一组鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组及其应用、检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010824764.8 (22)申请日 2020.08.17 (71)申请人 河海大学 地址 210024 江苏省南京市鼓楼区西康路1 号 申请人 南京市水产科学研究所 (72)发明人 赵哲周国勤喻飞郝凯 夏思瑶陆健陈树桥王绍绵 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 代理人 柏尚春 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/9。

2、3(2006.01) (54)发明名称 一组鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组及其 应用、 一种检测试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一组鳜鲈弹状病毒的LAMP检 测引物组及其应用、 一种检测试剂盒， 引物组包 括一对外引物、 一对内引物和一对环引物； 外引 物包括LF3序列和LB3序列， 外引物LF3序列如 SEQ ID NO:1所示， 外引物LB3序列如SEQ ID NO:2所示； 内引物包括LFIP序列和LBIP序列， 内引物LFIP序列如SEQ ID NO:3所示， 内引物L BIP序列如SEQ ID NO:4所示； 环引物包括LLF序 列和LLB序列， 环引物LLF序列如SEQ ID 。

3、NO:5 所示， 环引物LLB序列如SEQ ID NO:6所示。 并提 供该引物组在制备鳜鲈弹状病毒检测试剂盒中 的应用及试剂盒。 本发明的引物组和试剂盒具有 操作简单、 检测快速、 特异性好、 灵敏度高和结果 可靠等优点。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 112063750 A 2020.12.11 CN 112063750 A 1.一组鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组， 其特征在于： 所述引物组包括一对外引物、 一 对内引物和一对环引物； 所述外引物包括L-F3序列和L-B3序列， 所述外引物L-F3序列如SEQ ID NO:1所示， 所述 外引物L-B3序列如SE。

4、Q ID NO:2所示； 所述内引物包括L-FIP序列和L-BIP序列， 所述内引物L-FIP序列如SEQ ID NO:3所示， 所述内引物L-BIP序列如SEQ ID NO:4所示； 所述环引物包括L-LF序列和L-LB序列， 所述环引物L-LF序列如SEQ ID NO:5所示， 所述 环引物L-LB序列如SEQ ID NO:6所示。 2.根据权利要求1所述鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组， 其特征在于： 所述外引物、 内 引物与环引物的摩尔比为0.81.2:69:35。 3.一种权利要求1所述鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组在制备鳜鲈弹状病毒检测试剂 盒中的应用。 4.一种鳜鲈弹状病毒的检。

5、测试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括权利要求1所述引物 组。 5.根据权利要求4所述鳜鲈弹状病毒的检测试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒还包括逆 转录酶、 DNA聚合酶、 LAMP反应液、 阳性对照品、 阴性对照品和显色剂。 6.根据权利要求5所述鳜鲈弹状病毒的检测试剂盒， 其特征在于： 所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。 7.根据权利要求5所述鳜鲈弹状病毒的检测试剂盒， 其特征在于： 所述阳性对照品为将 RNA依赖的RNA聚合酶基因片段序列连接到T载体中得到的质粒， 所述RNA聚合酶基因片段序 列如SEQ ID NO:7所示。 8.根据权利要求5所述鳜鲈弹状病毒的检测试剂盒， 其特。

6、征在于： 所述阴性对照品为超 纯水。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112063750 A 2 一组鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组及其应用、 一种检测试 剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一组LAMP检测引物组及其应用、 一种检测试剂盒， 尤其涉及一组鳜鲈 弹状病毒的LAMP检测引物组及其应用、 一种检测试剂盒。 背景技术 0002 弹状病毒(Rhabdovirus)是一类有囊膜的负链RNA病毒， 具有较强的致病性且宿主 范围广泛， 可感染包括哺乳动物、 鸟类、 爬行动物、 鱼类、 昆虫以及植物等在内多种生物。 鱼 类弹状病毒是硬骨鱼类病毒中数量最多的群体之一， 到目前为止已经分离鉴定。

7、近二十种鱼 类弹状病毒， 如： 鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)、 加州鲈弹状病毒 (Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)， 而它们通常与水产养殖的流行病及重大经 济损失有关。 0003 鳜(翘嘴鳜)和鲈(加州鲈)是重要的淡水名特优养殖品种， 它们肉质细嫩， 味道鲜 美， 蛋白质含量高而深受广大消费者的青睐。 但由于养殖规模的扩大及养殖密度的提高， 加 之水环境的污染， 病害问题日益凸显出来。 弹状病毒病是鳜、 鲈养殖过程中常见几种病毒性 疾病之一， 主要危害养殖鳜鲈幼鱼， 鱼苗的死亡率可达3050；。

8、 近几年也屡有发现对鱼 种也能导致发病且出现大批量死亡， 给鳜鲈养殖经济带来严重损失。 研究发现， 鳜鱼弹状病 毒SCRV和加州鲈弹状病毒MSRV有较近的亲缘关系， 在序列同源性上高达96以上。 0004 目前， 对鳜鱼和加州鲈鲈弹状病毒的检测方法主要依赖于传统的PCR方法， 此方法 虽然能提供准确可靠的检测结果， 但需要昂贵的仪器设备、 较高检测费用以及对检测人员 较高的技术要求而使其不适用于鳜鱼和鲈鱼养殖现场的大规模筛选使用和推广。 发明内容 0005 发明目的： 本发明的第一目的为提供一组快速、 特异检测L基因的存在的鳜鲈弹状 病毒的LAMP检测引物组， 本发明的第二目的为提供该LAMP。

9、检测引物组在制备鳜鲈弹状病毒 检测试剂盒中的应用， 本发明的第三目的为提供一种鳜鲈弹状病毒的检测试剂盒。 0006 技术方案： 本发明的鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组， 引物组包括一对外引物、 一 对内引物和一对环引物； 0007 外引物包括L-F3序列和L-B3序列， 外引物L-F3序列如SEQ ID NO:1所示， 外引物L- B3序列如SEQ ID NO:2所示； 0008 内引物包括L-FIP序列和L-BIP序列， 内引物L-FIP序列如SEQ ID NO:3所示， 内引 物L-BIP序列如SEQ ID NO:4所示； 0009 环引物包括L-LF序列和L-LB序列， 环引物L-LF。

10、序列如SEQ ID NO:5所示， 环引物L- LB序列如SEQ ID NO:6所示。 0010 进一步地， 外引物、 内引物与环引物的摩尔比为0.81.2:69:35。 0011 本发明的鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组在制备鳜鲈弹状病毒检测试剂盒中的 说明书 1/4 页 3 CN 112063750 A 3 应用。 0012 本发明的鳜鲈弹状病毒的检测试剂盒， 试剂盒包括引物组。 0013 优选的， 试剂盒还包括逆转录酶、 DNA聚合酶、 LAMP反应液、 阳性对照品、 阴性对照 品和显色剂。 DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。 0014 LAMP反应液包括： 10mM dNTP、 10。

11、ThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液， 三者的体积比为8:5:2。 0015 阳性对照品为将RNA依赖的RNA聚合酶基因(L基因)片段序列连接到T载体中得到 的质粒， RNA聚合酶基因片段序列如SEQ ID NO:7所示。 阴性对照品为超纯水。 0016 有益效果： 与现有技术相比， 本发明的引物组和试剂盒具有如下优点： 0017 (1)特异性好： 对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)、 鲫鱼造血器官坏死病毒 (CyHV-2)、 鮰鱼疱疹病毒(CCV)、 对虾白斑综合征病毒(WSSV)、 草鱼呼肠孤病毒(GCRV)以及 嗜水气单胞菌、 爱德华氏菌等水产病原的DNA或RN。

12、A不发生扩增； 0018 (2)灵敏度高： 最低检测极限可达到2x101 copies/ l； 0019 (3)操作简单： 本发明的技术方案不需要复杂的仪器， 不需要特殊试剂， 不需要预 先进行双链DNA的变性等繁琐步骤， 只需要恒温仪(保温桶)就能反应， 在研发中通过恒温荧 光仪实时读取的SYTO-9荧光信号来判断扩增结果， 在推广应用可使用SYGR Green I染料加 入产物直接显色， 对操作者技术要求不高， 适合翘嘴鳜和加州鲈养殖现场使用。 附图说明 0020 图1为利用恒温荧光仪检测鳜鲈弹状病毒的结果图； 0021 图2为LAMP检测鳜鲈弹状病毒的特异性结果图； 0022 图3为LA。

13、MP检测鳜鲈弹状病毒的灵敏性结果图 ， 其中 ， 从左到右依次为 2x106copies/ l2x101copies/ l及阴性对照； 0023 图4为LAMP检测鳜鲈弹状病毒的重复性结果图。 具体实施方式 0024 本实施例中的加州鲈和所用试剂均可通过市售获得。 下面结合实施例对本发明的 技术方案作进一步说明。 0025 实施例1用于检测鳜鲈弹状病毒的试剂盒建立 0026 基于LAMP技术建立的用于检测鳜鲈弹状病毒的试剂盒， 包括LAMP引物组、 AMV逆转 录酶、 Bst DNA聚合酶、 LAMP反应液、 阳性对照和阴性对照和显色剂SYTO-9。 0027 (1)LAMP引物设计： 以鳜鲈。

14、弹状病毒的RNA依赖RNA聚合酶基因(L基因)为靶点进行 LAMP引物的设计。 引物序列见表1。 外引物、 内引物与环引物的摩尔比为1:8:4。 0028 表1引物序列表 说明书 2/4 页 4 CN 112063750 A 4 0029 0030 (2)LAMP反应液： 含有10mM dNTP、 10ThermoPol反应缓冲液、 150mM MgSO4水溶 液， 三者的体积比是8： 5： 2。 0031 (3)阳性对照为含有弹状病毒L基因片段的质粒DNA， 其制备方法为： 提取鳜鱼弹状 病毒SCRV的基因组RNA， 利用表1中的外引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)对进行。

15、RT-PCR扩 增， 所得基因片段长度为411bp， 序列如SEQ ID NO:7所示， 回收该扩增片段， 利用常规方法 连接到T载体中， 获得的质粒即为阳性对照。 0032 (4)阴性对照为超纯水。 0033 实施例2使用恒温荧光仪建立鳜鲈弹状病毒检测方法 0034 利用实施例1的试剂盒检测加州鲈弹状病毒的方法， 包括如下步骤： 0035 (1)加州鲈弹状病毒基因组RNA的制备： 从待检加州鲈组织中切取组织材料置于灭 菌后的研钵中， 加入液氮研磨后转入离心管中， 加入1ml TRIzol试剂均匀混合； 加入0.2ml 氯仿， 震荡10-15s， 室温放置2-3min； 4高速离心(12000。

16、g)15min使分层； 轻吸出上层水 相约500ul， 其加入500ul异丙醇， 混匀， 室温静置10min， 4高速离心(12000g)10min， 弃 上清保留RNA微量白色沉淀； 加入75乙醇溶液1ml用于RNA沉淀清洗， 轻混匀样品， 4中速 离心(7500g)10min； 弃上清， 适度室温静置(一般5-10min)， 30ul RNase-free水重悬RNA， 55-60静置10min； RNA置于-80备用。 0036 (2)恒温基因扩增反应： 所述恒温基因扩增反应按照下述反应体系进行： 25 l反应 体系含有： ORF77-F3 0.2 M， ORF77-B3 0.2 M， 。

17、ORF77-FIP 1.6 M， ORF77-BIP1.6 M， ORF77- LF 0.8 M， ORF77-LB 0.8 M， LAMP反应液12.5 l， AMV逆转录酶2.5U， Bst DNA聚合酶10U， 10 SYTO-9 0.5 l， 待检DNA1100ng， 用超纯水补齐到25 l； 设置阳性对照和阴性对照； 0037 (3)结果判断： 将反应管放置在恒温荧光仪中进行反应， 观察恒温荧光仪软件判断 扩增结果， 鉴定结果如图1所示： 如果出现 “S” 型曲线则为阳性， 无 “S” 型曲线则为阴性。 0038 实施例3检测特异性实验 0039 用实施例1的方法分别对鳜鱼和加州鲈弹。

18、状病毒阳性RNA及ISKNV、 CyHV-2、 CCV、 WSSV、 GCRV以及嗜水气单胞菌、 爱德华氏菌等病原的DNA或RNA进行检测。 0040 鉴定结果如图2所示： 以鳜鲈弹状病毒LAMP引物组进行扩增反应， 鳜鱼和加州鲈弹 状病毒阳性RNA正常扩增， 阴性水对照及其他病原的核酸(DNA或者RNA)没有扩增， 显示出良 好的特异性。 0041 实施例4检测灵敏度实验： 0042 将含有鳜鲈弹状病毒L基因片段的质粒进行定量， 测定其浓度并根据分子量计算 质粒拷贝数， 稀释到2x106 copies/ l、 2x105 copies/ l、 2x104 copies/ l、 2x103 c。

19、opies/ l、 2x102 copies/ l、 2x101 copies/ l。 用实施例2的操作方法分别对稀释后的阳性克隆进 说明书 3/4 页 5 CN 112063750 A 5 行检测。 鉴定结果如图3所示： 对阳性质粒的检测限达到20copies/ l； 0043 实施例5检测重复性实验 0044 将弹状病毒阳性的加州鲈组织按照实施例2进行制备RNA， 用作模板进行检测； 鉴 定结果如图4所示： 同一次实验内， 7个平行样品的扩增曲线基本上是重合的， 表明所建立的 LAMP方法重复性较好。 说明书 4/4 页 6 CN 112063750 A 6 序列表 河海大学 南京市水产科。

20、学研究所 一组鳜鲈弹状病毒的LAMP检测引物组及其应用、 一种检测试剂盒 7 SIPOSequenceListing 1.0 1 18 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 aggatgatgt ccacgact 18 2 20 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 caatgatgac tcgtctcctc 20 3 44 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 cagaatctcc aaggacttca cctggaccga caattacgac ttca 44 4 42 DNA/RNA 人。

21、工序列(Artificial Sequence) 4 tcaagagtca cttaccgtcc agatctatgg ttgtgctctg ga 42 5 22 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 tgatctgtga gtggattagc ag 22 6 22 序列表 1/2 页 7 CN 112063750 A 7 DNA/RNA 人工序列(Artificial Sequence) 6 ataagtggaa gccagaagga tc 22 7 411 DNA/RNA 鳜鲈弹状病毒(Mandarin fish and perch rhabdovirus。

22、) 7 aggatgatgt ccacgactga tacctttagg gacataggga ccgacaatta cgacttcatg 60 tttcagtccc tgctaatcca ctcacagatc acagcaggtg aagtccttgg agattctgat 120 gcaacaggaa cattgcattt tcatttggat tgcaaaggtt gcctgtccaa aatagaagag 180 gtagtcctag agtcaagagt cacttaccgt ccagaagaca gatctggatt acttaataag 240 tggaagccag aaggatcaga atggtcaaaa gaaagaacca gaccagaaat ccagagcaca 300 accatagagc ggttaaataa atcatccatt cattataaca tgggaagggc tcaaggattt 360 atttacggag atcagaagat gaccggaaga ggaggagacg agtcatcatt g 411 序列表 2/2 页 8 CN 112063750 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 112063750 A 9 图3 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 112063750 A 10 。