SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010978609.1 (22)申请日 2020.09.17 (71)申请人 山东大学深圳研究院 地址 518000 广东省深圳市南山区粤海街 道高新区南区虚拟大学园A301 (72)发明人 王凯向琳 (74)专利代理机构 济南鲁科专利代理有限公司 37214 代理人 滕慧 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细 胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒 。

2、(57)摘要 本发明涉及生物医学技术领域， 尤其涉及 SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌 早期诊断中的应用及检测试剂盒。 通过检测生物 标志物SFRP2的甲基化程度， 可以在早期判断受 试者是否患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌， 及早 进行有效的治疗手段， 减低乙型肝炎病毒相关肝 细胞癌患者的死亡率， 提供更加及时的临床策 略。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图1页 CN 112011619 A 2020.12.01 CN 112011619 A 1.检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产品 中的应用， 其特征在于， 所述生物标志物为SFRP2。

3、。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述试剂为用于定量检测生物标志物的甲 基化程度的试剂。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 当SFRP2甲基化程度升高时， 受试者患 有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌。 4.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括引物、 探针、 抗体、 核酸芯 片或蛋白质芯片。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述试剂包括用于特异性检测SFRP2甲基 化的引物对及探针。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述引物对序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.2所示， 反向引物序列如SEQ ID NO.3所示； 。

4、所述探针序列如SEQ ID NO.4所示。 7.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述检测样本为外周血单个核细胞； 所述 产品包括芯片或试剂盒。 8.用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒 为特异性检测SFRP2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒。 9.根据权利要求8所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括用于特异性检测 SFRP2甲基化的引物对及探针， 以及用于内参 -actin的引物对及探针。 10.根据权利要求8所述的检测试剂盒， 其特征在于， 用于特异性检测SFRP2甲基化的引 物对序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.2所示， 。

5、反向引物序列如SEQ ID NO.3所示； 用于特 异性检测SFRP2甲基化的探针序列如SEQ ID NO.4所示； 用于内参 -actin的引物对为： 正向引物序列如SEQ ID NO.5所示， 反向引物序列如SEQ ID NO.6所示； 用于内参 -actin的探针序列为如SEQ ID NO.7所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112011619 A 2 SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中 的应用及检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物医学技术领域， 尤其涉及SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关 肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂盒。 背景技术 00。

6、02 肝细胞癌是最常见的原发性肝癌， 也是全球癌症死亡的第三大主要原因。 在中国， 慢性乙型肝炎病毒感染诱发的肝癌更为普遍。 乙肝病毒感染及癌基因激活均在肝癌的发生 和发展中发挥着重要作用。 0003 表观遗传修饰是癌基因致癌作用中的重要事件之一， 其中包括异常的DNA 甲基 化。 DNA甲基化是指基因表达的可遗传变化， 但是DNA序列没有发生改变。 DNA甲基化已在多 种肿瘤中广泛研究， 例如胃癌和肺癌。 多项研究表明， 某些基因的DNA甲基化可以用作诊断 的生物标记。 0004 分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)是SFRP家族成员之一,其三维结构中存在一个富含 半胱氨酸的结构域， 与Wnt。

7、配体高度同源， 是肿瘤发生相关通路Wnt 信号通路的拮抗因 子。 SFRP2基因中存在高密度的CpG岛， 研究表明， 其异常甲基化与多种恶性肿瘤发生密切相 关， 例如结直肠癌， 胃癌， 食管腺癌等。 0005 目前， SFRP2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌中的甲基化状态及其临床应用前景尚 缺少定量研究， 因此， 确定SFRP2甲基化在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的价值具 有重要意义。 发明内容 0006 本发明提供了SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用 及检测试剂盒， 通过检测样本中生物标志物SFRP2的甲基化程度， 可以在早期判断受试者是 否患有乙型肝炎病毒相关。

8、肝细胞癌， 及早进行有效的治疗手段， 减低乙型肝炎病毒相关肝 细胞癌患者的死亡率， 提供更加及时的临床策略， 解决了现有技术中存在的问题。 0007 本发明所采用的技术方案之一是： 0008 检测样本中生物标志物的试剂在制备早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的产 品中的应用， 所述生物标志物为SFRP2。 0009 进一步的， 所述SFRP2基因序列如SEQ ID NO.1所示。 0010 SEQ ID NO.1： 0011 TGCAGCCGGCGCGCGGAGCGCGGGGGCCGCCAGCCACTTCCGGGCGTGCGGCAGCG CGGGGCTCAAA CCAGCCAGACCAGCTTC。

9、GGGCTCCTTGAACTCCCAACAAGGGGCTC TGCGGGGAGGAGGCGACCCCAGCGGAGGG CGTTGGGGATTTAGGGGTTGGCCGGGG CCGGCGGGGGGTTGGGGGGGCGTGAAAGCGAGAGGGCCCTTATCCCAC TCCCAGGCC CAAGTCGTAGCATCTCTCAGAGCTCACGCTCTTTATTAGCTCTTTCTTTTGGTGTGCTT CTGTTT CCTTTGTGGTTTCATTGCAAAGTAGTTTATGTTGGGAAGGGGGCTTTTAGGC CTCTTGGTGCTTTCGTTAGAGAC 说明书 1/9 页。

10、 3 CN 112011619 A 3 GAAAAGGCCCTGAACCAATTTGGGGAAAGAGAGG CCTTTTGCAGCTACCCCGGGCCCTTCCCCAGCAGAGCACCC GGAAGCTGGGCTCTTAG GGACGCAGATTCTTGGAGTTCAGAATGTGCATTCTCTCCAGATGACGATTTTCCTGGC GTGTTTACGGTCAGCAGATAACACTGAGTGGGCTTTTGCCACCCATTCATTCATTACC CGGCTCCTCTAAGCAGC TGGACCGCAAAGTGTGCCTGATAACTTGGGCCTGGGAGCC GCCAAGGC。

11、CAACGCATCTTCCGGAAGGAGGGAAAT TAGGAAGCCGGGGTCTGAGCC TGTGAATGACTCTTAAGTGGTCGGGAAGTAATAACAATGCGCCCACCTTACATA TGA AAGAACTTCGCCCTCCGGGGATTATCTCTTTGGATCTTCACAGCCACCCGGAGACAGC GGCTGAGGAGAGC GAAGGCCTCCTGTCCCCATAGGGAGACTAGGGACAATTAGGCA AAAGGAGCCCACCCCCCAACCCAGAACTTACT GTTTGCAGTCAGAGACACTAGATCC CAGGCTCCACGAGAG。

12、CAGAGGCCGGCCTGTTTGTTCATTTCTGCACATCC AGCGCCCA GCATGGTGCCCCCTGGTACGTAGGGGATGAATGAGCTAATTCTAGCCCTCGTGGATCT CTAGGCAG GACTCCTTCCTCTACCTCGCTCCCTCCCAGCCTGCCCATCTTTTGTGCCCG TCTTTTGTGCCGGCCACCAGTCTT TACAAACAGTGCCCTGGGGGCCCATACTCCAGCT TTCCAGAGCGCACAGCTGCAAGGGCGGCTGTGTGTTAGAGC CCGTGATGCCTTCGAG TATTGAGTCATGCCAT。

13、TCATTTAAGAAGGAAAAATCTCTCCAAAACGGGGAAATGGT G GGCAGTCCTGTGTGACTGGTGAGACTCTTGTAGGGGCGTTTCTACAACGACGAAAC CCTTCCTAGGCACTCACTC CAACAGAATAACAAGCCCATTTTATTAGTATTTCGTTTTC CATGTAAAGTTCTGCTCATACGAATATATTTATAA TTCTGATTTTTTTACGGCATTGGG GAGCACACCGACAGGCTGCTGAACGGTGGCTGGAGATTCGAGGGAAAACGA AGTTC GCCGAGGCGGCCTCGGGCG。

14、GGCAGGTCCCGGGCTCCATCACAGGGCACACGCGGCTA CCAGGGACGCAG CCCCCCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACA CACACACACCCTCTCCCACTCATGCCTGGCA ACCCAGCAGAAACTTCGGACTGGGGC AAAACAAGCCCGGGCCCCGGCGGCACGCGGGGCTAGGCGCGTTCCCGCC AGTACCTG GTCGCGAGGCCGCTCGCGGGGTGCCCTGCGTGCCCCCCACTCCCGCAGCCCGCGCCC TGCTCGCTC ACTGTGGGGGCGCAGCG。

15、GCCAGGCTTCTCTGTTTGTTGTTTAAAGAAAT CCTAGGGCGGGCGAGCGGCGGCATCT AGGGGAGGGGGCGCAGCCAGAATTCCCTTCC AGCAAGCGCGTGAGGGGCATTCTCAACGCAAAACCAGACCCAGA AAGTAGTGACCA GCCCTCCTCGGATTACCCTTCATTGGCTCCTCCCTTGCTCCCCCCACCCTCC。 0012 进一步的， 所述试剂为用于定量检测生物标志物的甲基化程度的试剂。 0013 进一步的， 当SFRP2甲基化程度升高时， 受试者患有乙型肝炎病毒相关肝细胞癌。 0014 进一步的， 所。

16、述试剂包括引物、 探针、 抗体、 核酸芯片或蛋白质芯片。 0015 进一步的， 所述引物对序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.2所示， 反向引物序列 如SEQ ID NO.3所示； 所述探针序列如SEQ ID NO.4所示。 0016 进一步的， 所述检测样本为外周血单个核细胞； 所述产品包括芯片或试剂盒。 0017 本发明所采用的技术方案之二是： 0018 提供一种用于早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的检测试剂盒， 所述试剂盒为 特异性检测SFRP2甲基化的甲基化特异性PCR试剂盒。 0019 进一步的， 所述试剂盒包括用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对及探针， 以及用 于内参 -。

17、actin的引物对及探针。 0020 进一步的， 用于特异性检测SFRP2甲基化的引物对序列为:正向引物序列如SEQ ID NO.2所示， 反向引物序列如SEQ ID NO.3所示； 用于特异性检测 SFRP2甲基化的探针序列如 SEQ ID NO.4所示； 0021 用于内参 -actin的引物对为： 正向引物序列如SEQ ID NO.5所示， 反向引物序列 如SEQ ID NO.6所示； 用于内参 -actin的探针序列为如SEQ ID NO.7 所示。 0022 进一步的， 所述检测试剂盒还包括阳性对照、 阴性对照、 MethyLight Master Mix、 说明书 2/9 页 4 。

18、CN 112011619 A 4 高压三蒸水。 0023 本发明的有益效果： 0024 本发明首先定量测定并获得了SFRP2甲基化程度在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患 者的外周血单个核细胞中是升高的， 并且明显高于慢性乙型病毒性肝炎患者和健康人的 SFRP2甲基化程度， 确定了SFRP2甲基化程度与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌具有关联性。 本 发明提供的生物标志物的甲基化程度能为早期诊断乙型肝炎病毒相关肝细胞癌， 可以作为 诊断的依据， 丰富了乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的辅助诊断,可及早进行有效的治疗手段， 减低乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者的死亡率提供更加及时的临床策略。 附图说明 0025 图1为SF。

19、RP2在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组、 慢性乙型病毒性肝炎组和健康对照 组的甲基化的差异； *p0.01， *p6个月； 血清 HBVDNA20000IU/mL (105copies/mL)， 或2000-20000IU/mL(104-105copies /mL)(常见于HBeAg阴性CHB患者)； 持续性或间断性ALT/AST水平升高； 肝脏活检显示慢性肝脏炎症， 伴中度或严重坏死。 0030 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌诊断标准： 慢性乙型肝炎、 肝硬化等肝病背景下， 有影 像学检查结果(包括B超、 CT、 MRI及血管造影等)以及血清甲胎蛋白AFP水平(AFP500 g/L， 且持续4周， 或。

20、AFP200-500 g/L持续8周， 在排除其他引起的AFP增高的因素)和/或穿刺活检 病理结果。 0031 排除标准： 合并其他肝炎病毒感染(甲肝病毒、 丙肝病毒、 丁肝病毒、 戊肝病毒 等)和/或人类免疫缺陷病毒； 患有其他肝脏疾病， 如自身免疫性肝炎、 酒精性肝病及代谢 性肝病等； 合并其他恶性肿瘤； 妊娠女性。 0032 所有患者均签署知情同意书。 0033 1.外周血单个核细胞分离 0034 (1)使用EDTA抗凝试管采集每位研究对象外周静脉血5ml， 离心(转速1500转 /分， 5分钟)， 可见全血分层， 上层淡黄色液体即为血浆， 下层为血细胞； 0035 (2)去除上层的淡黄。

21、色血浆， 按照1： 1的比例加入PBS缓冲液， 缓慢吹打混匀； 0036 (3)l5ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液， 吸取步骤(2)准备的稀释液沿管壁缓 慢加入， 使稀释的血细胞悬液位于淋巴细胞分离液液面之上； 0037 (4)2000转/分转速离心20分钟； 0038 (5)缓慢取出离心管， 可发现管内液体分为4层， 从上到下依次为血浆层(淡黄色)、 PBMC层(白色膜状)、 淋巴细胞分离液层(透明)及红细胞和粒细胞层(红色、 难以区分)。 用吸 说明书 3/9 页 5 CN 112011619 A 5 管小心地吸取PBMC层(白膜层)， 转移至新的15ml离心管中(尽量吸取全部PBM。

22、C同时避免吸 入其他杂质细胞)； 0039 (6)加入PBS液定容至1Oml， 吹打摇匀， 离心(2000转/分， 10分钟)； 0040 (7)弃去上清液， 可见管底的白色沉淀， 即为PBMCs； 0041 (8)重复(6)(7)， 反复洗涤PBMCs； 0042 (9)弃去上清液， 用约1ml PBS液冲洗离心管底部， 并将其转移至1.5mlEP管中； 0043 (10)配平后， 离心(3000转/分， 5分钟)； 0044 (11)重复(9)(10)， 再次洗涤PBMCs； 0045 (12)弃去上清液， 置于-80冰箱中保存待用， 或直接用于提取DNA。 0046 2.手工法提取DNA。

23、 0047 开始前操作事项： 0048 (1)无水乙醇； 0049 (2)0.1M柠檬酸钠溶液(10乙醇溶解)； 0050 (3)75乙醇； 0051 (4)8mM NaOH。 0052 步骤： 0053 (1)取待处理标本， 向EP管内加入l ml Trizol试剂， 盖好管盖后摇匀， 并将枪头伸 入管底反复吹打细胞沉淀， 使细胞充分裂解溶解， 静置10分钟。 0054 (2)将O.3ml氯仿加入至EP管中， 盖好管盖， 上下振荡摇匀1分钟， 静置10分钟。 0055 (3)配平后， 放置于4离心机中离心(12000转/分， l5分钟)。 0056 (4)离心后样品分为3层， 上层无色透明水。

24、相， 下层粉红色有机相， 两层之间为中间 层。 DNA主要存在于中间层和有机相中， 因此尽量移去上层水相。 0057 (5)加入O.3ml无水乙醇， 上下颠倒混匀， 室温静置1O分钟。 0058 (6)配平后， 放置于4离心机中离心(12000转/分， 5分钟)。 0059 (7)弃去上清液， 加入1mL 10乙醇O.1M柠檬酸钠溶液， 振荡洗涤DNA沉淀30分钟。 0060 (8)重复步骤(6)。 0061 (9)加入l ml 75乙醇， 振荡洗涤DNA沉淀30分钟。 0062 (10)重复步骤(6)。 0063 (11)弃去上清液， 室温干燥5-10分钟， 避免过度干燥难以溶解， 用8mM。

25、NaOH溶液溶 解DNA， 使DNA浓度为200-300ng/ug。 0064 (12)用8mM NaOH溶液将提取的DNA样本稀释100倍， 紫外分光光度计测定DNA的浓 度， 及260/280nm的OD值。 0065 3.DNA的亚硫酸氢盐修饰 0066 开始前注意事项： 0067 适用于每次修饰的DNA量为500pg-2 g， 200-500ng最适。 0068 开始前操作事项： 0069 CT Conversion Reagent制备 0070 试剂盒内提供的CT Conversion Reagent为固体混合物， 应在使用前准备， 步骤如 下： 说明书 4/9 页 6 CN 1120。

26、11619 A 6 0071 (1)将900 l水、 300 l M-Dilution Buffer和50 l M-Dissolving Buffer 加入到 CT Conversion Reagent试剂管中。 0072 (2)室温下涡旋或振动10分钟以混匀。 0073 注： 在CT Conversion Reagent中看到极少量未溶解试剂是正常现象， 每管CT Conversion Reagent可处理10个DNA标本。 0074 贮存： CT Conversion Reagent见光分解， 应注意避光保存， 最好在制备后立即使 用， 如果未能立即使用， CT Conversion Re。

27、agent可以在室温下保存过夜， 4保存一周， -20 保存一月， 贮存的CT Conversion Reagent必须加热至37并涡旋后使用。 0075 M-Wash Buffer制备 0076 将4.8ml无水乙醇加入到1.2ml M-Wash Buffer浓缩液中或96ml无水乙醇加入到 24ml M-Wash Buffer浓缩液中。 0077 操作步骤 0078 (1)将130 l CT Conversion Reagent加入到装有20 l DNA样本的PCR管中。 如果 DNA样本体积少于20 l， 用水补足体积。 晃动PCR管或移液器吹打混匀后将液体离心至管底。 0079 (2)。

28、将样本管进行下列操作步骤： 0080 1)9810分钟 0081 2)642.5小时 0082 3)4贮存(最长贮存20小时)。 0083 (3)将600 l M-Binding Buffer加入IC Column中， 然后放入试剂盒内提供的 Collection Tube中。 0084 (4)将样本(来自第2步)加入装有M-Binding Buffer的IC Column中， 盖紧管盖反 复颠倒混匀。 0085 (5)最高速(10000g)离心30秒， 弃掉滤液。 0086 (6)将100 l M-Wash Buffer加入上述IC Column中， 最高速离心30秒。 0087 (7)将2。

29、00 l M-Desulphonation Buffer加入IC Column中室温(20-30) 孵育 15-20分钟。 孵育结束后最高速离心30秒。 0088 (8)将200 l M-Wash Buffer加入IC Column中， 最高速离心30秒。 再加入200 l M- Wash Buffer， 最高速离心30秒。 0089 Collection Tube中可容纳800l液体。 需要时倾倒残液以防止残液污染IC Column。 0090 (9)将离心柱加入1.5ml微量离心管中， 向离心柱中加入10 l M-Elution Buffer， 最高速离心30秒以洗脱DNA。 0091 洗。

30、脱的DNA可以即刻使用， 也可以-20或更低温贮存后使用。 如果要长期贮存， 最 好-70或更低温贮存。 每次PCR推荐使用1-4 l洗脱DNA， 但是如果必要的话最多可以一次 使用10 l。 根据实验要求不同洗脱液可以大于10 l， 但是较小体积的洗脱液可以得到更高 浓度的DNA。 0092 4.甲基化特异性定量PCR(Methylight) 0093 开始前注意事项： 0094 本方法适用于8 l反应体系的制备， 反应体系8 l时， 反应和循环条件应当进一步 说明书 5/9 页 7 CN 112011619 A 7 优化。 0095 同一标本同时应用本发明SFRP2甲基化特异性引物探针和内。

31、参 -actin引物探针 进行扩增。 0096 每次操作时需平行扩增阳性对照及阴性对照。 阳性对照为甲基化完全的DNA标本 (Control Methylated DNA)， 阴性对照以不含有任何DNA底物成分的Water 作为扩增模板。 0097 操作步骤： 0098 (1)引物探针溶解后轻轻混匀， 稀释十倍制成工作液后冰上保存。 0099 (2)配制反应体系 0100 PCR反应体系 0101 成分 体积 Water 2 l 上游引物 0.4 l 下游引物 0.4 l 探针 0.2 l MethylightMaster Mix 5 l 最终体积 8 l 0102 注： 准备多个PCR反应体。

32、系时， 将上表中 “体积” (反应体系数+1)。 温和振荡混匀 反应体系， 简短离心5秒。 0103 (3)吸取8 l PCR反应体系加入预冷的PCR管中， 加入2 l DNA模板。 0104 (4)将配制好的反应体系温和振荡混匀， 简短离心5秒。 0105 (5)按下述扩增条件对样本进行扩增。 0106 预变性955min； 9515s， 601min， 运行40个循环； 4保存。 0107 5.结果分析 0108 最终甲基化程度用PMR值表示。 0109 PMR100 x 2expDelta Ct(目标基因-内参基因)样 本-Delta Ct(目标基因-内参 基因)阳 性 对 照。 011。

33、0 由图1可得， HCC组PMR中位数38.16,IQR 19.08-53.59； CHB组PMR 中位数 15.60,IQR 9.41-25.53； HC组PMR中位数16.78,IQR 12.13-22.45。 表明SFRP2在乙 型肝炎病毒相关肝细胞癌组、 慢性乙型病毒性肝炎组和健康对照组的甲基化的差异明显， 乙型肝炎病毒相关肝细胞癌组的SFRP2甲基化程度明显上升， 可用于对乙型肝炎病毒相关 肝细胞癌组的早期诊断。 0111 图2中各指标测定结果如下表1。 0112 表1 0113 0114 SFRP2甲基化作为标志物时AUC值为0.770， 高于AFP(AUC 0.684,p0.10。

34、8)； SFRP2甲基化取最佳临界值为34.51， 此时敏感度+特异度最高； SFRP2甲基化与AFP联合检 说明书 6/9 页 8 CN 112011619 A 8 测可进一步提高AUC值(0.858) ,明显高于AFP单独作为分子标志物时的诊断效能(p 0.001)。 0115 上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制， 对于本技术领域的技术人 员来说， 对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。 0116 本发明未详述之处， 均为本技术领域技术人员的公知技术。 说明书 7/9 页 9 CN 112011619 A 9 0117 说明书 8/9 页 10 C。

35、N 112011619 A 10 0118。 说明书 9/9 页 11 CN 112011619 A 11 序列表 山东大学深圳研究院 SFRP2作为标志物在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌早期诊断中的应用及检测试剂 盒 2020-09-16 6 SIPOSequenceListing 1.0 1 22 DNA Artificial Sequence 1 gtcgtcgttc gttcgtttta gg 22 2 21 DNA Artificial Sequence 2 cgcgaaatac cctacgtacc c 21 3 21 DNA Artificial Sequence 3 tcccgcaa。

36、cc cgcgccctac t 21 4 25 DNA Artificial Sequence 4 tggtgatgga ggaggtttag taagt 25 5 28 DNA Artificial Sequence 5 aaccaataaa acctactcct cccttaaa 28 6 序列表 1/2 页 12 CN 112011619 A 12 30 DNA Artificial Sequence 6 accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30 序列表 2/2 页 13 CN 112011619 A 13 图1 图2 说明书附图 1/1 页 14 CN 112011619 A 14 。