甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体及其制备方法和检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010580462.0 (22)申请日 2020.06.23 (71)申请人 深圳市第二人民医院 地址 518048 广东省深圳市福田区笋岗西 路3002号 申请人 深圳市检验检疫科学研究院 深圳国际旅行卫生保健中心 （深圳 海关口岸门诊部） (72)发明人 谭小艳顾大勇何建安龙军 李涛张良吴晓聪覃淑萍 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 马小悦 (51)Int.Cl. C07K 16/10(2006.01) C12N 15/13(。

2、2006.01) G01N 33/569(2006.01) (54)发明名称 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体及其制 备方法和检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种甲型H1N1流感病毒的人工 合成抗体及其制备方法和检测试剂盒。 该甲型 H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列 如SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 6中任意一个所示 的多肽； 或者该抗体包括与氨基酸序列如SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 6中任意一个所示的多肽具有 至少95的序列同一性的多肽。 上述甲型H1N1流 感病毒的人工合成抗体的分子量小且能够与甲 型H1N1流感病毒特异性结合， 结合效果好。。

3、 权利要求书1页 说明书13页 序列表6页 附图4页 CN 112028992 A 2020.12.04 CN 112028992 A 1.一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 其特征在于， 所述抗体包括氨基酸序列如 SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 6中任意一个所示的多肽； 或者， 所述抗体包括与氨基酸序列如SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 6中任意一个所示的多 肽具有至少95的序列同一性的多肽。 2.根据权利要求1所述的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 其特征在于， 所述抗体还 包括载体蛋白， 所述载体蛋白与所述多肽偶联。 3.根据权利要求2所述的甲型H1N。

4、1流感病毒的人工合成抗体， 其特征在于， 所述载体蛋 白选自牛血清白蛋白、 匙孔血蓝蛋白、 卵清蛋白、 人血清白蛋白和多聚赖氨酸中的一种。 4.根据权利要求13任一项所述的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 其特征在于， 所述抗体还含有修饰单元， 所述修饰单元与所述多肽连接， 所述修饰单元的材料选自胶体 金、 纳米磁珠、 生物素和荧光染料中的一种。 5.一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 其特征在于， 所述抗体包括氨基酸序列如 SEQ ID NO： 7所示的环肽及与所述环肽偶联的载体蛋白。 6.一种表达基因， 其特征在于， 所述表达基因包括用于编码权利要求1或5所述的甲型 H1N1流感。

5、病毒的人工合成抗体中的多肽的核苷酸片段。 7.一种表达载体， 其特征在于， 所述表达载体包含权利要求6所述的表达基因。 8.一种宿主细胞， 其特征在于， 所述宿主细胞内包含权利要求7所述的表达载体。 9.一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 培 养权利要求8所述的宿主细胞。 10.一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒， 其特征在于， 包括检测试剂， 所述检测试剂 包括权利要求15任一项所述的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体或权利要求9所述的甲 型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备方法制得的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体。 权利要求书 1/1 。

6、页 2 CN 112028992 A 2 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体及其制备方法和检测试 剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体及 其制备方法和检测试剂盒。 背景技术 0002 流行性感冒病毒(influenza virus)是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表 种， 简称流感病毒。 人流感病毒分为甲(A)、 乙(B)、 丙(C)三型， 是流行性感冒(流感)的病原 体。 其中甲型流感病毒抗原性易发生变异， 多次引起世界性大流行。 对于甲型流感病毒， 根 据其表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同。

7、， 可以进一步分为不同的亚型。 目前， 甲型病毒有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。 甲型H1N1流感病毒表面的糖蛋白血 凝素和神经氨酸酶均是1型， 因此称为H1N1。 0003 随着单克隆技术的不断发展， 单克隆抗体在生物药物、 临床诊断与治疗方面起着 举足轻重的作用。 目前针对甲型H1N1流感病毒的抗体主要是通过单克隆技术获得， 然而传 统的通过单克隆技术获得的抗体存在抗体分子量大的问题。 发明内容 0004 基于此， 有必要提供一种分子量相对较小的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体。 0005 此外， 还提供一种用于表达上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的表。

8、达基因、 用于表达上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的表达载体、 能够分泌上述甲型H1N1流感 病毒的人工合成抗体的宿主细胞、 上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备方法和含 有上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的检测试剂盒。 0006 一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 所述抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 6中任意一个所示的多肽； 0007 或者， 所述抗体包括与氨基酸序列如SEQ ID NO： 1SEQ ID NO： 6中任意一个所示 的多肽具有至少95的序列同一性的多肽。 0008 上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体具有较小的分子。

9、量且能够与甲型H1N1流 感病毒的血凝素的抗原决定簇特异性结合且结合效果好， 而且上述甲型H1N1流感病毒的人 工合成抗体还可以通过化学合成或基因工程技术合成， 生产成本低。 该甲型H1N1流感病毒 的人工合成抗体可应用于甲型H1N1流感病毒的检测。 0009 在其中一个实施例中， 所述抗体还包括载体蛋白， 所述载体蛋白与所述多肽偶联。 0010 在其中一个实施例中， 所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、 匙孔血蓝蛋白、 卵清蛋 白、 人血清白蛋白和多聚赖氨酸中的一种。 0011 在其中一个实施例中， 所述抗体还含有修饰单元， 所述修饰单元与所述多肽连接， 所述修饰单元的材料选自胶体金、 纳米磁珠、。

10、 生物素和荧光染料中的一种。 0012 一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 所述抗体包括氨基酸序列如SEQIDNO： 7 说明书 1/13 页 3 CN 112028992 A 3 所示的环肽及与所述环肽偶联的载体蛋白。 0013 一种表达基因， 所述表达基因包括用于编码上述的甲型H1N1流感病毒的人工合成 抗体中的多肽的核苷酸片段。 0014 一种表达载体， 所述表达载体包含上述的表达基因。 0015 一种宿主细胞， 所述宿主细胞内包含上述的表达载体。 0016 一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备方法， 包括以下步骤： 培养上述的 宿主细胞。 0017 一种甲型H1N1流感病。

11、毒的检测试剂盒， 包括检测试剂， 所述检测试剂包括上述的 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体或上述的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备方 法制得的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体。 附图说明 0018 图1为实施例1的多肽作为包被抗体的OD值统计图； 0019 图2为实施例1的多肽作为包被抗体的P/N值统计图； 0020 图3为实施例2的多肽作为包被抗体的OD值统计图； 0021 图4为实施例2的多肽作为包被抗体的P/N值统计图； 0022 图5为实施例2的未经环化修饰的多肽和经环化修饰后的多肽分别作为包被抗体 的P/N值对比图； 0023 图6为实施例3的多肽作为包被抗体的OD值统计。

12、图； 0024 图7为实施例3的多肽作为包被抗体的P/N值统计图。 具体实施方式 0025 为了便于理解本发明， 下面将对本发明进行更全面的描述， 本发明可以以许多不 同的形式来实现， 并不限于本文所描述的实施例。 相反地， 提供这些实施例的目的是使本发 明公开内容更加透彻全面。 0026 除非另有定义， 本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的 技术人员通常理解的含义相同。 本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的， 不是旨在于限制本发明。 0027 本发明一实施方式提供了一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 与传统的通过 利用杂交瘤细胞的单克。

13、隆抗体技术制备的抗体相比， 上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗 体的分子量很小、 穿透性好， 疏水程度、 所含电荷及含酸碱性氨基酸的构成合适， 可以在氨 基酸的个数不超过30个的条件下与甲型H1N1流感病毒表面的血凝素特异性结合， 而且上述 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体还可以通过化学合成或基因工程技术合成， 生产成本 低。 该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体可应用于甲型H1N1流感病毒的检测。 0028 具体地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO ： 2或SEQ ID NO ： 3所示的多肽。 如SEQ ID NO ： 。

14、1所示的氨基酸序列为 ： MAWMMLLLTLLAHCTGSWAQSVLTQPPSLS； 如SEQ ID NO： 2所示的氨基酸序列为： VFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEEL； 如SEQ ID NO： 3所示的氨基酸序列为： SYWMTWVRQAPGKGLEWVANIKQYGSEKYY。 可以理解的是， 在一些实施例中， 该甲型H1N1流感病毒 说明书 2/13 页 4 CN 112028992 A 4 的人工合成抗体包括与氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO： 3所示的多 肽具有至少95的序列同一性的多肽。 0029 在。

15、其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体为氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO： 3所示的多肽。 0030 在另一个实施例中， 该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体是与氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO： 3所示的多肽具有至少95的序列同一性的多肽。 0031 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO： 3所示的多肽和载体蛋白。 通过连接载体蛋白提高甲型 H1N1流感病毒的人工合成。

16、抗体的分子量， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体更容易与 甲型H1N1流感病毒的血凝素特异性结合， 进而提高甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体与甲 型H1N1流感病毒的血凝素特异性结合的效果。 0032 在一个可选地具体示例中， 载体蛋白选自有牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)、 匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin， KLH)、 卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、 人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)和多聚赖氨酸中的一种。 需要说明的是， 本文中的多聚赖氨酸是指由25个30个赖氨酸残基聚合而成的。

17、多肽。 当然， 在其他实施例 中， 载体蛋白不限于上述， 还可以是其他的蛋白。 进一步地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成 抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO： 3所示的多肽和与多肽连接 的载体蛋白组成。 0033 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体还包括与多肽连接的修 饰单元。 通过修饰单元使得抗体具有更广泛的应用。 在一个可选地具体示例中， 修饰单元的 材料选自胶体金、 纳米磁珠、 生物素和荧光染料中的一种。 通过胶体金、 纳米磁珠、 生物素和 荧光染料与多肽的连接， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体被上述。

18、材料修饰， 可应用 于甲型H1N1流感病毒的检测。 0034 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或SEQ ID NO： 3所示的多肽和与多肽连接的修饰单元组成。 在另一个实 施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2或 SEQ ID NO： 3所示的多肽、 载体蛋白和修饰单元组成， 载体蛋白和修饰单元分别于多肽连 接。 0035 本发明一实施方式还提供了一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 与传统的通 过利用杂交瘤细胞的单克隆抗体技术制。

19、备的抗体相比， 该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗 体的分子量较小， 可以在氨基酸的个数不超过18个的条件下与甲型H1N1流感病毒表面的血 凝素的抗原决定簇精密互补而特异性与其结合， 而且上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗 体还可以通过化学合成或基因工程技术合成， 生产成本低。 该甲型H1N1流感病毒的人工合 成抗体可应用于甲型H1N1流感病毒的检测。 0036 具体地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽。 如SEQ ID NO： 4所示的氨基酸序列为： CKSGTSASC； 如SEQ ID NO： 5所示 的氨基。

20、酸序列为： CMGSYLDTYYYHYGMDVC。 氨基酸序列如SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO： 5所示的 多肽均为环肽； 氨基酸序列如SEQ ID NO： 4所示的多肽中的两个半光氨酸通过二硫键连接 成环， 氨基酸序列如SEQ ID NO： 5所示的多肽中的两个半光氨酸通过二硫键连接成环， 本文 说明书 3/13 页 5 CN 112028992 A 5 以下划线示出。 氨基酸序列如SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO： 5所示的多肽通过其环状结构上的 氨基酸与甲型H1N1流感病毒的血凝素特异性结合。 0037 可以理解的是， 在另一些实施例中， 上述甲型H1N1流感病。

21、毒的人工合成抗体包括 与氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽具有至少95的序列同一性的多 肽。 0038 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体为氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5示的多肽。 0039 在另一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体为与氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽具有至少95的序列同一性的多肽。 0040 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽和载体蛋白。

22、。 通过连接载体蛋白提高甲型H1N1流感病毒 的人工合成抗体的分子量， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体更容易与甲型H1N1流感 病毒的血凝素特异性结合， 进而提高甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体与甲型H1N1流感病 毒的血凝素特异性结合的效果。 0041 在一个可选地具体示例中， 载体蛋白选自牛血清白蛋白、 匙孔血蓝蛋白、 卵清蛋白 和人血清白蛋白中的一种。 当然， 在其他实施例中， 载体蛋白不限于上述， 还可以是其他的 蛋白。 进一步地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽和与多肽连接的载体蛋白组成。 004。

23、2 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体还包括与多肽连接的修 饰单元。 通过修饰单元使得抗体具有更广泛的应用。 在一个可选地具体示例中， 修饰单元的 材料选自胶体金、 纳米磁珠、 生物素和荧光染料中的一种。 通过胶体金、 纳米磁珠、 生物素和 荧光染料与多肽的连接， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体被上述材料修饰， 可应用 于甲型H1N1流感病毒的检测。 0043 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽和与多肽连接的修饰单元组成。 在另一个实施例中， 甲型 H1N1流感病毒的人。

24、工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 4或SEQ ID NO： 5所示的多肽、 载 体蛋白和修饰单元组成， 载体蛋白和修饰单元分别于多肽连接。 0044 本发明一实施方式还提供了一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 与传统的通 过利用杂交瘤细胞的单克隆抗体技术制备的抗体相比， 该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗 体的分子量较小， 可以在氨基酸的个数不超过11个的条件下与甲型H1N1流感病毒表面的血 凝素特异性结合， 而且上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体还可以通过化学合成或基因 工程技术合成， 生产成本低。 该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体可应用于甲型H1N1流感 病毒的检。

25、测。 0045 具体地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示 的多肽。 如SEQ ID NO： 6所示的氨基酸序列为： FCGMDVCYMDV。 氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所 示的多肽为环肽， 其氨基酸序列中的两个半光氨酸通过二硫键成环； 并且， 该环肽是经过芳 香族氨基酸(aromatically modified cyclopeptides， AMCPs)修饰， 从而使得该环肽具有 空间构象， 芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)伸入到抗原(血凝素)结合表面， 增加抗原和 抗体结合的稳定性， 另外， 体积大的残基(如苯环)能够使水分子容易形。

26、成网络， 通过氢键作 说明书 4/13 页 6 CN 112028992 A 6 用促进抗原抗体的结合。 因此， 氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多肽通过其环状结构上的 氨基酸与甲型H1N1流感病毒的血凝素特异性结合且结合稳定。 0046 可以理解的是， 在一些实施例中， 上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括与 氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多肽具有至少95的序列同一性的多肽。 0047 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体为氨基酸序列如SEQ ID NO： 6示的多肽。 0048 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体为与氨基。

27、酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多肽具有至少95的序列同一性的多肽。 0049 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多肽和载体蛋白。 通过连接载体蛋白提高甲型H1N1流感病毒的人工合成抗 体的分子量， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体更容易与甲型H1N1流感病毒的血凝素 特异性结合， 进而提高甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体与甲型H1N1流感病毒的血凝素特 异性结合的效果。 0050 在一个可选地具体示例中， 载体蛋白选自牛血清白蛋白、 匙孔血蓝蛋白、 卵清蛋白 和人血清白蛋白中的一种。 当然， 在其他实施例中， 。

28、载体蛋白不限于上述， 还可以是其他的 蛋白。 进一步地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多 肽和与多肽连接的载体蛋白组成。 0051 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体还包括与多肽连接的修 饰单元。 通过修饰单元使得抗体具有更广泛的应用。 在一个可选地具体示例中， 修饰单元的 材料选自胶体金、 纳米磁珠、 生物素和荧光染料中的一种。 通过胶体金、 纳米磁珠、 生物素和 荧光染料与多肽的连接， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体被上述材料修饰， 可应用 于甲型H1N1流感病毒的检测。 0052 在其中一个实施例中， 甲型H。

29、1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多肽和与多肽连接的修饰单元组成。 在另一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的 人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示的多肽、 载体蛋白和修饰单元组成， 载体蛋 白和修饰单元分别于多肽连接。 0053 本发明一实施方式还提供了一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 与传统的通 过利用杂交瘤细胞的单克隆抗体技术制备的抗体相比， 该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗 体的分子量较小， 可以与甲型H1N1流感病毒表面的血凝素特异性结合， 而且上述甲型H1N1 流感病毒的人工合成抗体还可以通过化学合成或基因工程技术合。

30、成， 生产成本低。 该甲型 H1N1流感病毒的人工合成抗体可应用于甲型H1N1流感病毒的检测。 0054 具体地， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示 的多肽和载体蛋白。 如SEQ ID NO： 7所示的氨基酸序列为： FCSSLSCYMDV。 氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽为环肽， 其氨基酸序列中的两个半光氨酸通过二硫键成环。 该环肽是经 过芳香族氨基酸(aromatically modified cyclopeptides， AMCPs)修饰， 从而使得该环肽 具有空间构象， 且芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)伸入到抗原(血凝素)。

31、结合表面， 增加 抗原和抗体结合的稳定性， 另外， 体积大的残基(如苯环)能够使水分子容易形成网络， 通过 氢键作用促进抗原抗体的结合。 因此， 氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽通过其环状结 构上的氨基酸与甲型H1N1流感病毒的血凝素特异性结合且结合稳定。 载体蛋白选自牛血清 说明书 5/13 页 7 CN 112028992 A 7 白蛋白、 匙孔血蓝蛋白、 卵清蛋白和人血清白蛋白中的一种。 当然， 在其他实施例中， 载体蛋 白不限于上述， 还可以是其他的蛋白。 0055 可以理解的是， 在一些实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体包括与氨基 酸序列如SEQ ID NO。

32、： 7所示的环肽具有至少95的序列同一性的环肽和载体蛋白。 0056 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由半光氨酸与氨基酸序 列如SEQ ID NO： 7所示的多肽中的苯丙氨酸连接之后与OVA偶联而成。 也即是， 通过在氨基 酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽添加半胱氨酸， 使其与OVA中的半胱氨酸形成二硫键， 而 使得OVA与氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽连接。 当然， 在其他实施例中， 也可以通过 其他方式将载体蛋白与氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽连接， 不限于上述。 0057 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合。

33、成抗体还包括与多肽连接的修 饰单元。 通过修饰单元使得抗体具有更广泛的应用。 在一个可选地具体示例中， 修饰单元的 材料选自胶体金、 纳米磁珠、 生物素和荧光染料中的一种。 通过胶体金、 纳米磁珠、 生物素和 荧光染料与多肽的连接， 使得甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体被上述材料修饰， 可应用 于甲型H1N1流感病毒的检测。 0058 在其中一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽和与多肽连接的修饰单元组成。 在另一个实施例中， 甲型H1N1流感病毒的 人工合成抗体由氨基酸序列如SEQ ID NO： 7所示的多肽、 载体蛋白和修饰单元。

34、组成， 载体蛋 白和修饰单元分别于多肽连接。 0059 本发明一实施方式还提供了一种表达基因， 用于在宿主中表达甲型H1N1流感病毒 的人工合成抗体。 具体地， 上述表达基因包括用于编码上述甲型H1N1流感病毒的人工合成 抗体的核苷酸片段。 0060 在一个可选地具示例中， 该表达基因包括用于编码上述甲型H1N1流感病毒的人工 合成抗体的核苷酸片段和酶切位点。 表达基因的具体核苷酸序列可以根据上述甲型H1N1流 感病毒的人工合成抗体的氨基酸序列和核苷酸密码子进行确定。 酶切位点的设计是便于表 达基因插入空载体。 酶切位点无特别限制， 可以根据空载体的多克隆位点进行设计。 0061 本发明一实施。

35、方式还提供了一种表达载体， 该表达载体作为上述表达基因的载 体。 具体地， 表达载体包括空载体及插入在空载体上的上述表达载体。 空载体没有特别的限 制， 可以根据宿主细胞选择与其匹配的空载体。 0062 本发明一实施方式还提供了一种宿主细胞， 该宿主细胞用于分泌上述甲型H1N1流 感病毒的人工合成抗体。 具体地， 该宿主细胞内含有上述表达载体， 通过宿主细胞的表达系 统， 使得表达载体上的表达基因得到表达。 需要说明的是， 宿主细胞没有特别限制， 采用本 领域常用的宿主细胞即可， 例如大肠杆菌。 0063 本发明一实施方式还提供了一种上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备 方法， 该制备。

36、方法包括以下步骤： 0064 步骤a： 提供用于表达上述任一实施方式的甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的 表达基因。 0065 具体地， 表达基因的核苷酸序列可以根据需要制备的甲型H1N1流感病毒的人工合 成抗体的具体氨基酸序列和空载体的多克隆位点进行设计。 0066 步骤b： 将步骤a的表达基因插入空载体， 制备表达载体。 说明书 6/13 页 8 CN 112028992 A 8 0067 具体地， 将步骤a的表达基因插入空载体的方式可以采用本领域常用的方式。 例如 先将空载体和表达基因进行双酶切， 然后通过DNA连接酶将酶切之后的空载体和酶切之后 的表达基因通过连接。 0068 步骤c。

37、： 将步骤b的表达载体转入宿主细胞。 0069 具体地， 将表达载体转入宿主细胞的方式无特别限制， 采用本领域常用的方式即 可。 0070 步骤d： 培养步骤c的含有表达载体的宿主细胞。 0071 通过培养含有表达载体的宿主细胞， 使其分泌上述甲型H1N1流感病毒的人工合成 抗体。 当然， 在一些实施例中， 还包括将培养含有表达载体的宿主细胞的培养液进行收集， 并分离纯化， 进而得到纯度较高的上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的步骤。 0072 上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的制备方法通过基因工程的技术制备上 述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体， 该方法简捷， 适用于大规模生产。。

38、 0073 当然， 在其他实施方式中， 制备上述甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的方法不 限于上述， 也可以通过化学方法合成， 例如多肽固相合成法。 0074 本发明一实施方式还提供了一种甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒， 该试剂盒可以 应用于甲型H1N1流感病毒检测。 0075 在其中一个实施例中， 上述甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒包括检测试剂。 具体 地， 检测试剂包括上述任意一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体。 0076 在一个可选地具体示例中， 检测试剂除上述任意一种甲型H1N1流感病毒的人工合 成抗体外， 还包括稀释剂、 封闭液、 包被液及显色剂中的至少一种。 0077 在。

39、一个可选地具体示例中， 上述甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒包括载体及包被 在载体上的上述任意一种甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体。 可以理解的是， 载体可以是 本领域常用的载体， 例如纤维素膜、 磁珠等。 0078 上述甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒包括上述任意一种甲型H1N1流感病毒的人 工合成抗体， 由于该甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的分子量小， 制备成本较低。 0079 本发明一实施方式还提供一种上述甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒的使用方法。 0080 在其中一个实施例中， 上述甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒中的甲型H1N1流感病 毒的人工合成抗体作为包被抗体。 抗体的包。

40、被效果不仅与多肽的氨基酸序列的疏水性、 分 子量有关， 和包被浓度也息息相关。 同时由于钩状效应的存在， 抗体与病毒反应的量也会对 ELISA检测结果产出很大影响， 甚至有可能由于抗体与抗原反应的比例不合适而出现假阴 性。 0081 在本实施方式中， 甲型H1N1流感病毒的人工合成抗体的包被浓度为5 g/mL20 g/mL， 此时， 甲型H1N1流感病毒的稀释倍数为100倍200倍。 0082 具体实施例 0083 以下结合具体实施例进行详细说明。 以下实施例如未特殊说明， 则不包括除不可 避免的杂质外的其他组分。 实施例中采用药物和仪器如非特别说明， 均为本领域常规选择。 实施例中未注明具体。

41、条件的实验方法， 按照常规条件， 例如文献、 书本中所述的条件或者生 产厂家推荐的方法实现。 0084 实施例1 说明书 7/13 页 9 CN 112028992 A 9 0085 (1)委托上海吉尔生化有限公司合成表1的多肽。 0086 表1 0087 0088 0089 (2)将表1中的多肽分别作为包被抗体进行双抗夹心法ELISA， 其中， 阳性样本为灭 活的甲型H1N1流感病毒， 阴性样本为经核酸检测为流感病毒阴性的样本， 具体地操作如下： 0090 a.稀释和包被： 1mg多肽加入1mL溶解液， 得到1mg/mL的多肽溶液， 将溶解后的多肽 溶液稀释成10 g/mL(取50 L浓度为。

42、1mg/mL的多肽溶液和5mL的0.05mol PH 9.6碳酸盐缓冲 液混合)， 1mg多肽分装为20个小包装。 在每个孔中加入100 L的抗体包被液(0.05mol PH 9.6PBS)， 在4下过夜。 0091 b.封闭： 吸去抗体包被液后， 用PBST洗涤液将每个孔洗涤5次， 然后在每孔加入 200uL含3BSA的PBS封闭液， 在37下温育2h。 0092 c.加待测样本： 吸去封闭液， 用PBST洗涤液将每个孔洗涤5次； 用PBS将灭活的甲型 H1N1流感病毒液阳性待测样本， 稀释200倍后对应孔加入100 L， 震荡混匀； 将经核酸检测为 流感病毒阴性的样本保存液阴性待测样本， 。

43、稀释200倍后对应孔加入100 L， 震荡混匀， 将震 荡混匀后的微孔板在37下温育30min。 0093 d.加检测抗体： 吸除温育后的阳性待测样本和阴性待测样本， 用PBST洗涤液将每 个孔洗涤5次； 用PBS将辣根过氧化物酶(HRP)标记的H1N1抗体(Influenza A pAb(H1N1) (HRP)， Fitzgerald)作为检测抗体， 稀释2万倍后每孔加100 L， 震荡混匀后， 将微孔板在37 下温育30min。 0094 e.显色： 倒去检测抗体， 用PBST洗涤液将每个孔洗涤5次； 将单组份显色液从4的 说明书 8/13 页 10 CN 112028992 A 10 冰。

44、箱中取出， 然后在每孔加入混合后的显色液100 L， 加完后震荡混匀， 常温或37避光显 色30min。 0095 f.加终止液： 显色完后， 加入50 L 2M H2SO4， 终止反应。 0096 g.检测： 加完并混匀终止液后， 立刻使用多功能酶标仪， 在450nm读取每个孔的吸 光度值， 结果如图1所示。 0097 h.结果判定： 阳性样本所在孔的OD值超过0.1且与阴性样本所在孔OD值的比值超 过2.1(即P/N值2.1)则判定为阳性， 结果图2所示。 0098 由图1可知， L01、 L03、 L05和H03分别作为包被抗体检测阳性样本的OD值大于阴性 标本OD值， 但检测阳性样本的。

45、OD值均小于0.2。 由图2可知， 在十条线性多肽中， L01、 L05和 H03分别作为包被抗体时的P/N值均大于2.1， 具体数值分别为2.27、 2.54和2.53。 0099 实施例2 0100 (1)委托上海吉尔生化有限公司合成表2的多肽。 0101 表2 0102 0103 (2)将表2中的多肽分别作为包被抗体进行双抗夹心法ELISA， 其中， 阳性样本为灭 活的甲型H1N1流感病毒(灭活病毒浓度约为1105拷贝/mL)， 阴性样本为经核酸检测为流 感病毒阴性的样本， 具体地操作如下： 0104 a.稀释和包被： 1mg多肽加入1mL溶解液， 得到1mg/mL的多肽溶液， 将溶解后。

46、的多肽 溶液稀释成10 g/mL(取50 L浓度为1mg/mL的多肽溶液和5mL的0.05mol PH 9.6碳酸盐缓冲 液混合)， 1mg多肽分装为20个小包装。 在每个孔中加入100 L的抗体包被液(0.05mol PH 9.6PBS)， 在4下过夜。 0105 b.封闭： 吸去抗体包被液后， 用PBST洗涤液将每个孔洗涤5次， 然后在每孔加入 200uL含3BSA的PBS封闭液， 在37下温育2h。 0106 c.加待测样本： 吸去封闭液， 用PBST洗涤液将每个孔洗涤5次； 用PBS将灭活的甲型 H1N1流感病毒液阳性待测样本， 稀释200倍后对应孔加入100 L， 震荡混匀； 将经核。

47、酸检测为 流感病毒阴性的样本保存液阴性待测样本， 稀释200倍后对应孔加入100 L， 震荡混匀， 将震 荡混匀后的微孔板在37下温育30min。 0107 d.加检测抗体： 吸除温育后的阳性待测样本和阴性待测样本， 用PBST洗涤液将每 个孔洗涤5次； 用PBS将辣根过氧化物酶(HRP)标记的H1N1抗体(Influenza A pAb(H1N1) (HRP)， Fitzgerald)作为检测抗体， 稀释2万倍后每孔加100 L， 震荡混匀后， 将微孔板在37 下温育30min。 0108 e.显色： 倒去检测抗体， 用PBST洗涤液将每个孔洗涤5次； 将单组份显色液从4的 说明书 9/13。

48、 页 11 CN 112028992 A 11 冰箱中取出， 然后在每孔加入混合后的显色液100 L， 加完后震荡混匀， 常温或37避光显 色30min。 0109 f.加终止液： 显色完后， 加入50 L 2M H2SO4， 终止反应。 0110 g.检测： 加完并混匀终止液后， 立刻使用多功能酶标仪， 在450nm读取每个孔的吸 光度值， 结果如图3所示。 0111 h.结果判定： 阳性样本所在孔的OD值超过0.1且与阴性样本所在孔OD值的比值超 过2.1(即P/N值2.1)则判定为阳性， 结果图4和图5所示。 0112 由图3可知， LC2a、 LC3a、 HC1a、 LC1b、 LC2。

49、b和HC3b作为包被抗体检测阳性样本的OD 值与检测阴性标本的OD值差异较大， 且LC3a、 HC1a、 LC1b、 HC3b分别作为包被抗体检测阳性 样本的OD值均大于0.2。 0113 由图4可知， LC2b和HC3b分别作为包被抗体时的P/N值均大于2.1， 具体数值分别为 2.14和2.22。 0114 图5为经巯基修饰前后的环肽之间P/N值的两两比较， 图5的横坐标中， LCDR1、 LCDR2LCDR3、 HCDR1、 HCDR2和HCDR3分别对应的是LC1a、 LC2a、 LC3a、 HC1a、 HC2a和HC3a及其环 化后的多肽所在的组别， 例如， LCDR1代表LC1a和。

50、LC1b分别作为包被抗体的试验组。 由图5可 知， LC1a、 LC2a、 HC3a经巯基修饰后检测P/N值比其的P/N值高， 可能与所在处氨基酸残基的 空间构型有关。 0115 实施例3 0116 (1)委托上海吉尔生化有限公司合成表3的多肽。 0117 表3 0118 0119 (2)将表3中的多肽分别作为包被抗体进行双抗夹心法ELISA， 其中， 阳性样本为灭 活的甲型H1N1流感病毒(灭活病毒浓度约为1105拷贝/mL)， 阴性样本为经核酸检测为流 感病毒阴性的样本， 具体地操作如下： 说明书 10/13 页 12 CN 112028992 A 12 0120 a.稀释和包被： 1mg。