改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010843493.0 (22)申请日 2020.08.20 (71)申请人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 杜金志徐炜童其松罗凤琴 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 陈智英 (51)Int.Cl. A61K 47/59(2017.01) A61K 38/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C08G 83/00(2006.01) C08G 73/02(。

2、2006.01) (54)发明名称 一种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送 中的应用 (57)摘要 本发明属于医学材料的技术领域， 公开了一 种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送中的应 用。 本发明将改性树枝状聚合物用于蛋白质胞内 递送； 所述改性树枝状聚合物的结构式为： PAMAM(NHC(O)OCH2CH2N(R)2)n， 其中结构 中NH来自PAMAM聚合物末端的胺基NH2， n表示 PAMAM表面接枝叔胺分子的个数， n为大于0的整 数； R为烷基。 本发明将改性树枝状聚合物用于蛋 白质胞内递送， 提高了蛋白质转导效率、 递送效 率； 改性树枝状聚合物与蛋白质结合， 能够高效 向细胞内递送。

3、蛋白并保留蛋白质的生物活性； 同 时改性树枝状聚合物与蛋白质结合后的复合物 还具有较高的内涵体逃逸能力。 权利要求书1页 说明书7页 附图8页 CN 112057631 A 2020.12.11 CN 112057631 A 1.一种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送中的应用， 其特征在于： 所述改性树枝状聚合物的结构式为： PAMAM-(NH-C(O)-O-CH2CH2-N(R)2)n即 结构中-NH-来自PAMAM聚合物末端的胺基-NH2， n表示PAMAM表面接枝叔胺分子的个数， n 为大于0的整数； 所述R为烷基。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述R为-CH3、 -CH。

4、2CH3、 -CH2CH2CH3、 - CH2CH2CH2CH3、 -CH2CH2CH2CH2CH3； 所述n为2060； PAMAM聚合物为第4代或第5代PAMAM聚合物。 3.一种蛋白质转染试剂， 其特征在于： 包括改性树枝状聚合物； 所述改性树枝状聚合物如权利要求1或2所定义。 4.一种用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 其特征在于： 包括改性树枝状聚合物和 蛋白质； 所述改性树枝状聚合物如权利要求1或2所定义。 5.根据权利要求4所述用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 其特征在于： 为用于将蛋 白质递送到细胞内并保留蛋白质的生物活性的组合物； 所述蛋白质递送到细胞内是指蛋白质转导进入细。

5、胞质。 6.根据权利要求4所述用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 其特征在于： 所述改性树 枝状聚合物与蛋白质通过静电和/或疏水作用方式连接。 7.根据权利要求4所述用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 其特征在于： 是在水中， 将改性树枝状聚合物与蛋白质或修饰的蛋白质进行复合得到。 8.根据权利要求7所述用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 其特征在于： 所述改性树 枝状聚合物和蛋白质或修饰的蛋白质复合形成颗粒状。 9.根据权利要求7所述用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 其特征在于： 所述改性树 枝状聚合物与蛋白质或修饰的蛋白质的质量比1/8； 所述蛋白质为牛血清蛋白， 核糖核酸酶A， -半乳。

6、糖苷酶， 绿色荧光蛋白， 细胞色素C， 藻 红蛋白中一种以上； 所述修饰的蛋白质中修饰是指采用修饰分子对蛋白质进行修饰， 以增强蛋白质负电 性； 所述修饰分子为具有细胞内环境响应性的修饰分子。 10.根据权利要求49任一项所述用于将蛋白质递送到细胞内的组合物在制备抗肿瘤 产品中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112057631 A 2 一种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送中的应用 技术领域 0001 本发明属于医学材料的技术领域， 具体涉及一种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内 递送中的应用。 背景技术 0002 蛋白质在信号转导和细胞代谢中十分重要， 蛋白的变异、 失活会导致众多疾病。。

7、 自 1982年胰岛素被批准用于治疗糖尿病以来， 多种蛋白药物， 如细胞因子、 荷尔蒙等都被用于 疾病治疗， 与小分子药物相比， 蛋白药物具有高特异性、 疗效好、 副作用小的优点。 现如今市 场上20的药物属于蛋白药物， 2018年全球销售额最高的十种药物中， 有七种是单克隆抗 体。 但是这些蛋白药物都是针对胞外靶点设计开发的， 如针对PD1、 HER2、 CD20、 胰岛素受体 等靶点。 一个重要的事实是超过70的基因组蛋白位于胞内， 这些靶点仍未被开发利用， 通 常被看作是无 “成药性” 的靶点。 其原因来源于蛋白质自身的结构特点， 如大分子量、 亲水性 及其复杂的多级结构， 这些特点使得。

8、外源性蛋白质很难渗透细胞膜进入胞内， 即使有少量 蛋白质进入胞内， 也会受到内涵体、 溶酶体等细胞器中水解酶的降解作用而失去生物活性， 这大大限制了功能性蛋白应用于疾病治疗和分子生物学基础研究。 0003 一种常见的蛋白递送方法是将细胞穿膜肽(CPPs)偶联于目标蛋白上， 并利用CPPs 本身特有的穿膜功能， 将蛋白直接递送进入胞内。 然而CPP功能化过程会不可避免地损害蛋 白的部分生物活性， 同时， CPP-蛋白偶联物进入胞内的方式尚无定论， 仍然面临内涵体逃逸 效率低的问题。 0004 已有多篇文献报导， 将纳米载体用于蛋白胞内递送， 理想的蛋白递送载体需要克 服几个障碍， 包括蛋白负载、。

9、 细胞内吞、 内涵体逃逸以及蛋白货物释放等。 在众多种类的纳 米载体中， 阳离子聚合物易于功能化， 且其表面正电荷利于细胞内化， 因此受到了广泛关 注。 聚酰胺-胺(Polyamidoamine， PAMAM)是一类在生物医用材料领域常用的树枝状聚合物 大分子， 它化学结构明确、 三维空间结构规整， 其内部含有空腔， 表面含有大量伯胺基团可 用于化学修饰。 PAMAM聚合物在蛋白递送领域的应用还不多， 一方面原因是蛋白质作为亲水 性分子， 具有不同的等电点， 带有不同电性， 与带正电的PAMAM结合力较弱， 蛋白的负载效率 较低； 另一方面， PAMAM的内涵体逃逸功能有限， 进入细胞的蛋白滞。

10、留在内涵体和溶酶体内， 受到酶降解作用而失去生物活性。 因此， 对PAMAM聚合物进行化学修饰改性， 构建蛋白递送 载体， 仍然具有很大的发展空间和应用前景。 发明内容 0005 为了克服现有技术中蛋白质等生物大分子转导效率较低的不足， 本发明的目的在 于提供一种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送中的应用。 本发明改性树枝状聚合物为叔 胺分子修饰的树枝状聚酰胺-胺聚合物。 本发明将叔胺分子修饰的树枝状聚酰胺-胺聚合物 用于蛋白质细胞内递送， 提高了蛋白质转导效率， 聚合物递送过程中对细胞的毒性小， 蛋白 质转导进入细胞质后可以保持生物活性， 发挥其生物学功能。 说明书 1/7 页 3 CN 11。

11、2057631 A 3 0006 本发明的目的通过以下技术方案实现： 0007 一种改性树枝状聚合物在蛋白质胞内递送中的应用。 0008 所述改性树枝状聚合物的结构式为： PAMAM-(NH-C(O)-O-CH2CH2-N(R)2)n即 0009 0010 结构中-NH-来自PAMAM聚合物末端的胺基-NH2， n表示PAMAM表面接枝叔胺分子的 个数， n为大于0的整数。 0011 所述R烷基， 优选为-CH3、 -CH2CH3、 -CH2CH2CH3、 -CH2CH2CH2CH3、 -CH2CH2CH2CH2CH3。 0012 所述n优选为2060， 更优选为20、 30或40。 0013。

12、 PAMAM聚合物为第4代或第5代PAMAM聚合物。 0014 PAMAM为聚酰胺-胺树枝状分子， 其分子量为517-58048道尔顿。 0015 一种蛋白质转染试剂， 包括上述改性树枝状聚合物， 将蛋白质递送到细胞内， 实现 蛋白质的转导。 0016 一种用于将蛋白质递送到细胞内的组合物， 包括上述改性树枝状聚合物和蛋白 质。 所述组合物为用于将蛋白质递送到细胞内并保留蛋白质的生物活性的组合物。 本发明 的组合物为具有较高的内涵体逃逸能力的组合物。 0017 所述蛋白质递送到细胞内是指蛋白质转导进入细胞质。 0018 所述改性树枝状聚合物与蛋白质通过静电和/或疏水作用方式连接。 0019 所。

13、述改性树枝状聚合物和蛋白质复合形成颗粒状。 0020 所述组合物也可称为用于将蛋白质递送到细胞内的复合物。 0021 所述组合物是在水中， 将改性树枝状聚合物与蛋白质或修饰的蛋白质进行复合得 到； 所述复合是指在搅拌条件下进行。 0022 所述改性树枝状聚合物与蛋白质或修饰的蛋白质的质量比1/8， 优选为1/4， 更优选1/2。 0023 所述蛋白质为牛血清蛋白(BSA)， 核糖核酸酶A(RNase A)， -半乳糖苷酶( -Gal)， 绿色荧光蛋白(GFP)， 细胞色素C(Cyt C)， 藻红蛋白(R-PE)等。 0024 所述修饰的蛋白质中修饰是指采用修饰分子对蛋白质进行修饰， 以增强蛋白。

14、质负 电性。 所述修饰分子为具有细胞内环境响应性的修饰分子。 如： RNase A蛋白， 采用乌头酸酐 作为修饰分子。 在内涵体酸性(pH5.5)下， 乌头酸酐可发生脱落， 释放出原来的RNase A蛋 白。 0025 本发明将叔胺分子修饰PAMAM聚合物(即改性树枝状聚合物)与蛋白质在室温孵育 形成复合物颗粒， 叔胺分子修饰PAMAM聚合物与蛋白质的组合物可以实现对细胞进行蛋白 转导， 将蛋白质递送入细胞内。 0026 本发明的组合物在制备抗肿瘤产品中的应用。 0027 本发明利用叔胺分子修饰PAMAM聚合物(即改性树枝状聚合物)在Hela等细胞系中 转染牛血清蛋白(BSA)， 核糖核酸酶A。

15、(RNase A)， -半乳糖苷酶( -Gal)等蛋白质。 实验结果 表明本发明的叔胺分子改性树枝状PAMAM聚合物可有效与蛋白质结合， 形成稳定的复合物 颗粒； 利用本发明提出的复合物递送蛋白质， 通过流式细胞术实验发现所述递送方法具有 说明书 2/7 页 4 CN 112057631 A 4 较高的转导效率， 高于商业化蛋白质转染试剂PulsinTM； 通过胞内递送 -Gal， 并进行细胞原 位染色， 发现所述递送方法能够高效递送蛋白并保留蛋白质的生物活性； 通过MTT实验发现 本发明采用的叔胺PAMAM聚合物具有低细胞毒性， 在较高转染效率的浓度下细胞存活率高 于85， 具有良好的生物相。

16、容性； 通过MTT实验发现本发明采用的复合物递送方法可以保持 RNase A酶的生物活性， 发挥其生物学功能。 0028 与现有技术相比， 本发明具有如下优点及有益效果： 0029 1)本发明将叔胺分子修饰的树枝状聚酰胺-胺聚合物用于蛋白质细胞内递送， 提 高了蛋白质转导效率、 递送效率； 0030 2)本发明将叔胺分子改性树枝状PAMAM聚合物与蛋白质结合， 聚合物递送过程中 对细胞的毒性小， 蛋白质转导进入细胞质后可以保持生物活性， 发挥其生物学功能； 0031 3)本发明的胺分子改性树枝状PAMAM聚合物与蛋白质所形成的复合物能够高效向 细胞内递送蛋白并保留蛋白质的生物活性； 同时本发明。

17、的复合物还具有较高的内涵体逃逸 能力。 附图说明 0032 图1为羰基二咪唑(CDI)活化的叔胺分子以及改性PAMAM大分子的合成路线示意 图； 0033 图2为叔胺修饰的PAMAM树枝状聚合物的1H NMR图。 其中图2(a)为G5-DMEA30， 图2 (b)为G5-DEEA30， 图2(c)为G5-DPEA30， 图2(d)为G5-DBEA30， 图2(e)为G5-DnPEA30； 0034 图3为G5-PAMAM、 G5-DMEA30、 G5-DEEA30、 G5-DPEA30、 G5-DBEA30、 G5-DnPEA30树枝 状聚合物与BSA以不同质量比形成复合物颗粒后， 其在Hel。

18、a细胞中的蛋白递送效率， PULSin 为阳性对照组； 0035 图4为G5-DBEA30与BSA以2： 1的质量比形成复合物颗粒后， 颗粒的粒径与Zeta电位 变化图； 图4(a)为粒径分布图， 图4(b)为TEM图， 图4(c)为Zeta电位变化图； 0036 图5为G5-DMEA30、 G5-DEEA30、 G5-DPEA30、 G5-DBEA30、 G5-DnPE A30、 PulsinTM的蛋 白递送共聚焦图像； 0037 图6为G5-DBEA30/BSA复合物颗粒在不同时间点的内涵体逃逸情况； 0038 图7为G5-DBEA30对 -Gal蛋白的胞内递送情况； 左图为G5-DBEA。

19、30聚合物递送 - Gal蛋白以后， 胞内的 -Gal催化X-Gal生成蓝色沉淀， 右图是只有 -Gal， 不加聚合物， 细胞 内无 -Gal蛋白， 不生成蓝色沉淀； 0039 图8为G5-DBEA30递送RNase A蛋白引起肿瘤细胞死亡相关图； 图8(a)为G5-DBEA30 聚合物在不同浓度下对Hela细胞的毒性曲线图； 图8(b)为G5-DBEA30与RNase A-Aco以不同 质量比形成复合物颗粒， 且在不同聚合物浓度下引起Hela细胞死亡曲线； 图8(c)为G5- DBEA30/RNase A-Aco颗粒以蛋白浓度依赖的方式引起Hela细胞死亡曲线。 具体实施方式 0040 下面。

20、结合具体实施例对本发明作进一步详细描述， 但本发明的实施方式不限于 此。 0041 改性PAMAM大分子是由树枝状PAMAM聚合物与N， N-羰基二咪唑(CDI)活化的叔胺分 说明书 3/7 页 5 CN 112057631 A 5 子反应得到； CDI活化的叔胺分子是指利用CDI活化叔胺分子。 0042 叔胺分子通式为HOCH2CH2-N(R)2， R为-CH3、 -CH2CH3、 -CH2CH2CH3、 -CH2CH2CH2CH3、 - CH2CH2CH2CH2CH3， 具体叔胺分子为HOCH2CH2N(CH3)2(N， N-二甲基乙醇胺， DMEA)， HOCH2CH2N (CH2CH3。

21、)2(N， N-二乙基乙醇胺， DE EA)， HOCH2CH2N(CH2CH2CH3)2(N， N-二丙基乙醇胺， DPEA)， HOCH2CH2N(CH2CH2CH2CH3)2(N， N-二正丁基乙醇胺， DBEA)和HOCH2CH2N(CH2CH2CH2CH2CH3)2(N， N-二戊基乙醇胺， DnPEA)； 0043 本发明的实施例中第五代PAMAM分子的分子量为28826g/mol， 1mol五代PAMAM中含 有128mol的氨基。 将五种CDI活化的叔胺分子， 即CDI活化的N,N-二甲基乙醇胺(DMEA-CDI)、 CDI活化的N,N-二乙基乙醇胺(DEEA-CDI)、 CD。

22、I活化的N,N-二丙基乙醇胺(DPEA-CDI)、 CDI活 化的N,N-二正丁基乙醇胺(DBEA-CDI)、 CDI活化的N,N-二戊基乙醇胺(DnPEA-CDI)与G5- PAMAM反应得到叔胺PAMAM聚合物， 合成路线如图1所示， 反应产率为70-85。 0044 实施例1： G5-DMEA30树枝状聚合物的合成 0045 G5-DMEA30树枝状聚合物由G5-PAMAM表面氨基与CDI活化的叔胺分子(DMEA-CDI) 反应制备。 0046 (1)将20mg五代PAMAM(G5-PAMAM)与4.4mg的DMEA-CDI溶解于1.0mL的DMSO中， DMEA-CDI与G5-PAMA。

23、M的摩尔比为35 1， 在40油浴锅中反应24小时； 0047 (2)产物利用真空油泵浓缩， 然后以甲醇为流动相过Sephadex LH-20凝胶柱， 纯化 得到产物； 通过旋转蒸发仪除去大部分溶剂， 再用真空泵抽除剩余溶剂， 获得G5-DMEA30树 枝状聚合物。 0048 G5-DMEA30树枝状聚合物的1H NMR结果如图2(a)所示； G5-PAMAM内部酰胺键以及 表面伯胺上的活泼氢共有508个， 因此其内部叔胺和酰胺键附近亚甲基上的质子共有2020 个， 且其化学位移位于2-4ppm之间， 以氨基甲酸酯键附近的质子信号作为特征峰， 可由其峰 面积计算得知接枝数为30。 0049 实。

24、施例2： G5-DEEA30树枝状聚合物的合成 0050 G5-DEEA30树枝状聚合物由G5-PAMAM表面氨基与CDI活化的叔胺分子(DEEA-CDI) 反应制备。 制备过程与实施例1相似。 0051 (1)将20mg五代PAMAM(G5-PAMAM)与5.1mg的DEEA-CDI溶解于1.0mL的DMSO中， DEEA-CDI与G5-PAMAM的摩尔比为35 1， 在40油浴锅中反应24小时； 0052 (2)产物利用真空油泵浓缩， 然后以甲醇为流动相过Sephadex LH-20凝胶柱， 纯化 得到产物； 通过旋转蒸发仪除去大部分溶剂， 再用真空泵抽除剩余溶剂， 获得G5-DEEA30。

25、树 枝状聚合物。 0053 G5-DEEA30树枝状聚合物的1H NMR结果如图2(b)所示， 由峰面积计算得知接枝数 为30。 0054 实施例3： G5-DPEA30树枝状聚合物的合成 0055 G5-DPEA30树枝状聚合物由G5-PAMAM表面氨基与CDI活化的叔胺分子(DPEA-CDI) 反应制备。 制备过程与实施例1相似。 0056 (1)将20mg五代PAMAM(G5-PAMAM)与5.8mg的DPEA-CDI溶解于1.0mL的DMSO中， DPEA-CDI与G5-PAMAM的摩尔比为35 1， 在40油浴锅中反应24小时； 0057 (2)产物利用真空油泵浓缩， 然后以甲醇为流。

26、动相过Sephadex LH-20凝胶柱， 纯化 说明书 4/7 页 6 CN 112057631 A 6 得到产物； 通过旋转蒸发仪除去大部分溶剂， 再用真空泵抽除剩余溶剂， 获得G5-DPEA30树 枝状聚合物。 0058 G5-DMEA30树枝状聚合物的1H NMR结果如图2(c)所示， 由峰面积计算得知接枝数 为30。 0059 实施例4： G5-DBEA30树枝状聚合物的合成 0060 G5-DBEA30树枝状聚合物由G5-PAMAM表面氨基与CDI活化的叔胺分子(DBEA-CDI) 反应制备。 制备过程与实施例1相似。 0061 (1)将20mg五代PAMAM(G5-PAMAM)与。

27、6.5mg的DBEA-CDI溶解于1.0mL的DMSO中， DBEA-CDI与G5-PAMAM的摩尔比为35 1， 在40油浴锅中反应24小时； 0062 (2)产物利用真空油泵浓缩， 然后以甲醇为流动相过Sephadex LH-20凝胶柱， 纯化 得到产物； 通过旋转蒸发仪除去大部分溶剂， 再用真空泵抽除剩余溶剂， 获得G5-DBEA30树 枝状聚合物。 0063 G5-DBEA30树枝状聚合物的1H NMR结果如图2(d)所示， 由峰面积计算得知接枝数 为30。 0064 实施例5： G5-DnPEA30树枝状聚合物的合成 0065 G5-DnPEA30树枝状聚合物由G5-PAMAM表面氨。

28、基与CDI活化的叔胺分子(DnPEA- CDI)反应制备。 制备过程与实施例1相似。 0066 (1)将20mg五代PAMAM(G5-PAMAM)与7.1mg的DnPEA-CDI溶解于1.0mL的DMSO中， DnPEA-CDI与G5-PAMAM的摩尔比为35 1， 在40油浴锅中反应24小时； 0067 (2)产物利用真空油泵浓缩， 然后以甲醇为流动相过Sephadex LH-20凝胶柱， 纯化 得到产物； 通过旋转蒸发仪除去大部分溶剂， 再用真空泵抽除剩余溶剂， 获得G5-DnPEA30树 枝状聚合物。 0068 G5-DnPEA30树枝状聚合物的1H NMR结果如图2(e)所示， 由峰面。

29、积计算得知接枝数 为30。 0069 实施例6： 叔胺PAMAM聚合物与蛋白制备复合物颗粒 0070 叔胺PAMAM聚合物(实施例15制备的聚合物)通过静电作用和疏水作用与BSA孵 育形成复合物颗粒。 配置浓度为0.1-1mg/mL的叔胺PAMAM水溶液， 然后分别以2 1、 1 1、 1 2、 1 4、 1 8的质量比(聚合物 BSA)加入BSA， 涡旋15s， 然后静置孵育10min得到复合物颗粒。 0071 实施例7： 复合物颗粒的蛋白递送效率筛选 0072 在24孔板中， 每孔种8104的Hela细胞， 培养过夜后用PBS清洗两次以除去残余的 血清， 将按照实施例6制备得到的复合物颗粒。

30、(此时复合颗粒中蛋白质为BSA-FITC， 所获得 复合颗粒为聚合物/BSA-FITC复合颗粒)用不含FBS的DMEM培养基稀释， 加入到24孔板中。 其 中， 每孔中含有4 g的BSA-FITC， BSA-FITC的浓度为10 g/mL。 颗粒处理4h后吸去溶液， 用PBS 清洗一次， 然后用0.125的胰酶消化并收集细胞， 加入0.2mg/mL的台盼蓝溶液淬灭胞外荧 光， 最后用12色流式测定细胞内的平均荧光强度， 比较不同叔胺PAMAM聚合物递送蛋白的效 率。 荧光强度如图3所示(图3中 “0.5,1,2,4,8” 表示的是每孔中含有的聚合物的质量， 而每 孔中含有的BSA-FITC的质。

31、量为4 g， 当聚合物的质量为8 g时， 聚合物与BSA的质量比为2 1)。 0073 图3为G5-PAMAM、 G5-DMEA30、 G5-DEEA30、 G5-DPEA30、 G5-DBEA30、 G5-DnPEA30树枝 说明书 5/7 页 7 CN 112057631 A 7 状聚合物与BSA-FITC以不同质量比形成复合物颗粒后， 其在Hela细胞中的蛋白递送效率 图。 比较发现， 质量比为2 1(聚合物的质量为8 g， BSA-FITC的质量为4 g)的复合物颗粒要 优于其他质量比形成的颗粒， 且G5-DBEA30具有最优的蛋白递送效率。 0074 实施例8： G5-DBEA30/。

32、BSA复合物颗粒的粒径与电位 0075 按照实施例6的方法制备得到G5-DBEA30/BSA(聚合物与蛋白质的质量比为2 1)颗 粒， 使用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)表征复合物的粒径， 以及复合物制备前后颗粒 Zeta电位的变化。 DLS结果如图4(a)所示， T EM结果如图4(b)所示， 结果显示复合物为100nm 左右的纳米颗粒； Zeta电位如图4(c)所示， G5-DBEA30聚合物电位为正48mV左右， BSA蛋白电 位为负20mV左右， 形成复合物后电位为正20mV左右。 0076 图4为G5-DBEA30与BSA以2： 1的质量比形成复合物颗粒后， 颗粒的粒径与Z。

33、eta电位 变化图； 图4(a)为粒径分布图， 图4(b)为TEM图， 图4(c)为Zeta电位变化图。 0077 实施例9： 叔胺聚合物蛋白胞内递送的共聚焦图 0078 按照实施例6的条件制备G5-DMEA30/BSA-FITC、 G5-DEEA30/BSA-FITC、 G5-DPEA30/ BSA-FITC、 G5-DBEA30/BSA-FITC、 G5-DnPEA30/BSA-FITC颗粒， 质量比均为2 1。 按照实施例7 中的方法向孔板中分别加入五种复合物颗粒。 每孔中BSA-FITC质量为4 g。 阳性对照组 PULSinTM(Polyplus公司)按照说明书进行蛋白转导。 复合物。

34、颗粒处理4h后用PBS清洗， 并用 4多聚甲醛固定细胞， 然后用DAPI染料标记细胞核， 用单光子共聚焦观察BSA-FITC在细胞 内的分布情况和荧光强度。 结果如图5所示， 发现G5-DBEA30的蛋白递送效率要明显强于其 他聚合物和商业化蛋白转染试剂PULSinTM。 0079 图5为G5-DMEA30、 G5-DEEA30、 G5-DPEA30、 G5-DBEA30、 G5-DnPEA30、 PulsinTM的蛋白 递送共聚焦图像。 0080 实施例10： G5-DBEA30/BSA-FITC复合物的内涵体逃逸 0081 按照实施例6的条件制备G5-DBEA30/BSA-FITC(2 1。

35、)颗粒， 按照实施例7中的方法， 在不同的时间点向孔板中加入复合物颗粒， 使颗粒处理时间分别为1、 2、 4小时。 复合物颗粒 处理以后， 加入LysoTracker(碧云天生物技术公司)红色探针标记酸性内涵体和溶酶体， 然 后用PBS清洗， 用4多聚甲醛固定细胞， 用DAPI染料(碧云天生物技术公司)标记细胞核， 单 光子共聚焦观察BSA-FITC在细胞内的分布情况。 结果如图6所示。 图6为G5-DBEA30/BSA复合 物颗粒在不同时间点的内涵体逃逸情况。 0082 发现随着处理时间增加， BSA的绿色荧光不与红色通道重叠， 说明此时BS A已经成 功实现内涵体逃逸， 进入细胞质。 00。

36、83 实施例11： G5-DBEA30/ -Gal复合物的细胞原位染色 0084 按照实施例6的方法制备G5-DBEA30/ -Gal(质量比2 1)复合物颗粒， 然后按照实 施例7的方法， 将颗粒用不含FBS的DMEM培养基稀释， 并加入到24孔板中与细胞共孵育。 每孔 中 -Gal含量为4 g。 颗粒处理4h后， 用PBS清洗一次， 加入 -Gal原位染色固定液处理10min， 吸除固定液后， 加入含有X-Gal的染色工作液， 避光37孵育过夜， 最后使用光学显微镜观 察染色情况。 -Gal原位染色结果如图7所示。 图7为G5-DBEA30对 -Gal蛋白的胞内递送情 况； 左图为G5-D。

37、BEA30聚合物递送 -Gal蛋白以后， 胞内的 -Gal催化X-Gal生成蓝色沉淀， 右 图是只有 -Gal， 不加聚合物， 细胞内无 -Gal蛋白， 不生成蓝色沉淀。 从图7中可知， G5- DBEA30聚合物成功将 -Gal蛋白递送进入Hela细胞胞质中， 递送效率较高， 同时 -Gal(百灵 说明书 6/7 页 8 CN 112057631 A 8 威公司)保留了其生物活性， 将X-Gal催化生成蓝色沉淀。 0085 实施例12： G5-DBEA30递送RNase A蛋白造成肿瘤细胞死亡 0086 将G5-DBEA30聚合物用不含FBS的DMEM培养基稀释成不同浓度(0、 2.5、 5。

38、、 10、 15、 20、 25、 30 g/mL)， 并处理Hela细胞4h， 然后将培养基换成含有FBS的培养基继续培养44h， 最 后用标准MTT方法检测聚合物毒性。 结果如图8(a)所示， 在所有蛋白递送实验条件下， 即材 料浓度小于20 g/mL时， 细胞活力均在85以上， 说明此浓度下G5-DBEA30具有良好的生物 相容性， 不会导致细胞死亡。 0087 通过水相反应， 将乌头酸酐偶联于RNase A(百灵威公司)蛋白上， 生成乌头酸酐修 饰的RNase A(RNase A-Aco)， 以增强RNase A蛋白的负电荷， 使其更易与G5-DBEA30结合形 成复合物颗粒， 且在内。

39、涵体酸性(pH5.5)下， 乌头酸酐可发生脱落， 释放出原来的RNase A 蛋白。 按照实施例6的方法制备G5-DBEA30/RNase A-Aco复合物颗粒， 聚合物与RNase A-Aco 的质量比分别为2 1、 1 1、 1 2、 1 4、 1 8， 得到五种不同质量比的颗粒。 将五种颗粒以不同的 聚合物浓度(10、 20 g/mL)处理Hela细胞， 培养4h后， 将培养基换成含有FBS的培养基继续培 养44h， 最后用标准MTT方法检测细胞活力。 结果如图8(b)所示， 从不同实验组中细胞活力的 差异可知， G5-DBEA30/RNase A-Aco复合物颗粒最佳的质量比为1 1，。

40、 此条件下具有最强的 肿瘤细胞杀伤力。 0088 将G5-DBEA30/RNase A-Aco(1 1)复合物颗粒以不同的蛋白浓度处理Hela细胞， 培 养4h后， 将培养基换成含有FBS的培养基继续培养44h， 最后用标准MTT方法检测细胞活力。 结果如图8(c)所示， 可知G5-DBEA30/RNase A-Aco颗粒以蛋白浓度依赖的方式引起Hela细 胞死亡， RNase A浓度越高， 细胞杀伤能力越强。 0089 图8为G5-DBEA30递送RNase A蛋白引起肿瘤细胞死亡相关图； 图8(a)为G5-DBEA30 聚合物在不同浓度下对Hela细胞的毒性曲线图； 图8(b)为G5-DB。

41、EA30与RNase A-Aco以不同 质量比形成复合物颗粒， 且在不同聚合物浓度下引起Hela细胞死亡曲线； 图8(c)为G5- DBEA30/RNase A-Aco颗粒以蛋白浓度依赖的方式引起Hela细胞死亡曲线。 说明书 7/7 页 9 CN 112057631 A 9 图1 图2(a) 说明书附图 1/8 页 10 CN 112057631 A 10 图2(b) 图2(c) 说明书附图 2/8 页 11 CN 112057631 A 11 图2(d) 图2(e) 说明书附图 3/8 页 12 CN 112057631 A 12 图3 图4(a) 图4(b) 说明书附图 4/8 页 13 CN 112057631 A 13 图4(c) 图5 说明书附图 5/8 页 14 CN 112057631 A 14 图6 图7 说明书附图 6/8 页 15 CN 112057631 A 15 图8(a) 图8(b) 说明书附图 7/8 页 16 CN 112057631 A 16 图8(c) 说明书附图 8/8 页 17 CN 112057631 A 17 。