新冠病毒检测试剂盒及其检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011056732.4 (22)申请日 2020.09.30 (71)申请人 北京吉检医疗科技有限公司 地址 102200 北京市昌平区科技园区创新 路27号3号楼4层8402 (72)发明人 韩亚平柴旭阳臧百盛张淼 顾城玮 (74)专利代理机构 北京艾格律诗专利代理有限 公司 11924 代理人 谢毅 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种新冠病毒。

2、检测试剂盒及其检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种新冠病毒检测试剂盒及 其检测方法， 属于分子生物学检测技术领域。 本 发明重新设计了一系列检测新型冠状病毒的引 物探针组， 对现有检测方法进行了改进， 进一步 增加检测靶点， 从而增加了对新型冠状病毒的检 测灵敏度， 尤其针对低拷贝数样本的检测， 可以 显著减少假阴性结果， 有效提高检测实现灵敏度 和准确度， 高效率、 高特异性、 低成本检测。 可用 于体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似 病例、 疑似聚集性病例患者、 其他需要进行新型 冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭子、 痰 液等样本中的新型冠状病毒基因。 权利要求书2页 说明书1。

3、1页 序列表3页 附图10页 CN 112048574 A 2020.12.08 CN 112048574 A 1.一种用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组， 其特征在于， 包括用于检测ORF1ab 基因的引物探针组Covid-19A、 用于检测N基因的引物探针组Covid-19B和用于检测E基因的 引物探针组Covid-19C中的至少一种。 2.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组， 其特征在于， 所述 用于检测ORF1ab基因的引物探针组包括引物ORF1ab-F和ORF1ab-R以及检测用探针ORF1ab- P； 所述用于检测N基因的引物探针组包括引物N-F和N-R以及。

4、检测用探针N-P； 所述用于检测 E基因的引物探针组包括引物E-F和E-R以及检测用探针E-P。 3.根据权利要求2所述的用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组， 其特征在于， 所述 引物探针组的序列信息如下: ORF1ab-F:TGGTACTGGTCAGGCAATAAC, ORF1ab-R:TGATCTATGTGGCAACGGC, ORF1ab-P:CTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCT； N-F:GACCCCAAAATCAGCGAAATG N-R:CCACTGCGTTCTCCATTCTG N-P:TGCCAGTTGAATCTGAGGGTCCAC； E-F:CGGAAGAGACAGG。

5、TACGTTAATAG E-R:CGCAGTAAGGATGGCTAGTG E-P:ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTACGC。 4.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组， 其特征在于， 所述 探针的5 端标记有荧光基团， 3 端标记有荧光淬灭基团， 针对不同靶基因的探针分别标记 有不同的荧光基团。 5.一种新冠病毒检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的用于检测新型冠状病 毒基因的引物探针组。 6.根据权利要求5所述的新冠病毒检测试剂盒， 其特征在于， 还包括用于PCR检测的 Tris缓冲液、 镁离子、 dA/G/C/UTPs、 DNA聚合酶、 逆转录。

6、酶、 UNG酶。 7.根据权利要求6所述的新冠病毒检测试剂盒， 其特征在于， 还包括内标及用于检测内 标的引物探针组。 进一步的， 具体包括引物RP-F和RP-R以及检测用探针RP-P， 其具体序列 为： RP-F： AGATTTGGACCTGCGAGCG， RP-R： GAGCGGCTGTCTCCACAAGT， RP-P： TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。 8.一种新冠病毒检测方法， 其特征在于， 采用权利要求6所述新冠病毒检测试剂盒， 利 用PCR技术进行检测。 9.根据权利要求8所述的新冠病毒检测方法， 其特征在于， 所述引物在PCR反应体系中 的终浓度之和在50500n。

7、M之间， 所述探针在PCR反应体系中终浓度之和在25250nM之间。 10.根据权利要求8所述的新冠病毒检测方法， 其特征在于， 具体包括以下步骤： (1)样本处理； (2)试剂准备； (3)加样； 权利要求书 1/2 页 2 CN 112048574 A 2 (4)PCR扩增； (5)结果分析。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112048574 A 3 一种新冠病毒检测试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种新冠病毒检测试剂盒及其检 测方法。 背景技术 0002 2019新型冠状病毒(COVID-19)属于乙型冠状病毒属病毒， 是人类历史上。

8、确定的第 7种可感染人的冠状病毒(HCoV)， 其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。 2020年2 月11日， 国际病毒分类委员会(ICTV)宣布， 2019新型冠状病毒的分类名为严重急性呼吸综 合证冠状病毒2(SARS-Cov-2)， 同日世界卫生组织(WHO)将这一病毒感染导致的疾病正式命 名为COVID-19。 2019新型冠状病毒肺炎主要经飞沫、 接触传播， 人群普遍易感。 2019新型冠 状病毒感染的一般症状有： 发热、 乏力、 干咳， 逐渐出现呼吸困难， 部分患者起病症状轻微， 甚至可无明显发热。 严重症状有： 急性呼吸窘迫综合征、 脓毒性休克、 难以纠正的代。

9、谢性酸 中毒、 出凝血功能障碍。 除上述症状， 还有可能具有如下不典型症状： 如轻度纳差、 乏力、 恶 心呕吐、 腹泻、 头痛等。 从目前的收治的病例情况看， 多数患者预后良好， 少数患者病情危 重， 甚至与其它基础性疾病并发导致死亡。 因此及时、 准确检测该新型冠状病毒十分重要。 0003 目前检测新型冠状病毒COVID-19的PCR检测试剂盒市面上已有销售， 但是对于 COVID-19检测的灵敏度、 准确度(比如减少假阴性等)等方面需要进一步提高。 目前主流新 冠检测试剂盒使用的是国家疾病预防控制中心新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南中 推荐的核酸检测方案。 在实际的应用过程中出现了大量的。

10、假阴性和大量复阳的情况， 而后 国家改变了新冠确诊的标准即使核酸检测结果为阴性也可根据临床症状进行确诊。 同时在 出院的标准上要进行三次核酸检测均为阴性才可出院。 这都反应了目前引物探针检测的灵 敏度和准确性都有待提高。 发明内容 0004 针对上述不足， 本发明重新设计了一系列检测新型冠状病毒的引物探针组， 对现 有检测方法进行了改进， 进一步增加检测靶点， 从而增加了对新型冠状病毒的检测灵敏度， 尤其针对低拷贝数样本的检测， 可以显著减少假阴性结果， 有效提高检测实现灵敏度和准 确度， 高效率、 高特异性、 低成本检测。 可用于体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似 病例、 疑似聚集性病例。

11、患者、 其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭 子、 痰液等样本中的新型冠状病毒基因。 0005 为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0006 一种用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组， 包括用于检测ORF1ab基因的引物 探针组Covid-19 A、 用于检测N基因的引物探针组Covid-19 B和用于检测E基因的引物探针 组Covid-19 C中的至少一种。 所述用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组， 可用于在同 一反应体系或单独体系内检测新型冠状病毒， 全新设计优化的引物探针组可尽量避免发卡 结构、 引物内部二聚体、 引物间二聚体以及错配的形成且能够避免与其他病毒或。

12、人类基因 说明书 1/11 页 4 CN 112048574 A 4 发生非特异结合， 从而提高检测的准确性和可靠性， 防止漏检。 0007 作为可选方式， 在上述用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组中， 所述用于检 测ORF1ab基因的引物探针组包括引物ORF1ab-F和ORF1ab-R以及检测用探针ORF1ab-P； 所述 用于检测N基因的引物探针组包括引物N-F和N-R以及检测用探针N-P； 所述用于检测E基因 的引物探针组包括引物E-F和E-R以及检测用探针E-P。 本发明针对不同靶点设计了与推荐 标准完全不同的全新的引物探针， 在实际样品测试中， 与推荐标准中的引物探针进行比较 检出。

13、了更多的阳性样本。 0008 作为可选方式， 在上述用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组中， 所述引物探 针组的序列如下: 0009 ORF1ab-F:TGGTACTGGTCAGGCAATAAC, 0010 ORF1ab-R:TGATCTATGTGGCAACGGC, 0011 ORF1ab-P:CTTTGGTGGTGCATCGTGTTGTCT； 0012 N-F:GACCCCAAAATCAGCGAAATG 0013 N-R:CCACTGCGTTCTCCATTCTG 0014 N-P:TGCCAGTTGAATCTGAGGGTCCAC； 0015 E-F:CGGAAGAGACAGGTACGTTAA。

14、TAG 0016 E-R:CGCAGTAAGGATGGCTAGTG 0017 E-P:ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTACGC。 0018 作为可选方式， 在上述用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组中， 还包括内标 引物探针组RP TEST。 通过在反应体系中加入内标引物探针， 用以监控整个检测流程， 从而 排除部分假阴性结果。 进一步的， 所述内标引物探针组RP TEST选取人基因组RNaseP基因设 计， 具体包括引物RP-F和RP-R以及检测用探针RP-P， 其具体序列为： 0019 RP-F： AGATTTGGACCTGCGAGCG， 0020 RP-R： GAGCGG。

15、CTGTCTCCACAAGT， 0021 RP-P： TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。 0022 内标引物探针是检测人的基因RNaseP， 这个基因在人体内大量存在， 只要是人类 样本就应该可以检测到这个基因， 通过对这个基因的检测来验证整个扩增系统是否正常。 如果该检测结果呈阴性说明扩增过程存在问题， 即使新冠检测为阴性也可能是假阴性结 果。 0023 作为可选方式， 在上述用于检测新型冠状病毒基因的引物探针组中， 所述探针的 5 端标记有荧光基团， 3 端标记有荧光淬灭基团， 针对不同靶基因的探针分别标记有不同 的荧光基团。 方便检测中采用不同的荧光通道对进行检测。 进一步。

16、的， 所述荧光基团可选自 FAM、 ROX、 VIC、 CY5、 HEX； 所述淬灭基团选自BHQ1、 BHQ2、 BHQ3、 MGB， 所述基团的激发和发射波 段相对分开可以在一个体系内进行分别检测。 0024 作为可选方式， 所述探针ORF1ab-P用FAM标记， 所述探针N-P用VIC标记， 所述探针 E-P用CY5标记， 所述探针RP-P用ROX标记。 0025 本发明还公开了一种新冠病毒检测试剂盒， 其特征在于， 包括本发明所述的用于 检测新型冠状病毒基因的引物探针组。 0026 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测试剂盒中， 还包括用于PCR检测的Tris缓冲 说明书 2/11 页 。

17、5 CN 112048574 A 5 液、 镁离子、 dA/G/C/UTPs、 DNA聚合酶、 逆转录酶、 UNG酶。 0027 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测试剂盒中， 还包括内标及用于检测内标的引 物探针组。 0028 作为可选方式， 所述内标为RNA假病毒， 该假病毒不包括新型冠状病毒、 人类基因 组序列或相似序列， 可用于独立对每个反应进行监控， 监控试剂盒本身及实验操作是否正 常， 用以排除因试剂盒失效或个别样本操作失误导致的假阴性。 进一步的， 所述内标引物探 针组具体包括引物RP-F和RP-R以及检测用探针RP-P， 其具体序列为： 0029 RP-F： AGATTTGGAC。

18、CTGCGAGCG， 0030 RP-R： GAGCGGCTGTCTCCACAAGT， 0031 RP-P： TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG。 0032 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测试剂盒中， 所述探针RP-P采用ROX标记。 0033 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测试剂盒中， 还包括阳性对照品以及阴性对照 品。 所述阳性对照品为含有检测靶点基因片段的假病毒。 阴性对照品为含有内标RP基因片 段的假病毒。 0034 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测试剂盒中， 还包括特异性的核酸捕获探针组 合。 所述特异性的核酸捕获探针组合包括磁珠以及能够与磁珠相连的特异性寡核苷酸序。

19、 列， 例如包括链霉亲和素磁珠和生物素标记的特异性寡核苷酸序列。 采用该核酸捕获探针 组合， 使其根据碱基互补原理与靶核酸特异性结合， 形成靶核酸-探针杂合体， 然后经磁分 离、 洗涤， 去除蛋白质和其他非特异核酸， 能够得到富集纯化的靶核酸分子。 采用该方式可 以特异性地捕获目标基因， 实现纯化和富集核酸目的， 增加检测特异性和准确性， 提高检测 灵敏度， 降低假阴性结果检出。 0035 作为可选方式， 在上述核酸捕获探针组合中， 所述特异性寡核苷酸序列具体为以 下序列中的一种或几种： 0036 名称序列 CP15 AGACTCATCAAATAAGTAGTATGTAGCCA3 CP25 AC。

20、ATTGGCTGCATTAACAAC3 CP35 TGGAGGGTAGAAAGAACAATACATAT3 CP45 ACATTCCGAAGAACGCTGAAG3 CP55 TTATTCAGCAAAATGACTTGATCTT3 CP65 CAGCATTGTTAGCAGGATTG3 0037 本发明还公开了一种新冠病毒检测方法， 其特征在于， 采用本发明所述新冠病毒 检测试剂盒， 利用PCR技术进行检测。 进一步的， 所述PCR技术为荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction， FQ-PCR)， 又称为实时定量PCR(real-。

21、time quantitative PCR,RT-qPCR)或定量PCR(qPCR)， 是由美国Applied Biosystems公司推出的 一种定量试验技术， 它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针， 标记跟踪PCR产物进行实 时监测反应， 获得扩增曲线， 利用与之相适应的软件对产物进行分析， 计算待测样品核酸模 板的初始浓度。 可以按如下步骤依据荧光定量PCR扩增曲线获得Ct(Cycle-threshold)值。 0038 a.扩增曲线特征的描述： 扩增曲线一般呈S型， 可分为基线期、 指数增长期、 线性增 长期和平台期。 说明书 3/11 页 6 CN 112048574 A 6 00。

22、39 b.基线(Baseline)设定： 根据实验情况， 选择荧光本底值较稳定的一段区域作为 基线的设定范围。 建议基线选取522个循环。 0040 c.阈值(Threshold)设定： Rn(校正后报告荧光强度)的一个值， 由软件自动确定 或手动设置， 用于在实验分析中确定Ct值。 阈值设置应高于基线， 且控制在扩增曲线的指数 增长阶段范围内， 一般以超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。 0041 d.Ct值(Cycle-threshold)： 阈值线与扩增曲线的交叉点确定Ct值。 0042 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 检测样本来源于人鼻咽拭子、 肺泡灌 洗液样本。 0043。

23、 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 所述引物在PCR反应体系中的终浓度 之和在50500nM之间， 所述探针在PCR反应体系中终浓度之和在25250nM之间。 0044 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 各组分浓度没有特殊要求， 可使用常 规的PCR反应浓度， 比如： 引物配制浓度均为0.11 mol/L， 探针配置浓度均为0.050.5 mol/L。 0.150mmol/L的dATP， 0.150mmol/L的dCTP， 0.150mmol/L的dGTP， 0.1 100mmol/L的dUTP， 120mmol/L的MgCl2、 体积百分比为3070的无酶水； 5200U。

24、的逆 转录酶， 10200U的RNA酶抑制剂， 150U的热启动DNA聚合酶， 110U的热敏UDG酶。 0045 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 具体包括以下步骤： 0046 (1)样本处理； 0047 (2)试剂准备； 0048 (3)加样； 0049 (4)PCR扩增； 0050 (5)结果分析。 0051 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 所述步骤(1)具体为： 0052 取200 l待测样本、 阳性对照和阴性对照， 分别进行核酸提取。 提取的RNA可直接用 于检测。 若样本提取后不立即检测， 可存于-70备用， 0053 避免反复冻融。 0054 作为可选方式，。

25、 在上述新冠病毒检测方法中， 所述步骤(2)具体为： 0055 取和引物探针组室温解冻后振荡混匀， 并短暂离心后备用； 取逆转录酶， 瞬时离心 后， 置于冰上备用； 根据所检测的样本数量按照下表配制反应液， 每次检测均设置阴性对照 和阳性对照， 待检样本数为n时， 需配制反应体系数N待检样本数(n)+阳性对照(1)+阴性 对照(1)+1。 0056 反应体系配制表 0057 试剂盒组分组分加入体积 PCR反应液15 lN 引物探针4.5 lN 逆转录酶0.5 lN 0058 将配制好的反应体系混匀后， 按20 l量分装到PCR反应管中， 备用。 0059 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法。

26、中， 所述步骤(3)具体为： 向分装好的体 系中分别加入5 l经过提取的阳性对照、 阴性对照和待检样本， 总反应体积为25 l。 盖紧反 应管， 瞬时低速离心。 说明书 4/11 页 7 CN 112048574 A 7 0060 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 所述步骤(4)具体为： 将PCR管按顺序 放入扩增仪样品槽中， 并依次设置阳性对照、 阴性对照、 待检样本等样品类型， 同时设置样 本名称。 选择对应的荧光通道检测目标基因。 0061 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 所述步骤(5)具体为： 反应结束后自 动保存结果， 对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。。

27、 根据分析后图像调节 Baseline的Start值、 End值以及Threshold值(以ABI7500为例， 用户可根据实际情况自行调 整， Start值可以在315、 End值可设在520， 确保所有扩增曲线的基线区部分平直； 各种 荧光通道的阈值线高度均设置为Rn6000)， 点击Analyze进行分析， 然后到Plate窗口下 记录定性结果。 0062 作为可选方式， 在上述新冠病毒检测方法中， 还包括步骤(6)质量控制： 根据各荧 光通道检测结果对应的Ct值和扩增曲线形态， 判断实验有效性。 0063 作为可选方式， 在所述步骤(1)中， 采用特异性的核酸捕获探针组合对待测样本、 。

28、阳性对照和阴性对照， 分别进行核酸富集。 具体为采用上述核酸捕获探针组合， 使其根据碱 基互补原理与靶核酸特异性结合， 形成靶核酸-探针杂合体， 然后经磁分离、 洗涤， 去除蛋白 质和其他非特异核酸， 得到富集纯化的靶核酸分子。 通过探针捕获富集核酸的方法可以特 异性地捕获目标基因， 实现纯化和富集核酸目的， 增加检测特异性和准确性， 提高检测灵敏 度， 降低假阴性结果检出。 0064 本说明书中公开的所有特征， 或公开的所有方法或过程中的步骤， 除了互相排斥 的特征和/或步骤以外， 均可以以任何方式组合。 0065 本发明具有以下有益效果： 0066 1.本发明全新设计优化的引物探针组可尽量。

29、避免发卡结构、 引物内部二聚体、 引 物间二聚体以及错配的形成且能够避免与其他病毒或人类基因发生非特异结合， 从而提高 检测的准确性和可靠性， 防止漏检。 0067 2.本发明重新设计了一系列检测新型冠状病毒的引物探针组， 对现有检测方法进 行了改进， 进一步增加检测靶点， 从而增加了对新型冠状病毒的检测灵敏度， 尤其针对低拷 贝数样本的检测， 可以显著减少假阴性结果， 有效提高检测实现灵敏度和准确度， 高效率、 高特异性、 低成本检测。 可用于体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、 疑似聚集 性病例患者、 其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭子、 痰液等样本 中的新型冠。

30、状病毒基因。 附图说明 0068 图1是本发明实施例2中采用本发明所述试剂盒检测样品1的结果图； 0069 图2是本发明实施例2中采用本发明所述试剂盒检测样品2的结果图； 0070 图3是本发明实施例2中采用现有技术检测样品1的结果图； 0071 图4是本发明实施例2中采用现有技术检测样品2的结果图； 0072 图5是本发明实施例3中采用本发明所述试剂盒检测样品1的结果图； 0073 图6是本发明实施例3中采用本发明所述试剂盒检测样品2的结果图； 0074 图7是本发明实施例3中采用现有技术检测样品1的结果图； 0075 图8是本发明实施例3中采用现有技术检测样品2的结果图； 说明书 5/11。

31、 页 8 CN 112048574 A 8 0076 图9是本发明实施例4中采用本发明所述试剂盒检测样品1的结果图； 0077 图10是本发明实施例4中采用本发明所述试剂盒检测样品2的结果图； 0078 图11是本发明实施例4中采用现有技术检测样品1的结果图； 0079 图12是本发明实施例4中采用现有技术检测样品2的结果图； 0080 图13是本发明实施例5中采用本发明所述试剂盒检测样品1的结果图； 0081 图14是本发明实施例5中采用本发明所述试剂盒检测样品2的结果图； 0082 图15是本发明实施例5中采用现有技术检测样品1的结果图； 0083 图16是本发明实施例5中采用现有技术检测。

32、样品2的结果图； 0084 图17是本发明实施例6中采用本发明所述试剂盒检测样品1的结果图； 0085 图18是本发明实施例6中采用本发明所述试剂盒检测样品2的结果图； 0086 图19是本发明实施例6中采用现有技术检测样品1的结果图； 0087 图20是本发明实施例6中采用现有技术检测样品2的结果图。 具体实施方式 0088 以下通过实施例对本发明作进一步说明。 有必要指出， 以下实施例只用于对本发 明作进一步说明， 不能理解为对本发明保护范围的限制， 所属领域技术人员根据上述发明 内容， 对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施， 仍属于发明保护的范围。 0089 1.样本类型： 以。

33、下实施例中被测样本来自咽拭子或肺泡灌洗液。 0090 2.样本采集： 按照常规样本采集方法进行采集， 或按照 新型冠状病毒感染的肺炎 防控方案 文件中 新型冠状病毒感染的肺炎实验室技术指南“标本采集方法” 相关规定执 行。 0091 3.样本保存和运送： 待测样本可立即用于处理， 能在24小时内检测的标本可置于4 保存； 24小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存(如无-70保存条件， 待测样 本可于-20保存10天， 核酸样本-205保存15天)。 应避免反复冻融。 样本运送采用冰壶 加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。 0092 实施例1各试剂的准备 0093 使用DNA合成仪通过固相亚磷。

34、酰胺三酯法合成以下几种序列： 0094 引物探针组Covid-19A： 含ORF1ab-F、 ORF1ab-R、 ORF1ab-P； 0095 引物探针组Covid-19B： 含N-F、 N-R、 N-P； 引物探针组Covid-19C： 含E-F、 E-R、 E-P； 内标引物探针组RP TEST： 含RP-F、 RP-R、 RP-P； 阳性对照品： 含有新型冠状病毒ORF1ab、 N及E 基因序列的人工合成基因； 0096 阴性对照品： 即为TE缓冲液(PH8.0)， 购自北京索莱宝科技有限公司； 0097 反应Buffer： 含Tris缓冲液、 镁离子、 dA/G/C/UTPs、 DNA。

35、聚合酶、 逆转录酶、 UNG酶： 购自北京全式金生物技术有限公司。 0098 所述探针ORF1ab-P用FAM标记， 所述探针N-P用VIC标记， 所述探针E-P用CY5标记， 所述探针RP-P用ROX标记。 0099 实施例2以ORF1ab基因和N基因为检测靶点的试剂盒 0100 按照下表组成配制试剂： 0101 组分名称主要成分 说明书 6/11 页 9 CN 112048574 A 9 PCR反应液反应Buffer、 dNTPs、 Taq酶、 UDG酶 PCR逆转录酶RT酶 PCR引物探针ORF1ab和N基因引物、 探针； 内标RP基因引物、 探针 阳性对照含ORF1ab和N基因片段的假。

36、病毒 阴性对照含内标RP基因片段的假病毒 0102 引物配制浓度为0.4 mol/L， 探针配置浓度均为0.2 mol/L。 0.1mmol/L的dATP， 0.1mmol/L的dCTP， 0.1mmol/L的dGTP， 0.1mmol/L的dUTP， 1mmol/L的MgCl2、 体积百分比为 30的无酶水； 5U的逆转录酶， 10U的RNA酶抑制剂， 1U的热启动DNA聚合酶， 1U的热敏UDG酶。 0103 1.样本处理(在样本处理区进行) 0104 取200 l待测样本、 阳性对照和阴性对照， 分别进行核酸提取。 提取的RNA可直接用 于检测。 若样本提取后不立即检测， 可存于-70备。

37、用， 避免反复冻融。 本试剂盒中的阳性对 照和阴性对照均参与提取过程。 0105 2.试剂准备(在试剂准备区进行) 0106 从试剂盒中取出2019-nCoV PCR反应液和2019-nCoV PCR引物探针， 室温解冻后振 荡混匀， 并短暂离心后备用。 取出试剂盒中的2019-nCoV PCR逆转录酶， 瞬时离心后， 置于冰 上备用。 根据所检测的样本数量按照下表配制反应液， 建议每次检测均设置阴性对照和阳 性对照。 待检样本数为n时， 需配制反应体系数N待检样本数(n)+阳性对照(1)+阴性对照 (1)+1。 0107 反应体系配制表 0108 试剂盒组分组分加入体积( l) PCR反应液。

38、15 lN PCR引物探针组4.5 lN PCR逆转录酶0.5 lN 0109 将配制好的反应体系混匀后， 按20 l量分装到PCR反应管中， 转移至样本处理区。 0110 3.加样(在样本处理区进行) 0111 向分装好的体系中分别加入5 l经过提取的阳性对照、 阴性对照和待检样本， 总反 应体积为25 l。 盖紧反应管， 瞬时低速离心， 转移至检测区。 0112 4.PCR扩增(在扩增与分析区进行) 0113 将PCR管按顺序放入扩增仪样品槽中， 并依次设置阳性对照、 阴性对照、 待检样本 等样品类型， 同时设置样本名称。 选择FAM和VIC通道分别检测2019-nCoV基因ORF1ab和。

39、N； 选 择ROX通道检测内标基因RP。 ABI 7500仪器中 “Quencher Dye” 和 “Passive Reference” 均设 置为None。 0114 5.结果分析 0115 反应结束后自动保存结果， 对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行分析。 根据 分析后图像调节Baseline的Start值、 End值以及Threshold值(以ABI 7500为例， 用户可根 据实际情况自行调整， Start值可以在315、 End值可设在520， 确保所有扩增曲线的基线 区部分平直； 三种荧光通道的阈值线高度均设置为Rn6000)， 点击Analyze进行分析， 然 后到Plate。

40、窗口下记录定性结果。 0116 6.质量控制(实验有效性判断) 说明书 7/11 页 10 CN 112048574 A 10 0117 试剂盒各对照品须达到以下要求， 否则实验视为无效。 0118 阳性对照阴性对照 FAM通道(ORF1ab)Ct32无Ct值或Ct40 VIC通道(N)Ct32无Ct值或Ct40 ROX通道(内标)有典型的S型曲线， 且Ct32有典型的S型曲线， Ct32 0119 阳性判断值 0120 通过参考值的研究确定本试剂盒检测目标基因的Ct参考值为38， 内标Ct的参考值 为38。 0121 【检验结果的解释】 0122 一、 如果样本ROX通道出现典型S型曲线且C。

41、t38， 样本结果可按下表判定： 0123 0124 可疑样本均需复检， 若复检结果中， FAM和VIC通道均Ct40， 则为阴性， 其余结果 为阳性。 0125 二、 如果ROX通道的Ct38或未出现明显的S型扩增曲线， 可能原因如下： 0126 1.样本中存在PCR的抑制物， 可对样本进行稀释后检测。 0127 2.核酸提取过程异常， 可重新提取核酸进行检测。 0128 3.此样本在采样时未能采到合格样本， 或在运输、 保存时样本降解， 可重新采样。 0129 对比例1 0130 取与实施例2相同的样本(样本1： 咽拭子、 样本2： 肺泡灌洗液)， 采用国家疾病预防 控制中心新型冠状病毒肺。

42、炎实验室检测技术指南中推荐的核酸检测方案和现有试剂盒进 行检测。 0131 结果如图1-4所示： 0132 0133 0134 实验结论： 对于样本1， 现有测试方法中的Ct值较实施例2中的Ct值大2.53， 且扩 增曲线荧光量更低； 对于样本2现有测试方法中Ct值较实施例2检测结果Ct值大1左右， 荧光 量略低。 说明实施例2所述方案的检测灵敏度更高， 能够检测出更多的阳性样品。 0135 实施例3以ORF1ab基因为检测靶点的试剂盒 0136 参照实施例2所述方法配制试剂盒并进行基因检测。 其不同之处仅在于： 0137 按照下表组成配制试剂： 0138 组分名称主要成分 PCR反应液反应B。

43、uffer、 dNTPs、 Taq酶、 UDG酶 说明书 8/11 页 11 CN 112048574 A 11 PCR逆转录酶RT酶 PCR引物探针ORF1ab基因引物、 探针组； 内标RP基因引物、 探针组 阳性对照含ORF1ab基因片段的假病毒 阴性对照含内标RP基因片段的假病毒 0139 引物配制浓度为0.4 mol/L， 探针配置浓度均为0.2 mol/L。 0.1mmol/L的dATP， 0.1mmol/L的dCTP， 0.1mmol/L的dGTP， 0.1mmol/L的dUTP， 1mmol/L的MgCl2、 体积百分比为 30的无酶水； 5U的逆转录酶， 10U的RNA酶抑制剂。

44、， 1U的热启动DNA聚合酶， 1U的热敏UDG酶。 在步骤5中选择FAM通道检测2019-nCoV基因ORF1ab。 0140 结果如图5-8所示： 0141 0142 实验结论： 对于样本1， 现有测试方法中的Ct值较实施例3中的Ct值大2.79， 且扩增 曲线荧光量更低； 对于样本2现有测试方法中Ct值较实施例3检测结果Ct值大1左右， 荧光量 略低。 说明实施例3所述方案的检测灵敏度更高， 能够检测出更多的阳性样品。 0143 实施例4以N基因为检测靶点的试剂盒 0144 参照实施例2所述方法配制试剂盒并进行基因检测。 其不同之处仅在于： 0145 按照下表组成配制试剂： 0146 组。

45、分名称主要成分 PCR反应液反应Buffer、 dNTPs、 Taq酶、 UDG酶 PCR逆转录酶RT酶 PCR引物探针N基因引物、 探针组； 内标RP基因引物、 探针组 阳性对照含N基因片段的假病毒 阴性对照含内标RP基因片段的假病毒 0147 引物配制浓度为0.4 mol/L， 探针配置浓度均为0.2 mol/L。 0.1mmol/L的dATP， 0.1mmol/L的dCTP， 0.1mmol/L的dGTP， 0.1mmol/L的dUTP， 1mmol/L的MgCl2、 体积百分比为 30的无酶水； 5U的逆转录酶， 10U的RNA酶抑制剂， 1U的热启动DNA聚合酶， 1U的热敏UDG酶。

46、。 选择VIC通道检测2019-nCoV基因N。 0148 结果如图9-12所示： 0149 样本2 0150 0151 实验结论： 对于样本1， 现有测试方法中的Ct值较实施例4中的Ct值大2.54， 且扩增 曲线荧光量及线型也较实施例4更差， 说明实施例4所述方案的检测灵敏度更高， 能够检测 出更多的阳性样品。 对于样本2， 现有测试方法中Ct值与实施例4检测结果Ct值基本一致。 说明书 9/11 页 12 CN 112048574 A 12 0152 实施例5以E基因为检测靶点的试剂盒 0153 参照实施例2所述方法配制试剂盒并进行基因检测。 其不同之处仅在于： 0154 按照下表组成配。

47、制试剂： 0155 0156 0157 引物配制浓度为0.4 mol/L， 探针配置浓度均为0.2 mol/L。 0.1mmol/L的dATP， 0.1mmol/L的dCTP， 0.1mmol/L的dGTP， 0.1mmol/L的dUTP， 1mmol/L的MgCl2、 体积百分比为 30的无酶水； 5U的逆转录酶， 10U的RNA酶抑制剂， 1U的热启动DNA聚合酶， 1U的热敏UDG酶。 选择CY5通道检测2019-nCoV基因E。 0158 结果如图13-16所示： 0159 0160 实验结论： 对于样本1， 现有测试方法中的Ct值较实施例5中的Ct值大0.96， 且扩增 曲线荧光量及。

48、线型也较实施例5更差， 说明实施例5所述方案的检测灵敏度更高， 能够检测 出更多的阳性样品。 对于样本2， 现有测试方法中Ct值与实施例5检测结果Ct值基本一致。 0161 实施例6同时以三种基因为检测靶点的试剂盒 0162 参照实施例2所述方法配制试剂盒并进行基因检测。 其不同之处仅在于： 0163 按照下表组成配制试剂： 0164 组分名称主要成分 PCR反应液反应Buffer、 dNTPs、 Taq酶、 UDG酶 PCR逆转录酶RT酶 PCR引物探针三种基因的引物、 探针组； 内标RP基因引物、 探针组 阳性对照含三种基因片段的假病毒 阴性对照含内标RP基因片段的假病毒 0165 引物配。

49、制浓度为0.4 mol/L， 探针配置浓度均为0.2 mol/L。 0.1mmol/L的dATP， 0.1mmol/L的dCTP， 0.1mmol/L的dGTP， 0.1mmol/L的dUTP， 1mmol/L的MgCl2、 体积百分比为 30的无酶水； 5U的逆转录酶， 10U的RNA酶抑制剂， 1U的热启动DNA聚合酶， 1U的热敏UDG酶。 选择FAM、 VIC和CY5通道分别检测2019-nCoV基因ORF1ab、 N和E。 0166 结果如图5所示： 说明书 10/11 页 13 CN 112048574 A 13 0167 0168 实验结论： 对于样本1， 现有测试方法中的Ct值。

50、较实施例6中的Ct值大2.53.2， 扩 增曲线线荧光量低且为非典型 “S” 型； 对于样本2， 现有测试方法中Ct值较实施例6检测结果 Ct值大1.532.42。 说明实施例6所述方案的检测灵敏度更高， 能够检测出更多的阳性样 品。 0169 实施例7检测前对样本进行富集 0170 参照实施例2所述方法配制试剂盒并进行基因检测。 其不同之处仅在于： 采用样本 富集操作替代所述步骤1中的核酸提取步骤。 即采用特异性的核酸捕获探针组合对待测样 本、 阳性对照和阴性对照， 分别进行核酸富集。 具体为采用上述核酸捕获探针组合， 使其根 据碱基互补原理与靶核酸特异性结合， 形成靶核酸-探针杂合体， 然。