噬菌体trp574基因及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010769368.X (22)申请日 2020.08.03 (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 申请人 江西省烟草公司吉安市公司 (72)发明人 刘琼光胡蓉花余成鹏钟敏 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12N 15/34(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C07K 14/01(2006.。

2、01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种噬菌体trp574基因及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种噬菌体trp574基因及其 应用， 所述噬菌体trp574基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示， 其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 本发明首次公开了属于XRE家族的 转录调节因子trp574基因， 本发明研究表明转化 了trp574基因的青枯菌株几乎丧失了致病力， trp574基因具有显著干扰青枯菌的生长、 代谢、 致病性等综合作用， trp574基因可用于制备无致 病力青枯菌株， 在防治青枯病中具有较。

3、大的应用 前景。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图6页 CN 112048514 A 2020.12.08 CN 112048514 A 1.一种噬菌体trp574基因， 其特征在于， 所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 2.由权利要求1所述噬菌体trp574基因编码的蛋白， 其特征在于， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 3.一种用于扩增检测权利要求1所述噬菌体trp574基因的引物对， 其特征在于， 所述引 物对序列如SEQ ID NO:34所示。 4.含有权利要求1所述噬菌体trp574基因的重组表达载体。 5.含有权利要求4所述重组表达载体的宿主。

4、菌。 6.含有权利要求4所述重组表达载体的细胞系。 7.根据权利要求4所述的宿主菌， 其特征在于， 所述宿主菌为大肠杆菌或青枯菌Tb15或 Tb1546。 8.权利要求1所述的噬菌体trp574基因在制备无致病力青枯菌株中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 将含噬菌体trp574基因的重组表达载体转 化至野生型青枯菌中。 10.权利要求1所述的噬菌体trp574基因在防治青枯病中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112048514 A 2 一种噬菌体trp574基因及其应用 技术领域 0001 本发明涉及青枯菌防治技术领域， 更具体地， 涉及一种噬菌体trp574。

5、基因及其应 用。 背景技术 0002 茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum， 简称青枯菌)是 -变形菌亚门的一类滋 生于土壤的革兰氏阴性细菌。 该病菌通常可从植物根部或茎部的伤口或是从没有受伤的次 生根的根冠部位侵入皮层细胞间隙， 通过破坏细胞间中胶层， 使细胞壁分离， 变形， 形成空 腔， 进而侵染木质部薄壁组织使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体， 并移入侵填体。 待侵 填体破裂后， 青枯菌继续被释放进入导管， 并在导管内大量繁殖和快速扩散， 从而引起植株 萎蔫死亡。 这种毁灭性的土传病害被称为作物青枯病， 全世界每年因此病害所造成的经济 损失数以亿计。 青枯菌宿主广泛。

6、， 能侵染包括生姜、 烟草、 番茄、 马铃薯、 花生、 桑树以及木麻 黄在内的50多科200多种作物。 该病主要发生在亚热带和热带地区， 并逐渐向温带地区扩 散， 其发病情况逐年加重， 寄主范围不断扩大。 目前， 对作物青枯病的防治方法主要包括化 学防治、 生物防治、 种植抗病品种、 作物轮作等， 这些措施虽然对青枯病起到了一定程度的 控制作用， 但依然无法有效地控制该病。 0003 噬菌体是一种通过与细菌细胞表面特异位点结合后杀灭特异性细菌的病毒， 具有 杀菌特异性强、 对人畜无害、 利用致病菌为宿主不断自我增殖等显著的优点， 极具作为新型 生物农药有效成分的开发潜质。 利用噬菌体防治作物青。

7、枯病具有重要的实际意义。 丝状噬 菌体和侵染青枯菌能降低青枯菌的毒力， 其生理生化也发生变化(Addy et al.,2012)， 而将丝状噬菌体侵染的青枯菌先接种于番茄根部， 再接种野生型青枯 菌， 通过荧光检测方法发现， 野生型青枯菌其毒力受到抑制， 番茄整体发病率下降(Addy et al.,2012)。 Fujiwara等(2011)使用烈性青枯菌噬菌体进行青枯病的生物防治， 证明了噬菌 体用于青枯病防治具有一定的效果。 由于噬菌体不具有完整细胞结构， 只含有单一核酸， 可 视为一种 “捕食” 细菌的生物； 虽然噬菌体基因组含有许多个基因， 但所有已知的噬菌体都 是利用细菌细胞的核糖体。

8、、 蛋白质合成时所需的各种因子、 各种氨基酸和能量产生系统来 实现其自身的生长和增殖， 一旦离开了宿主细胞， 噬菌体既不能生长， 也不能复制。 因此在 利用噬菌体进行细菌病害防治时， 需要将噬菌体连同其宿主菌一同施用， 由于宿主菌存在 的致病力， 容易给需要防治的植物带来其它风险。 因此， 可以尝试通过利用无致病力的青枯 菌菌株作为噬菌体的宿主， 对噬菌体进行培养， 然后对植物细菌性青枯病进行防治， 可以避 免宿主菌自身致病力带来的对作物的风险。 0004 另外一方面， 利用无致病力青枯菌株防治作物青枯病， 是目前植物病害生物防治 的研究重点之一， 并已有成功应用的案例(董春,曾宪铭,刘琼光.。

9、利用无致病力青枯菌株防 治番茄青枯病的研究J.华南农业大学学报,1999,020(004):1-4.)。 目前， 无致病力的青 枯菌菌株主要是通过从植物组织中分离筛选(肖田,肖崇刚,邹阳,等.青枯菌无致病力菌株 对烟草青枯病的控病作用初步研究J.植物保护,2008,34(002):79-82.)， 或通过人工选 说明书 1/10 页 3 CN 112048514 A 3 择性培养使有致病力菌株转化为无致病力菌株， 或通过紫外光诱变法获得(陈庆河,翁启 勇,胡方平.无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果J.中国生物防治,2004,20 (001):42-44.)， 或通过将青枯菌菌株中致病相关的。

10、毒力因子敲除获得无致病力的青枯菌， 还未见有向青枯菌菌株中导入外源基因， 从而获得无致病力青枯菌株的相关报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的上述不足， 提供一种噬菌体trp574基因。 0006 本发明的第二个目的在于提供由所述噬菌体trp574基因编码的蛋白质。 0007 本发明的第三个目的在于提供用于扩增、 检测所述噬菌体trp574基因的引物对。 0008 本发明的第四个目的在于提供含有所述噬菌体trp574基因的重组表达载体、 宿主 菌或细胞系。 0009 本发明的第五个目的在于提供所述噬菌体trp574基因在构建无致病力青枯菌株 中的应用。 0010 本发明的上。

11、述目的是通过以下技术方案给予实现的： 0011 一种噬菌体trp574基因， 所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 0012 本发明通过对裂解性噬菌体P574进行基因组测序， 发现了一个全新的转录调节因 子orf30， 然后根据噬菌体基因组序列设计引物并PCR扩增获得约688bp的目的片段， 将目的 片段进行测序， 发现所述orf30序列为555bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 其编码的 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； BALST比对搜索发现， orf30只与Ralstonia phage GP4具 有82的同源性， 蛋白搜索结果显示其具有转录调节因子。

12、(Transcriptional regulator) 的保守序列， 氨基酸序列同源性最高也不到70。 因此， 将rf30命名为trp574基因， 其中T代 表Transcriptional regulator， R代表Ralstonia(青枯菌)， P574代表这个基因来自噬菌体 P574。 0013 所述噬菌体trp574基因编码的蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 0014 本发明还提供一种用于扩增检测所述噬菌体trp574基因的引物对， 其特征在于， 所述引物对序列如SEQ ID NO:34所示。 0015 本发明还提供含有所述噬菌体trp574基因的重组表达载体。 0。

13、016 优选地， 所述表达载体为pBBR1MCS4。 0017 本发明还提供含有所述重组表达载体的宿主菌。 0018 优选地， 所述宿主菌为大肠杆菌或青枯菌； 所述青枯菌为青枯菌Tb15或Tb1546。 0019 本发明还提供含有所述重组表达载体的细胞系。 0020 本发明研究表明， 转化了噬菌体trp574基因的青枯菌株几乎丧失了致病力。 转化 菌株在LB中的生长速度加快， TTC平板上菌落形态干燥扁平， 呈深红色， 胞外多糖产量下降， 纤维素酶活性降低。 qRT-PCR结果表明， trp574基因能够调控phc系统及多个双组分系统， 从 而影响青枯菌的致病性， trp574基因具有显著干扰。

14、青枯菌的生长、 代谢、 致病性等综合作 用。 trp574基因可用于制备无致病力青枯菌株， 从而用于青枯病的防治。 0021 因此， 本发明请求保护所述噬菌体trp574基因在制备无致病力青枯菌株中的应 用。 0022 具体地， 所述应用为将含噬菌体trp574基因的重组表达载体转化至野生型青枯菌 说明书 2/10 页 4 CN 112048514 A 4 中， 获得无致病力青枯菌株。 无致病力的青枯菌可作为噬菌体的宿主， 对噬菌体进行大量培 养， 然后对植物细菌性青枯病进行防治， 可以避免宿主菌自身致病力带来的影响。 同时无致 病力的青枯菌菌株对青枯病将具有一定的生防作用。 0023 与现有。

15、技术相比， 本发明具有以下有益效果： 0024 本发明发现并克隆了全新的噬菌体trp574基因， 其核苷酸序列和编码的蛋白的氨 基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。 所述噬菌体trp574基因具有显著干扰青 枯菌的生长、 代谢、 致病性等综合作用， 转化了噬菌体trp574基因的青枯菌株几乎丧失了致 病力， 从而利用无致病力的青枯菌作为噬菌体的培养宿主菌或利用无致病力青枯菌进行青 枯病防治； 本发明首次通过将噬菌体外源基因trp574转入到青枯菌菌株中获得了无致病力 的青枯菌， 在防治青枯病中具有较大的应用前景。 附图说明 0025 图1为orf30与近缘蛋白氨基。

16、酸序列比对结果； 其中， YP_007236754 .1、 WP_ 066491583 .1、 WP_034473760和WP_090835493为NCBI蛋白序列号， 分别对应着 Transcriptional regulatorBurkholderia virus Bcepmigl， XRE family transcriptional regulatorBurkholderia sp.BDU8， XRE family transcriptional regulatorCaballeronia zhejiangensis和XRE family transcriptional regulat。

17、or Paraburkholderia hospita。 0026 图2为基于SWISS-MODEL的orf30蛋白结构预测； 图中a1与a2， b1与b2， c1与c2分别 为同一蛋白正反面。 0027 图3为orf30基因克隆及酶切验证结果。 M1为DL2000Marker， M2为DL5000Marker； A 为orf30片段克隆； B为重组质粒的PCR验证， 其中2为重组质粒， 3为pBBR1MCS4质粒； C为 orf30重组质粒及空质粒转化至Tb1546， 其中4为orf30-Tb1546， 5为pBBR-Tb1546， 6为 pBBR1MCS4质粒， 7为阴性对照； D为orf。

18、30重组质粒及空质粒转化至Tb15， 其中8为阴性对照， 9为orf30-Tb15， 10为pBBR-Tb15， 11为pBBR1MCS4质粒； E为重组质粒酶切验证图， 其中12为 空白对照， 13为pBBR-orf30重组质粒， 14为pBBR1MCS4质粒。 0028 图4为Tb1546、 Tb15及其转orf30基因菌株在不同培养基中的生长曲线； 其中， A、 B 为LB液体培养基； C、 D为NA液体培养基。 0029 图5为Tb1546、 Tb15及其转orf30基因菌株的菌落形态差异。 A、 B、 C、 D、 E、 F分别为 Tb1546、 orf30-Tb1546、 pBBR-。

19、Tb1546、 Tb15、 orf30-Tb15与pBBR-Tb15。 0030 图6为Tb1546、 Tb15及其转orf30基因菌株的EPS产量测定。 LSD法进行多重比较(p 0.05)。 0031 图7为Tb1546、 Tb15及其转orf30基因菌株在纤维素酶检测平板上的水解直径测 定。 CK以NA培养基做为空白对照； A、 C为Tb1546、 orf30-Tb1546和pBBR-Tb1546上清液提取物 在纤维素酶检测平板上的水解圈直径； B、 D为Tb15、 orf30-Tb15和pBBR-Tb15上清液提取物 在纤维素酶检测平板上的水解圈直径。 LSD法进行多重比较(p0.05。

20、)。 0032 图8为Tb1546与orf30-Tb1546在LB中的竞争生长。 0033 图9为针刺法和灌溉法接种Tb1546和orf30-Tb1546后烟草青枯病病情指数变化。 注： A和B为针刺法接种Tb1546和orf30-Tb1546后的发病状况， E为病情指数统计； C和D为灌 说明书 3/10 页 5 CN 112048514 A 5 溉法接种Tb1546和orf30-Tb1546后的发病状况， F为病情指数统计。 0034 图10为Tb1546与orf30-Tb1546的基因相对表达量。 具体实施方式 0035 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明， 但实施例并不对。

21、本发明 做任何形式的限定。 除非特别说明， 本发明采用的试剂、 方法和设备为本技术领域常规试 剂、 方法和设备。 0036 除非特别说明， 以下实施例所用试剂和材料均为市购。 0037 1、 供试菌株 0038 本发明实施例中所述菌株、 质粒及噬菌体详见表1。 青枯菌及噬菌体均在30培 养， 大肠杆菌DH5 、 携带质粒及重组质粒的大肠杆菌均在37下培养。 氨苄青霉素工作浓度 为100 g/mL。 0039 表1供试菌株、 质粒及噬菌体 0040 0041 0042 2、 常用培养基及试剂 0043 LB培养基： 氯化钠10g/L， 胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， 琼脂粉15g/L。

22、。 0044 NA培养基： 牛肉浸膏3g/L， 蛋白胨5g/L， 酵母提取物0.5g/L， 葡萄糖10g/L， 琼脂粉 15g/L， pH7.0。 0045 TTC培养基： 水解酪蛋白1g/L， 蛋白胨10g/L， 甘油5mL/L， 琼脂粉32g/L， 使用前每 100mL培养基加1TTC 500 L。 0046 纤维素酶检测平板： 羧甲基乙基纤维素1.0g/L， 磷酸钠3.8g/L， 琼脂糖8.0g/L， pH 7.0。 0047 普通细菌固体培养基： 牛肉膏3g/L， 酵母膏3g/L， 蛋白胨3g/L， 硫酸镁0.25g/L， 磷 酸氢二钾2g/L， 磷酸二氢钾0.5g/L， 蔗糖15g/。

23、L， 琼脂粉18g/L。 说明书 4/10 页 6 CN 112048514 A 6 0048 普通细菌半固体培养基： 牛肉膏3g/L， 酵母膏3g/L， 蛋白胨3g/L， 硫酸镁0.25g/L， 磷酸氢二钾2g/L， 磷酸二氢钾0.5g/L， 蔗糖15g/L， 琼脂粉8g/L。 0049 实施例1 trp574基因(orf30)的生物信息学分析 0050 本发明前期通过对裂解性噬菌体P574进行基因组测序， 发现了一个转录调节因子 orf30， 使用NCBI的Blastp对该基因蛋白序列进行比对； 使用ProtParam工具(https:/ web.expasy.org/protparam/。

24、)对蛋白质理化性质进行分析； 使用SMART服务器(http:/ smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白质结构域分析； 使用SWISS-MODEL(https:/ www.swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质模型构建。 0051 NCBI的Blastp结果显示， orf30基因属于XRE家族， 比对结果显示与伯克氏菌噬菌 体Bcepmigl属于XRE家族的转录调节因子具有69同源性， 下载比对结果中得分最高的四 个蛋白序列， 使用ClustalX软件进行多序列比对， 比对结果经Boxshade(https:/ embnet.vital-it.ch/so。

25、ftware/BOX_form.html)进行着色处理后如图1所示； 蛋白质理化 性质表明该蛋白共184个氨基酸， 约20.235KD， 等电点约为9.20， 不稳定指数(II)为39.63， 属于稳定型蛋白， 脂肪指数81.20， 总平均亲水性为-0.368， 属亲水性蛋白。 SMART服务器分 析该蛋白结构功能域， 发现该蛋白的151位存在Cro/CI型HTH结构， 该结构一般由5060 个组成的与DNA结合的螺旋-转角-螺旋(HTH)结构域。 该蛋白在SWISS-MODEL模型建立如图2 所示。 0052 实施例2trp574基因(orf30)克隆与重组质粒构建 0053 1、 方法 0。

26、054 (1)使用广州诺晶生物技术有限公司的通用噬菌体DNA提取试剂盒(货号： KG005- 1)提取噬菌体DNA， 根据P574基因组信息设计目的基因orf30的扩增引物orf30-F/orf30-R (如表2所示)； 以噬菌体DNA为模板， orf30-F/orf30-R为引物， 利用诺唯赞Master Mix对目的基因orf30进行扩增， 扩增体系为Master Mix 25 L， Primer1 1 L， Primer2 1 L， 模版DNA 1 L(200ng)， 补足ddH2O至50 L。 PCR扩增条件为： 953min； 95 10s， 5530s， 7240s， 35个循环；。

27、 7210min， 4， 。 将PCR产物进行电泳后， 对凝胶电泳 中的目的条带进行切胶回收。 0055 (2)pBBR1MCS4质粒提取参照Axygen质粒小提试剂盒说明书提取， 经BamHI和Hind III双酶切后利用诺唯赞II One Step Cloning Kit进行连接， 热激转化至DH5 。 涂板后的平板于37倒置培养24h， 至出现单菌落， 使用MCS-F/MCS-R引物(如表2所示)进 行菌落PCR， PCR体系为： 模板5 L， 10Buffer 1 L， dNTP 0.8 L， MSC-F 0.4 L， MSC-R 0.4 L， Taq酶0.08 L， ddH2O2.3。

28、2 L， 总体系10 L。 PCR程序为： 945min； 9430s， 5530s， 72 40s， 30循环； 725min， 16。 对含有目的条带的菌株进行液体培养， 提取质粒并使用BamHI 和Hind III进行酶切验证， 同时将重组质粒交由英潍捷基进行测序鉴定。 获得的重组质粒 命名为pBBR-orf30。 0056 表2 orf30-F/orf30-R和MCS-F/MCS-R引物序列 说明书 5/10 页 7 CN 112048514 A 7 0057 0058 2、 结果 0059 (1)根据噬菌体基因组序列设计引物并PCR扩增获得约688bp的目的片段(图3A)， 将目的片。

29、段进行测序， 发现所述orf30序列为555bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 其 编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示； BALST比对搜索发现， orf30只与Ralstonia phage GP4具有82的同源性， 蛋白搜索结果显示其具有转录调节因子(Transcriptional regulator)的保守序列， 氨基酸序列同源性最高也不到70。 因此， 将rf30命名为trp574基 因， 其中T代表Transcriptional regulator， R代表Ralstonia(青枯菌)， P574代表这个基因 来自噬菌体P574。 0060 (2)将orf3。

30、0目的片段用一步克隆方式获得的重组质粒pBBR-orf30， 其检测片段大 小为977bp(图3B)， 重组质粒酶切结果显示两条带， 与预计的646bp接近(图3E)， 测序结果与 预测结果一致， 证明重组质粒构建成功。 0061 实施例3转trp574基因(orf30)青枯菌Tb1546和Tb15的制备 0062 1、 青枯菌感受态细胞制备与电转化 0063 青枯菌Tb15电击感受态的制备及电击转化方法参考Lavie等(2002)的方法。 0064 (1)将青枯菌Tb1546和Tb15分别接种于10mL NA培养基过夜培养， 将菌液置于冰上 冰浴15min， 分装至预冷的1.5mL离心管中，。

31、 46000rpm离心5min， 弃上清。 0065 (2)加入1mL 10甘油重悬， 46000rpm离心5min， 弃上清。 0066 (3)重复步骤(2)两次。 0067 (4)加入10甘油100 L重悬获得青枯菌感受态。 0068 (5)分别取50 L制备好的Tb1546和Tb15青枯菌感受态于0.1cm电击杯， 并加入约2 g重组质粒pBBR-orf30， 选择手动模式设置电压1.4kv， 进行电击转化。 同时取pBBR1MCS4质 粒约2 g于青枯菌感受态中进行空载体电击转化。 转化结束后立刻加入800 L NA液体培养 基复苏12h， 于含Amp抗生素的NA培养基上涂板， PCR。

32、筛选转化子orf30-Tb1546、 pBBR- Tb1546、 orf30-Tb15与pBBR-Tb15， PCR引物及条件同实施例2重组质粒构建。 0069 通过上述步骤成功将重组质粒电击转化入青枯菌Tb1546和Tb15中， 获得转基因菌 株orf30-Tb1546， orf30-Tb15； 同时将空质粒电击转入Tb1546和Tb15中， 获得pBBR-Tb1546 和pBBR-Tb15(图3-C、 D)。 0070 2、 菌落形态观察与生长曲线测定 0071 NA液体培养基培养Tb1546、 orf30-Tb1546、 pBBR-Tb1546、 Tb15、 orf30-Tb15与 pB。

33、BR-Tb15获得种子液， 调整菌浓度为1108cfu/mL， 稀释涂板至TTC平板， 观察菌落形态。 另取种子液调整菌浓度约为1108cfu/mL， 以1： 100分别接入LB液体培养基与NA液体培养 基， 每2h测定一次OD600， 实验重复3次。 0072 结果显示， 在LB液体培养基中orf30-Tb1546和orf30-Tb15生长速度显著快于野生 说明书 6/10 页 8 CN 112048514 A 8 菌， 在1214h开始生长速度显著增加， 24h后已接近生长后期(图4-A、 B)。 而在NA液体培养 基中， 转入orf30基因的orf30-Tb1546和orf30-Tb15。

34、菌株在对数生长期速度略快于野生菌 但无显著差异。 在生长后期， orf30-Tb1546与野生菌浓度差异不显著(图4C)， 但orf30-Tb15 浓度显著低于野生菌(图4D)。 0073 青枯菌在TTC培养基上能形成粉红色菌落， 并在粉红色菌落外产生大量白色的胞 外多糖， 且致病力越强， 胞外多糖含量越高。 Tb1546、 pBBR-Tb1546、 Tb15与pBBR-Tb15在TTC 上能够形成圆滑的粉红色菌落并产生大量胞外多糖， 而转入orf30基因的orf30-Tb1546与 orf30-Tb15菌株， 在TTC平板上形成干瘪的菌落， 其胞外多糖含量较少(图5)。 0074 3、 胞外。

35、多糖产量测定 0075 胞外多糖提取参考Vojnov等(1998)的方法并加以改进。 取培养至OD6000.5的青 枯菌1mL于100mL NA培养基中培养1d， 10000rpm离心10min， 将菌体烘干称重。 上清加入2倍 体积的无水乙醇， 并加入氯化钠至终浓度为5， 搅拌溶解， 4静置。 24h， 10000rpm离心 10min， 取沉淀， 加入无水乙醇洗涤一遍， 获得粗制胞外多糖， 烘干称重， 计算单位菌量的胞 外多糖产量， 实验重复3次。 每克干菌胞外多糖产量(g)胞外多糖质量(g)干菌质量(g)。 0076 结果表明， orf30-Tb1546与orf30-Tb15的胞外多糖产。

36、量显著低于对应的野生菌及 空载野生菌(图6)。 菌株胞外多糖产量测定显示携带orf30基因的青枯菌， 其胞外多糖含量 显著低于野生菌， 表明orf30基因能够抑制EPS的产生。 0077 4、 纤维素酶检测 0078 纤维素酶检测平板倒板凝固晾干， 用7mm打孔器打孔备用。 将野生型菌株， 重组菌 株及空载菌株于10mL NA液体中培养至OD6001.0， 6000rpm离心5min， 取上清各50 L， 分别 加入打好的孔中， 正置于培养箱培养24h。 用0.1刚果红溶液染色20min， 再用1mol/L氯化 钠溶液洗脱15min， 并水洗一次， 测量透明圈直径， 实验重复3次。 0079 。

37、结果表明， orf30-Tb1546纤维素酶活性显著小于野生菌， 其致病力下降。 而Tb15、 orf30-Tb15与pBBR-Tb15纤维素酶活性无显著差异， 可能由于Tb15纤维素酶本身活性较低， 导致orf30对其影响不显著(图7)。 0080 5、 竞争生长 0081 液体培养Tb1546与orf30-Tb1546获得种子液， 调整菌浓度约为1108cfu/mL， 按 Tb1546： orf30-Tb1546： LB1： 1： 100接入LB液体培养基振荡培养， 每4h取样涂板至TTC平 板， 统计平板上不同菌落形态数量， 实验重复3次。 0082 结果表明， 在培养过程中， 随着培养。

38、时间增加， Tb1546所占比例显著少于orf30- Tb1546(图8)， 表明orf30基因能够影响细菌生长速度。 0083 6、 致病力测定 0084 盆栽培养烟草K326至苗期， 以20株为一组。 于NA中培养Tb1546与orf30-Tb1546至 对数生长期， 调整菌浓度约为1108cfu/mL， 用注射器抽取1mL对盆栽的苗期烟草茎干进行 刺伤接种， 伤口处覆盖棉花， 将多余菌液打入棉花中。 接种后3d内， 每12h对棉花进行一次保 湿处理。 同时， 另取一批盆栽苗期烟草采用灌溉法进行灌溉接种。 先用刀具划伤烟草根部， 将菌浓度约为108cfu/mL的菌液稀释25倍， 每株灌溉5。

39、00mL， 保证浇透盆栽内土壤。 0085 自野生菌组开始发病起， 每2d记录一次发病级数， 并统计病情指数。 发病级数参考 烟草病虫害分级标准 【GB/T 23222-2008】 ： 说明书 7/10 页 9 CN 112048514 A 9 0086 0级： 全株无病； 0087 1级： 茎部偶有褪绿条斑； 或病侧1/2以下叶片凋萎； 0088 3级： 茎部有黑色条斑， 但不超过茎高的1/2； 或病侧1/2至2/3叶片凋萎； 0089 5级： 茎部黑色条斑超过茎高的1/2， 但未到达茎顶部； 或病侧2/3以上叶片凋萎； 0090 7级： 茎部黑色条斑到达茎顶部； 或病株叶片全部凋萎； 00。

40、91 9级： 病株基本枯死。 0092 病情指数公式为： 病情指数( 各级代表值株数 ) 最高级代表值总株 数 100。 0093 结果显示， 针刺法能够更明显地显示致病菌的侵染效果。 在发病后， 针刺法处理的 烟草青枯病病情指数上升速度显著快于灌溉法(图9)。 针刺法接种结果显示， 在接种Tb1546 的对照组发病22d后， 接种orf30-Tb1546的实验组开始发病， 在第34d后， 发病率趋于稳定。 此时， 对照组与实验组病情指数相差在50以上。 而灌溉法实验组完全不发病， 对照组最终病 情指数达40以上。 以上结果表明， orf30-Tb1546对烟草的致病性显著降低， orf30明。

41、显影响 Tb1546的致病力。 0094 7、 qRT-PCR基因表达及调控分析 0095 (1)RNA提取及反转录 0096 参照天根生化科技(北京)有限公司的培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(货号 DP430)说明书进行RNA提取， 并立刻使用Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒(货号RR036A)进行反转录， 反转录体系为： RNase Free ddH2O 7 L， 不含DNA的RNA 1 L(500ng)，RT Master Mix 2 L， 总体系10 L。 在PCR 仪上进行反转录， 程序为： 37。

42、15min， 855s， 4。 反转录产物保存于-20， 用于下一步 的qRT-PCR实验。 0097 (2)qRT-PCR相对定量分析 0098 根据qRT-PCR引物设计规则设计引物(表3)。 0099 将反转录产物稀释(一般为10100倍)， 使用Takara公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(货号RR820A)配制qRT-PCR体系， 体系为： ddH2O 8.5 L， 2TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)12.5 L， Primer1 1 L， Primer2 1 L， 模。

43、板2 L， 总体系25 L。 qRT-PCR仪器为Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪， 反应管采用Axygen的8联排 管(购自百赛生物， 货号PCR-0108-LP-RT-W)， 反应程序为： Hold(预变性)9530s； 2Step PCR955s， 6030s， 40cycle； Dissociation 9510s， 655s， 955s。 数据采用2- Ct法 (Livak and Schmittgen,2001)进行相对表达量分析， 以16S作为内参基因， Ct值为荧光值 达到阈值时的PCR循环数， test为实验组， con为对照组， 重复3次。 Cttest实验组目的。

44、基 因Ct值-实验组16S基因Ct值； Ctcon对照组目的基因Ct值-对照组16S基因Ct值； Ct Cttest-Ctcon； 目标基因相对表达量2- Ct。 0100 表3 qRT-PCR所用引物 说明书 8/10 页 10 CN 112048514 A 10 0101 0102 0103 通过对Tb1546中的phc系统、 EPS、 T3SS、 鞭毛系统、 T6SS、 纤维素酶及重要调控基因 进行qRT-PCR表达量的分析。 这些致病相关基因的表达量均明显下降(图10)。 表明， orf30能 够严重干扰青枯菌致病因子的产生， 从而降低青枯菌的致病力。 0104 本发明上述结果表明， 。

45、trp574(orf30)基因属于XRE家族的转录调节因子， 转化了 orf30的青枯菌株几乎丧失了致病力。 转化菌株在LB中的生长速度加快， TTC平板上菌落形 态干燥扁平， 呈深红色， 胞外多糖产量下降， 纤维素酶活性降低。 qRT-PCR结果表明， orf30能 够调控phc系统及多个双组分系统， 从而影响青枯菌的致病性， orf30具有显著干扰青枯菌 说明书 9/10 页 11 CN 112048514 A 11 的生长、 代谢、 致病性等综合作用。 trp574(orf30)基因可用来制备无致病力青枯菌株， 在青 枯病防治中具有中较大的应用前景。 说明书 10/10 页 12 CN 。

46、112048514 A 12 序列表 华南农业大学 江西省烟草公司吉安市公司 一种噬菌体trp574基因及其应用 4 SIPOSequenceListing 1.0 1 555 DNA 青枯菌(Ralstonia solanacearum) 1 atggcacagc ggaaaatctc tctgcggcag ctcgctgaga agatgggcct tgcgcactca 60 gctctcagca tcaccttcag cggctcgcgg cgcatgcagt tggaggaggc cgcacagctc 120 tccaacatct tcggcgttcc catccacgag atcat。

47、cgaca acgccggcgt gtctgcccgg 180 ccgatcagca gcgcgcgcgt gtcggtcgtc ggcgccctgc gcggtgacgg ccacgtcgag 240 aagatcggcg gaaagcacac agagcgcacg tcggcgccgc ctgggtcgcc tgaaggcaca 300 gaggcgatcc agtcacgcac ggcggacacg cccctatcat ggatggacgg ctgggtcttt 360 ttcttcgtcc cgtccgacag catccatccc gatgcgatag gccgcctgtg cta。

48、cctgaaa 420 atccacgagg gcgagcacgt catagccgcg atcaagcgag gatacaggga aaacacctac 480 aacctctctg gccctcacac caaggagaac gcgcggatcg attgggctac gccgatcagg 540 tggacgcgca actag 555 2 184 PRT 青枯菌(Ralstonia solanacearum) 2 Met Ala Gln Arg Lys Ile Ser Leu Arg Gln Leu Ala Glu Lys Met Gly 1 5 10 15 Leu Ala His S。

49、er Ala Leu Ser Ile Thr Phe Ser Gly Ser Arg Arg Met 20 25 30 Gln Leu Glu Glu Ala Ala Gln Leu Ser Asn Ile Phe Gly Val Pro Ile 35 40 45 His Glu Ile Ile Asp Asn Ala Gly Val Ser Ala Arg Pro Ile Ser Ser 50 55 60 Ala Arg Val Ser Val Val Gly Ala Leu Arg Gly Asp Gly His Val Glu 65 70 75 80 Lys Ile Gly Gly Ly。

50、s His Thr Glu Arg Thr Ser Ala Pro Pro Gly Ser 85 90 95 序列表 1/2 页 13 CN 112048514 A 13 Pro Glu Gly Thr Glu Ala Ile Gln Ser Arg Thr Ala Asp Thr Pro Leu 100 105 110 Ser Trp Met Asp Gly Trp Val Phe Phe Phe Val Pro Ser Asp Ser Ile 115 120 125 His Pro Asp Ala Ile Gly Arg Leu Cys Tyr Leu Lys Ile His Glu Gl。