丙醇的基因工程菌对于实际生产中有 效调控高级醇含量和风味方面都具有很强的实用性， 为白酒发酵工艺提供了一株潜力极强 的生产菌株。 0066 虽然本发明已经以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何本领域 技术人员， 在不脱离本发明的精神和原理的情况下， 可以对这些实施例进行各种形式和细。

35、 节的变化、 修改、 替换和变型， 本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。 说明书 7/7 页 9 CN 112011474 A 9 SEQUENCE LISTING 天津科技大学 一种低产正丙醇的基因工程菌及其应用 15 PatentIn version 3.5 1 1080 DNA Saccharomyces cerevisiae 1 atgagcacta aagttgttaa tgttgccgtt atcggtgccg gtgttgttgg ttcagctttc 60 ttggatcaat tgttagccat gaagtctacc attacttaca atctagttct tttg。

36、gctgaa 120 gctgagcgtt ctttaatctc caaggacttt tctccattaa atgttggttc tgattggaag 180 gctgctttag cagcctccac tactaaaacg ttgcctttgg atgatttaat tgctcatttg 240 aagacttcac ctaagccagt cattttggtt gataacactt ccagcgctta cattgctggt 300 ttttacacta agtttgtcga aaatggtatt tccattgcta ctccaaacaa gaaggccttt 360 tcctctgat。

37、t tggctacctg gaaggctctt ttctcaaata agccaactaa cggttttgtc 420 tatcatgaag ctaccgtcgg tgctggtttg cctatcatca gtttcttaag agaaattatt 480 caaaccggtg acgaagttga aaaaattgaa ggtatcttct ctggtactct atcttatatt 540 ttcaacgagt tctccactag tcaagctaac gacgtcaaat tctctgatgt tgtcaaagtt 600 gctaaaaaat tgggttatac tgaacca。

38、gat ccaagagatg atttgaatgg gttggatgtt 660 gctagaaagg ttaccattgt tggtaggata tctggtgtgg aagttgaatc tccaacttcc 720 ttccctgtcc agtctttgat tccaaaacca ttggaatctg tcaagtctgc tgatgaattc 780 ttggaaaaat tatctgatta cgataaagat ttgactcaat tgaagaagga agctgccact 840 gaaaataagg tattgagatt cattggtaaa gtcgatgttg ccacc。

39、aaatc tgtgtctgta 900 ggaattgaaa agtacgatta ctcacaccca ttcgcatcat tgaagggatc agataacgtt 960 atttccatca agactaagcg ttacaccaat cctgttgtca ttcaaggtgc cggtgccggt 1020 gctgccgtta ctgccgctgg tgttttgggt gatgttatca agattgctca aagactttag 1080 2 18 DNA 人工序列 2 aactcccatc gctctaca 18 3 46 DNA 人工序列 序列表 1/3 页 10 C。

40、N 112011474 A 10 3 cctgcagcgt acgaagcttc agctgacatt atgctttact atccac 46 4 46 DNA 人工序列 4 gtggatagta aagcataatg tcagctgaag cttcgtacgc tgcagg 46 5 42 DNA 人工序列 5 ttgggttgaa tggaacagca taggccacta gtggatctga ta 42 6 42 DNA 人工序列 6 tatcagatcc actagtggcc tatgctgttc cattcaaccc aa 42 7 19 DNA 人工序列 7 tcaatatat。

41、g gaaaccaga 19 8 16 DNA 人工序列 8 ttttggacgg gcacta 16 9 16 DNA 人工序列 9 ggtcggaaga ggcata 16 10 序列表 2/3 页 11 CN 112011474 A 11 17 DNA 人工序列 10 aatttatgcc tcttccg 17 11 16 DNA 人工序列 11 atttgacagc gtttgc 16 12 19 DNA 人工序列 12 cagctgaagc ttcgtacgc 19 13 22 DNA 人工序列 13 gcataggcca ctagtggatc tg 22 14 19 DNA 人工序列 14 cccacacacc atagcttca 19 15 20 DNA 人工序列 15 agcttgcaaa ttaaagcctt 20 序列表 3/3 页 12 CN 112011474 A 12 图1 说明书附图 1/4 页 13 CN 112011474 A 13 图2 说明书附图 2/4 页 14 CN 112011474 A 14 图3 图4 说明书附图 3/4 页 15 CN 112011474 A 15 图5 说明书附图 4/4 页 16 CN 112011474 A 16 。