基因在促进神经干细胞增殖和分化中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010948183.5 (22)申请日 2020.09.10 (71)申请人 张文化 地址 230088 安徽省合肥市高新区望江西 路800号创新产业园B1区 (72)发明人 不公告发明人 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 5/0793(2010.01) C12N 5/0797(2010.01) (54)发明名称 一种基因在促进神经干细胞增殖和分化中 的应用 (57)摘要 本发明公开了一种基因在。

2、促进神经干细胞 增殖和分化中的应用。 本发明发现， miR378a3p 高表达的NSCs细胞具有更强的增殖活性， miR 378a3p高表达还促进了NSCs细胞向神经元细胞 分化。 因此， miR378a3p基因具有促进NSCs增殖 和分化的作用， 可以将促进miR378a3p表达的 药物用于促进NSCs细胞增殖和分化。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 112011515 A 2020.12.01 CN 112011515 A 1.一种基因在促进神经干细胞增殖和分化中的应用， 所述基因为miR-378a-3p， 所述分 化为向神经元细胞分化。 2.一种促进基因表达的成分在制备促进神。

3、经干细胞增殖和分化的药物中的应用， 所述 基因为miR-378a-3p， 所述分化为向神经元细胞分化。 3.根据权利要求2所述的应用， 所述成分可以为小分子化合物， 也可以为核苷酸序列。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112011515 A 2 一种基因在促进神经干细胞增殖和分化中的应用 技术领域 0001 本发明属于干细胞领域， 涉及神经干细胞的增殖和分化， 具体涉及一种基因在促 进神经干细胞增殖和分化中的应用。 背景技术 0002 神经干细胞(NSCs)是指自我更新、 且具有分化为神经元、 星形胶质细胞、 少突胶质 细胞等多向分化潜能的细胞。 其在神经系统中主要作为一种储备细胞， 即当。

4、神经系统受到 损伤时， 如急性缺血性脑梗死、 神经退行性疾病等， 这些干细胞便开始增殖、 迁移及分化为 相应的组织细胞， 以便实现结构和功能的代偿。 0003 在成人脑损伤和神经退行性疾病的治疗中， 通过促进NSCs分化来代偿疾病丢失的 神经元具有潜在的应用前景。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种基因在促进神经干细胞增殖和分化中的应用。 0005 本发明技术方案如下： 0006 一种基因在促进神经干细胞增殖和分化中的应用， 所述基因为miR-378a-3p， 所述 分化为向神经元细胞分化。 在具体实施方式的实施例中， miR-378a-3p mimic组吸光度值和 增殖活性显著高于。

5、NC-mimic组和空白对照组， 说明miR-378a-3p mimic组NSCs细胞具有更 强的增殖活性； miR-378a-3p mimic组 -tubulin III蛋白表达明显， NC-mimic组和空白对 照组 -tubulin III蛋白表达不明显， miR-378a-3p mimic组Nestin蛋白表达水平显著低于 NC-mimic组和空白对照组。 Nestin蛋白是神经干细胞的特异性蛋白， -tubulin III是神经 元细胞的特异性蛋白， 通过这两种蛋白表达水平的变化可知， miR-378a-3p mimic组NSCs细 胞出现了明显的向神经元细胞分化， NC-mimic。

6、组和空白对照组NSCs细胞未见明显分化。 0007 一种促进基因表达的成分在制备促进神经干细胞增殖和分化的药物中的应用， 所 述基因为miR-378a-3p， 所述分化为向神经元细胞分化。 0008 优选地， 所述成分可以为小分子化合物， 也可以为核苷酸序列。 0009 有益效果： 0010 本发明发现， miR-378a-3p高表达的NSCs细胞具有更强的增殖活性， miR-378a-3p 高表达还促进了NSCs细胞向神经元细胞分化。 因此， miR-378a-3p基因具有促进NSCs增殖和 分化的作用， 可以将促进miR-378a-3p表达的药物用于促进NSCs细胞增殖和分化。 附图说明 。

7、0011 图1为miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组miR-378a-3p的相对表达 量； 0012 图2为miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组吸光度值和增殖活性； 0013 图3为miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组Western blot测定结果。 说明书 1/3 页 3 CN 112011515 A 3 具体实施方式 0014 下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护范 围。 0015 一、 实验材料 0016 大鼠神经干细胞(NSCs， 货号PR2028)购。

8、自无锡欣润生物科技有限公司， 细胞纯度 在90以上， 使用欣润生物提供的大鼠神经干细胞专用完全培养基(货号KR5028-5)培养。 0017 miR-378a-3p mimic、 NC-mimic和RT-PCR引物由上海生工设计合成。 0018 二、 实验方法 0019 1、 NSCs的复苏、 培养和传代 0020 取出NSCs冻存管， 将管体浸于37水浴中， 轻轻振荡， 1分钟内使冻存管中的固体 溶解90以上， 从水浴中取出。 无菌条件下， 接种于细胞培养瓶中， 补加大鼠神经干细胞专 用完全培养基， 于37、 5CO2条件下培养， 每23d半量换液， 每67d传代。 0021 取NSCs传代。

9、细胞， 通过细胞免疫荧光单标化学法鉴定Nestin蛋白。 Nestin蛋白是 NSCs的特异性标记物， 细胞免疫荧光单标鉴定显示Nestin蛋白阳性后进行后续实验。 0022 2、 NSCs的分组和转染 0023 取NSCs传代细胞， 制成细胞密度为2106个/mL的细胞悬液， 接种到6孔板， 每孔 2mL， 培养24h后进行转染， 分别设置miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组， 转染 方式参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。 0024 3、 miR-378a-3p表达水平测定 0025 收集转染48h后的NSCs细胞， 采用Trizo。

10、l试剂分别提取各组细胞中的总RNA， 采用 Fast-Start Universal SYBR Green Master(Rox)试剂根据说明书测定miR-378a-3p相对 表达量， U6为内参。 PCR扩增条件： 95预变性5min， 95变性30s， 62退火30s， 72延伸 1min， 扩增40个循环。 采用2 Ct法计算miR-378a-3p的相对表达量， 并以空白对照组miR- 378a-3p相对表达量记为1.00。 引物序列如下： 0026 miR-378a-3p上游引物： 5-ATCCACCAGGCTGAGTGA-3； 0027 miR-378a-3p下游引物： 5-GTGG。

11、TGATGTCTCAGGTGATG-3； 0028 U6上游引物： 5-CTATGCGCACATCCAGTG-3； 0029 U6下游引物： 5-ATGCATTTCCACGTTGTCAT-3。 0030 4、 CCK-8法测定NSCs的增殖活性 0031 分别取miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组转染48h后的NSCs细胞， 用大鼠神经干细胞专用完全培养基制成细胞密度为2.5105个/mL的细胞悬液， 接种到96 孔板， 每孔200 L， 于37、 5CO2条件下培养72h后， 每孔加入20 LCCK-8溶液， 37孵育4h 后， 以空白完全培养基调零测定45。

12、0nm波长处各孔的吸光度值。 每组设5个平行样本， 重复3 次。 以空白对照组的吸光度值记为增殖活性100， 以miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组吸 光度值与空白对照组吸光度值的比值计算miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组的增殖活性。 0032 5、 Western blot法测定NSCs的分化水平 0033 分别取miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组转染48h后的NSCs细胞， 洗涤， 用大鼠神经干细胞专用完全培养基制成细胞密度为3105个/mL的细胞悬液， 接种到 6孔板， 每孔2mL， 于37、 5CO2条件。

13、下培养72h后， 提取总蛋白后， 使用BCA蛋白浓度测定试 说明书 2/3 页 4 CN 112011515 A 4 剂盒， 根据试剂说明书测定样品的蛋白质浓度。 取25 g总蛋白行SDS-PAGE电泳， 分离蛋白， 将蛋白电转至PVDF膜， 将PVDF膜用质量分数5脱脂奶粉封闭2h， 1TBST洗膜10min3次； 加入Nestin、 -tubulin III、 -actin一抗， 4孵育过夜； 1TBST洗膜10min3次； 加入 HRP偶联的二抗孵育2h， 1TBST洗膜10min3次； ECL试剂暗室曝光使蛋白质条带显影， 并 用BIO-RAP成像， Image J软件分析蛋白灰度。 。

14、0034 6、 统计学方法 0035 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析， 计量数据以均数标准差表示， 组间比较 采用单因素方差分析(ANOVA)， 以P0.05为差异有统计学意义。 0036 三、 实验结果 0037 1、 NSCs转染结果 0038 miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组miR-378a-3p的相对表达量如表 1和图1所示， miR-378a-3p mimic组miR-378a-3p的表达水平显著高于NC-mimic组和空白对 照组， 说明通过转染成功构建了miR-378a-3p高表达的NSCs细胞。 0039 表1 miR-378a。

15、-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组miR-378a-3p的相对表达量 0040 组别miR-378a-3p相对表达量 空白对照组1.00 miR-378a-3p mimic组2.870.13 NC-mimic组1.050.09 0041 2、 NSCs的增殖活性 0042 miR-378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组吸光度值和增殖活性如表2和图 2所示， miR-378a-3p mimic组吸光度值和增殖活性显著高于NC-mimic组和空白对照组， 说 明miR-378a-3p mimic组NSCs细胞具有更强的增殖活性。 0043 表2 miR-。

16、378a-3p mimic组、 NC-mimic组和空白对照组吸光度值和增殖活性 0044 组别吸光度值增殖活性 空白对照组0.4520.016100 miR-378a-3p mimic组0.9960.025220.4 NC-mimic组0.4730.021104.6 0045 3、 NSCs的分化水平 0046 Western blot结果如图3所示， miR-378a-3p mimic组 -tubulin III蛋白表达明 显， NC-mimic组和空白对照组 -tubulin III蛋白表达不明显， miR-378a-3p mimic组 Nestin蛋白表达水平显著低于NC-mimic组。

17、和空白对照组。 Nestin蛋白是神经干细胞的特异 性蛋白， -tubulin III是神经元细胞的特异性蛋白， 通过这两种蛋白表达水平的变化可 知， miR-378a-3p mimic组NSCs细胞出现了明显的向神经元细胞分化， NC-mimic组和空白对 照组NSCs细胞未见明显分化。 0047 上述结果表明， miR-378a-3p高表达的NSCs细胞具有更强的增殖活性， miR-378a- 3p高表达还促进了NSCs细胞向神经元细胞分化。 因此， miR-378a-3p基因具有促进NSCs增殖 和分化的作用， 可以将促进miR-378a-3p表达的药物用于促进NSCs细胞增殖和分化。 0048 以上实施例作用在于阐释本发明的实质性内容， 但是， 本领域技术人员应当知道， 不应该将本发明的保护范围局限于以上具体实施例。 说明书 3/3 页 5 CN 112011515 A 5 图1 说明书附图 1/2 页 6 CN 112011515 A 6 图2 图3 说明书附图 2/2 页 7 CN 112011515 A 7 。