新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用.pdf

《新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、新冠疫苗及其制备方法和应用.pdf（45页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010865106.3 (22)申请日 2020.08.25 (71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 张志芳李轶女刘兴健宋浩志 易咏竹高新桃胡小元李家磊 李丹 (74)专利代理机构 北京思元知识产权代理事务 所(普通合伙) 11598 代理人 余光军霍雪梅 (51)Int.Cl. A61K 39/215(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61K 47/64(2017.01。

2、) A61P 31/14(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/866(2006.01) (54)发明名称 新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗 原颗粒、 新冠疫苗及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基 融合的纳米抗原颗粒、 新冠疫苗及其制备方法和 应用。 本发明将新型冠状病毒S蛋白的ECD、 S1亚 基和RBD分别与铁蛋白亚基N端融合表达展示在 自组装铁蛋白笼形结构表面。 本发明进一步将S 蛋白进行突变优化以提高其可溶性表达量和表 达效率， 。

3、提高疫苗的免疫效力与宽度并有效提高 免疫原性。 本发明利用大肠杆菌原核表达系统、 家蚕及AcMNPV昆虫细胞真核表达系统分别表达 重组蛋白疫苗或通过重组杆状病毒在脊椎动物 体内组织进行基因呈递产生抗原诱导抗体产生。 本发明新冠疫苗能引发广泛中和性抗新冠抗体， 不仅可提高免疫效力还能扩大免疫范围， 具有成 为一种具有交叉免疫效力的通用新冠疫苗的潜 力。 权利要求书1页 说明书24页 序列表17页 附图2页 CN 112076315 A 2020.12.15 CN 112076315 A 1.一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒， 其特征在于， 所述融合蛋白由新冠病毒S蛋白和 单体铁蛋白亚基连接得到； 。

4、优选的， 将新冠病毒S蛋和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG 连接得到融合蛋白。 2.按照权利要求1所述的纳米抗原颗粒， 其特征在于， 所述新冠病毒S蛋白选自S蛋白的 胞外结构域、 S1亚基或受体结合区中的任何一种； 所述单体铁蛋白亚基选自细菌铁蛋白、 植物铁蛋白、 藻铁蛋白、 昆虫铁蛋白、 真菌铁蛋 白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种； 优选的， 所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋白单 体， 进一步优选的， 将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19位天冬酰胺突变为谷氨酰胺。 3.按照权利要求1所述的纳米抗原颗粒， 其特征在于， 所述融合蛋白的氨基酸序列是 SEQ ID NO.1、 SEQ ID N。

5、O.4或SEQ ID NO.7所示的序列。 4.按照权利要求3所述的纳米抗原颗粒， 其特征在于， 将SEQ ID NO.1， SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列分别按照T344A， Y380E， D400S， R419M， R465K或F501A这6种 氨基酸单位点突变方式所获得的单位点突变体。 5.按照权利要求3所述的纳米抗原颗粒， 其特征在于， 将SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.4或 SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列分别按照T334A-Y380E,Y380E-R419M或R419M-R465K的氨基 酸双位点突变方式获得的双位点突变体。 6。

6、.权利要求3所述的纳米抗原颗粒的编码基因； 优选的， 所述编码基因的核苷酸序列分 别为SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列； 或者为SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。 7.含有权利要求6所述编码基因的表达载体。 8.权利要求6所述的编码基因或权利要求7所述的表达载体在制备防治新型冠状病毒 的疫苗中的用途。 9.按照权利要求9所述的用途， 其特征在于， 包括： 将所述的编码基因在大肠杆菌原核 表达系统中进行表达， 收集并纯化所表达的抗原； 或者， 将所述的编码基因在家蚕表达系统或AcMNP。

7、V-昆虫细胞真核表达系统中进行表 达， 收集并纯化所表达的抗原； 优选的， 将所述的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建 得到重组转移载体； 将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞， 获得重组杆状病毒； 将重组杆状病毒感染昆虫宿主或细胞， 培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的抗 原， 纯化， 即得； 或者， 将所述的编码基因克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中得到重组杆状病毒； 将重组杆状病毒在脊椎动物体内组织进行基因呈递产生抗原。 10.一种防治新型冠状病毒的疫苗， 其特征在于， 包括预防或治疗上有效量的权利要求 1-5所述的纳米抗原颗粒以及药学上可接受的免疫佐剂或载体。 权利要求书。

8、 1/1 页 2 CN 112076315 A 2 新冠病毒S蛋白和铁蛋白亚基融合的纳米抗原颗粒、 新冠疫苗 及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒， 尤其涉及包含由新冠病毒S蛋白和 单体铁蛋白亚基融合在一起的纳米抗原颗粒以及由该纳米颗粒抗原制备的新冠疫苗， 属于 新冠疫苗领域。 背景技术 0002 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种可引起人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的新 发呼吸道病原体， 与中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)同属 -冠状病毒。 SARS-CoV-2主要通过呼吸系统。

9、和消化系统感染， 具有较高的 传染性和致死率， 其临床表现从轻微的流感样症状到严重危及生命的重症肺炎。 新冠病毒 与其他冠状病毒类似， 由四个结构蛋白组成， 分别是刺突蛋白(spike， S)、 包膜蛋白 (envelope， E)、 膜蛋白/基质蛋白(membrane/matrix， M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid， N)。 S 蛋白通过位于S1亚基上的受体结合区(receptor bingding domain， RBD)与宿主细胞表面 的血管紧张素转化酶2受体结合， 从而进入人体细胞， 导致发烧、 肺部感染等疾病。 因为针对 病毒S蛋白的中和抗体可阻断病毒侵入宿主细胞， 所以。

10、目前在研究的大多数新冠疫苗都是 以S蛋白为主要抗原进行设计开发的。 新冠病毒引起的肺炎已在全球范围内大规模蔓延， 接 种疫苗是根除病毒性传染病最有效的方法， 国内外各大科研机构已快速展开COVID-19疫苗 的研制工作。 0003 近几年， 铁蛋白作为一个理想的抗原呈递和疫苗开发平台发展迅速， 铁蛋白纳米 粒子由24个亚基自组装而成， 每三个亚基构成一个三聚体。 因为N端暴露在笼形结构外面， 常用来在N端融合表达并展示外源蛋白。 同时， SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白也是一个三聚体 结构， S-Ferritin融合蛋白组装后可以在纳米颗粒表面产生一个八元S蛋白三聚体刺突， 在 结构上很好。

11、的模拟了SARS-CoV-2 S蛋白天然结构， 从而使得S蛋白抗原性更好。 0004 铁蛋白纳米颗粒广泛存在于所有生物体内， 是生物体内的主要储铁形式， 对生命 活动非常重要。 铁蛋白非常稳定， 能够耐受高温(70-80)和多种变性剂而不影响其天然 蛋白结构。 利用铁蛋白这些独特的理化性质， 仿生合成铁蛋白并使其成为理想的纳米载体。 铁蛋白作为纳米载体具有较大表面积和较为简单的表面修饰方法， 能够高效率、 高精度地 装载药物分子。 发明内容 0005 本发明的目的之一是提供一种包含新冠病毒S蛋白融合蛋白的自组装铁蛋白纳米 抗原颗粒； 0006 本发明的目的之二是将所述融合蛋白进行突变进而提高融。

12、合蛋白的表达量或表 达效率； 0007 本发明目的之三是提供高效表达所述融合蛋白的方法； 说明书 1/24 页 3 CN 112076315 A 3 0008 本发明目的之四是提供一种将自组装铁蛋白纳米颗粒与新冠病毒S蛋白所构建的 融合基因呈递给动物体内并在动物体内呈递抗原诱导产生抗体的方法。 0009 本发明的目的之五是提供基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒得到的纳米颗粒新冠 疫苗； 0010 为了实现上述目的， 本发明所采取的技术方案是： 0011 本发明首先提供了一种包含融合蛋白的纳米抗原颗粒， 所述融合蛋白由新冠病毒 S蛋白和单体铁蛋白亚基连接得到； 优选的， 将新冠病毒S蛋和单体铁蛋白亚基。

13、的N端通过连 接肽SGG连接得到融合蛋白； 其中， 将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉， 然后将连接肽 SGG连在铁蛋白N端第5个氨基酸上。 0012 所述新冠病毒S蛋白选自ECD(胞外结构域)、 S1亚基或RBD(受体结合区)中的任何 一种； 优选的， 本发明将NCBI上GenBank序列号： YP_009724390作为相应毒株的抗原基因， 以 取得最佳的保护效果。 0013 所述单体铁蛋白亚基包括细菌铁蛋白、 植物铁蛋白、 藻铁蛋白、 昆虫铁蛋白、 真菌 铁蛋白或哺乳动物铁蛋白中的任何一种； 优选的， 所述单体铁蛋白亚基是幽门螺杆菌铁蛋 白单体， 其氨基酸序列为NCBI上GenBank序。

14、列号： WP_000949190所示； 为了促进新冠病毒与 铁蛋白融合纳米颗粒的表达效率并提高可溶表达， 将幽门螺杆菌铁蛋白氨基酸序列中第19 位天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)以消除糖基化位点。 0014 作为本发明一种优选的具体实施方式， 将新冠病毒S蛋白的ECD(胞外结构域)和单 体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示； 将新冠病毒S蛋白的S1亚基和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白的氨 基酸序列为SEQ ID NO.4所示； 将新冠病毒S蛋白的RBD(受体结合区， 为了使RBD和铁蛋白更 好融合， RBD区前后各延。

15、长三个氨基酸。 )和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到 融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示； 其中， SEQ ID NO.1所示融合蛋白的编码基因 的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示， SEQ ID NO.4所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO.5所示， SEQ ID NO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所 示。 0015 本发明为了提高新冠病毒S蛋白ECD、 S1、 RBD与铁蛋白单体连接后得到的融合蛋白 的表达量， 本发明进一步将SEQ ID NO.1， SEQ ID NO.4， SEQ ID NO.7所示融合。

16、蛋白的编码 基因的核苷酸序列进行糖基化位点分析， 以消除糖基化位点来增加可溶性表达； 具体的， 本 发明进一步利用OptimumGeneTM技术对新冠病毒S蛋白和铁蛋白单体亚基氨基酸序列根据大 肠杆菌密码子偏好性对氨基酸序列进行改造， 对影响基因转录效率、 翻译效率和蛋白折叠 的GC含量、 CpG二核苷酸含量、 密码子偏好性、 mRNA的二级结构、 mRNA自由能稳定性、 RNA不稳 定性基因序列、 重复序列等多种相关参数进行优化设计， 并保持最终翻译成的蛋白序列不 变； 同时， 用人CD5信号肽(GenBank No.NM_014207.4)来替换S蛋白原有信号肽， 加上酶切位 点和Koza。

17、k序列。 由此， 本发明分别将SEQ ID NO.2， SEQ ID NO.5， SEQ ID NO.8所示的基因 序列按照上述原则进行优化后分别得到SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.9所示的优 化后的基因序列。 本发明将优化后的基因序列在家蚕表达系统中进行表达， 根据基因表达 产物ELISA效价结果可见， 密码子优化后的基因序列的表达量相比优化前有了显著提高。 0016 本发明在序列优化之后对融合蛋白进行氨基酸单位点突变， 双位点突变， 以提高 说明书 2/24 页 4 CN 112076315 A 4 其可溶性表达量和表达效率， 即， 本发明以S EC。

18、D-Ferritin、 S S1-Ferritin、 S RBD- Ferritin密码子优化后的基因序列为模板， 设计多对引物对序列进行定点突变， 具体的， 本 发明将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列按照F70N,G100L,Q126T,Q145R,T178D,L200S, L240T,T270E,T285D,T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C, F501A或H530K的中的任何一种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体； 将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列按照F70N,G100L,Q126T,Q145R。

19、,T178D,L200S,L240T,T270E,T285D, T326P,T344A,Y362E,Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,F501A或H530K中的任何一 种氨基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体； 将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列按 照T344A,Y362E， Y380E,D400S,R419M,I445F,R465K,A486C,F501A或H530K中的任何一种氨 基酸单位点突变方式获得了多个单位点突变体。 0017 本发明中所述的 “F70N” 单位点突变的含义是指将第70位的苯丙氨酸突变为天冬 酰胺， 其余的单位点突变的含。

20、义以此类推。 0018 本发明将上述这些单位点突变体在家蚕表达系统中分别进行了表达， 根据表达结 果可见： 将SEQ ID NO.1， SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列分别按照T344A， Y380E， D400S， R419M， R465K、 F501A这6种氨基酸单位点突变方式所各自获得的6个突变体的 表达产物的效价均呈显著提升。 0019 基于所确定的部分单位点的突变是有效突变， 可以达到提高SARS-CoV 2S- Ferritin-O-M突变体表达量的效果， 考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构决定着 蛋白质的高级结构且上述进行的氨基酸单位点突变有。

21、部分突变位点的位置可能是相互关 联的， 本发明将可以提高表达量的这6个单突变位点(T344A， Y380E， D400S， R419M， R465K， F501A)两两组合进行双位点突变， 具体如下： 0020 将SEQ ID NO.1， SEQ ID NO.4， SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列分别按照T334A- Y380E， T334A-D400S， T334A-R419M， T334A-R465K， T334A-R465K， T334A-F501A， Y380E- D400S， Y380E-R419M， Y380E-R465K， Y380E-F501A， D400S-R419M，。

22、 D400S-R465K， D400S- F501A， R419M-R465K， R419M-F501A、 R465K-F501A的氨基酸双位点突变方式获得45个双位点 突变体； 本发明将获得的45个双位点突变体分别在家蚕表达系统中进行表达， 根据表达结 果可见： 将SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.4SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列按照T334A-Y380E, Y380E-R419M或R419M-R465K的氨基酸双位点突变方式获得的6个双位点突变体的表达产物 的效价呈显著提升， 其中， 将SEQ ID NO.1， SEQ ID NO.4， SEQ ID NO.7所示的氨基。

23、酸按照 Y380E-R419M氨基酸双位点突变获得的突变体的效价提升最为显著。 0021 本发明中所述的 “T334A-Y380E” 双位点突变的含义是指将第334位的苏氨酸突变 丙氨酸为以及同时将第380位的酪氨酸突变为谷氨酸， 其余的双位点突变的含义以此类推。 0022 本发明将获得的优化的基因序列在家蚕表达系统中进行表达， 根据在大肠杆菌宿 主表达结果可见： 所得多个优化突变序列表达量相比原始序列均有显著提升。 本发明进一 步将优化序列在家蚕表达系统中的表达产物经过初步纯化后采用电镜进行观察， 观察结果 可见产物大小与预期符合的纳米颗粒， 笼状体的直径为20-30纳米左右， 仔细观察可见。

24、有天 线状突出。 如图3所示。 0023 本发明将获得的优化的相应基因序列克隆到杆状病毒哺乳动物的表达载体中构 建得到呈递基因的重组杆状病毒； 通过重组杆状病毒将基因呈递给小鼠， 结果发现小鼠所 说明书 3/24 页 5 CN 112076315 A 5 产生的抗体效价明显高于健康蚕蛹对照和传统方法制备的疫苗。 0024 因此， 本发明所提供的包含融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒能应用于制备 新冠疫苗， 其制备方法包括： 0025 ( )将所述的融合蛋白编码基因采用原核表达系统在原核细胞中进行表达得到纳 米抗原颗粒， 将所表达的纳米抗原颗粒产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合 在一起。

25、得到新冠疫苗； 0026 作为参考， 采用原核系统表达系统在原核细胞中表达纳米抗原颗粒的步骤包括： 0027 (1)将融合蛋白原始基因序列或优化后的融合蛋白基因序列克隆到表达载体 pET28a上， 得到重组质粒； 0028 (2)将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中表达， 随后经过镍柱纯化， 即得。 0029 ()将所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞或生物体或组织 中进行表达， 将所表达的抗原产物纯化后与医学上可接受的免疫佐剂或载体混合在一起得 到新冠疫苗。 0030 作为参考， 所述的融合蛋白编码基因采用真核表达系统在真核细胞中进行表达的 方法包括以下步骤： 0031。

26、 将所述的融合蛋白编码基因在家蚕表达系统中进行表达， 收集并纯化所表达的抗 原； 优选的， 将所述的融合蛋白编码基因构建到家蚕杆状表达载体中制备得到重组家蚕杆 状病毒； 将重组家蚕杆状病毒在家蚕细胞中扩增后在家蚕或蚕蛹中进行表达。 0032 或者将所述的融合蛋白编码基因在AcMNPV-昆虫细胞真核表达系统中进行表达， 收集并纯化所表达的抗原； 优选的， 将融合蛋白编码基因克隆到杆状病毒转移载体中构建 得到重组杆状病毒转移载体； 将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞， 获 得重组杆状病毒； 将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞， 培养被感染的昆虫细胞或昆 虫宿主表达相应的抗原， 。

27、纯化即得。 0033 ()还可将所述的融合蛋白编码基因克隆到基因呈递载体上构建得到向脊椎动 物细胞或个体中呈递外源基因的重组杆状病毒转移载体， 将重组杆状病毒转移载体转染家 蚕细胞得到重组病毒； 将所得到的重组病毒通过注射或口服的方式在动物体内呈递抗原并 诱导动物产生抗体。 0034 由此， 本发明进一步提供了一种防治新型冠状病毒的疫苗， 包括： 预防或治疗上有 效量的包含新冠病毒S蛋白融合蛋白的自组装铁蛋白纳米抗原颗粒以及药学上可接受的免 疫佐剂或载体。 0035 本发明的防治新型冠状病毒疫苗可以以各种不同的药物赋形剂或载体配制； 它们 可以包括盐和缓冲剂以提供生理学的离子强度和pH， 譬如。

28、， 包括表面活性剂， 诸如聚山梨醇 酯20和80以防止抗原聚集； 用于抗原稳定的稳定剂， 诸如PEG、 海藻糖和明胶及用于缓释的 聚合物诸如CMC、 HEC和葡聚糖。 疫苗还可以受控释放或增强的展示系统配制， 诸如水凝胶、 病毒体、 纳米颗粒和乳液。 疫苗还可以配制合适的佐剂以进一步增加交叉反应免疫应答和 交叉保护， 所述合适的佐剂可以选自多糖诸如脂多糖和皂苷、 核酸诸如CpG和聚I:C、 脂质诸 如MPL(单磷酰脂质A)、 蛋白质诸如细菌鞭毛蛋白、 无机盐(诸如铝盐和磷酸钙)、 乳剂(诸如 弗氏不完全佐剂、 MF59和AS03)和各种Toll样受体配体。 可以用处理的抗原测试不同的佐 剂， 。

29、以鉴定在合适的佐剂剂量产生较高水平的交叉反应免疫应答和交叉保护， 包括完全的 说明书 4/24 页 6 CN 112076315 A 6 或100的保护的合适的佐剂。 0036 本发明的新型冠状疫苗可通过各种途径使用， 如肌内、 皮下、 鼻内、 局部、 舌下、 或 口服。 0037 基于铁蛋白的新型纳米颗粒疫苗比传统疫苗具有更强的免疫力和更广的免疫范 围。 本发明利用铁蛋白纳米颗粒展示新冠病毒S蛋白抗原， 能够显著地增强抗原的免疫原 性， 引起更强的体液、 细胞免疫反应， 是理想的纳米疫苗平台。 本发明所提供的疫苗能通过 在幽门螺杆菌铁蛋白笼形结构表面展示新冠病毒S蛋白结构， 从而能够引起广泛。

30、中和性新 冠病毒抗体。 此种疫苗诱导个体产生的中和性抗体不仅增加了免疫效力， 还增加了免疫范 围， 能保护不同亚型新型冠状病毒攻击。 0038 按上述步骤， 此类似的方案也可适用于其他冠状病毒科的病毒， 如SARS、 猪流行性 腹泻病毒(PEDV)、 猪传染性胃肠炎(TGEV)等疫苗的研发。 0039 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果： 0040 1、 本发明利用原核表达系统大肠杆菌、 家蚕杆状病毒和AcNPV-昆虫细胞真核表达 系统表达重组蛋白疫苗， 疫苗制备过程不涉及到活的有害病毒， 相比传统疫苗制备方法操 作更加安全、 简便， 适合进行快速大规模生产； 0041 2、 本发明提。

31、供的纳米新型冠状疫苗可以诱导具有广谱性质的新冠病毒抗体， 为制 备一种通用新冠疫苗打下基础。 0042 3、 本发明提供的新型冠状疫苗， 用这种纳米新冠疫苗免疫接种动物而诱导产生的 抗新型冠状病毒抗体水平明显比传统方法制备的疫苗的高。 0043 本发明所涉及到的术语定义 0044 除非另外定义， 否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。 0045 词语 “抗原” 和 “免疫原” 可互换使用， 且是指能够诱导特异性体液(抗体)和细胞免 疫应答的分子、 物质、 蛋白质、 糖蛋白、 或活病毒。 0046 术语 “抗原性” 是指抗体与特异性抗原反应或。

32、结合的能力； 术语 “免疫原性” 是指抗 原或疫苗诱导特异性免疫应答的能力； 术语 “免疫应答” 是指针对抗原、 疫苗或感染因子的 体液或抗体介导的和细胞介导的免疫应答； 术语 “疫苗” 是指用于针对感染性或非感染性疾 病的治疗性处理或预防性免疫的包括抗原的组合物； 术语 “免疫” 是指通过接种疫苗或感染 产生的免疫应答， 其提供针对感染性或外来试剂的保护； 术语 “重组蛋白质或抗原” 是指以 重组DNA技术产生的蛋白质或抗原， 其可用于在包括细菌、 哺乳类细胞、 昆虫细胞和植物的 各种宿主中克隆和表达基因以产生蛋白质。 术语 “效力” 是指如通过指定的效力测定测量的 在抗原制剂或疫苗中抗原的。

33、量。 0047 术语 “突变” 和 “突变体” 在此具有它们的常用含义， 指的是在核酸或多肽序列中的 遗传的、 天然存在的或引入的变化， 它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。 0048 术语 “宿主细胞” 或 “重组宿主细胞” 意指包含本发明多核苷酸的细胞， 而不管使用 何种方法进行插入以产生重组宿主细胞， 例如直接摄取、 转导、 f配对或所属领域中已知的 其它方法。 外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。 0049 术语 “转染” 指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。 说明书 5/24 页 7 CN 112076315 A 7 附图说明 。

34、0050 图1 SARS-CoV 2 S-Ferritin在大肠杆菌原核表达系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳 图。 M： Marker； 1， 2： S ECD诱导； 3： S ECD未诱导； 4， 5： S S1诱导； 6： S S1未诱导； 7， 8:S RBD诱 导； 9： S RBD未诱导； 10： 空载， 空载为pET-28a载体的原核表达样品。 0051 图2为S ECD-Ferritin基因表达产物Western blotting检测图； A为相应基因表达 产物； B为阴性对照。 0052 图3为S S1-Ferritin基因表达产物Western blotting检测图； A为相应基因。

35、表达 产物； B为阴性对照。 0053 图4为S RBD-Ferritin基因表达产物Western blotting检测图； A为相应基因表达 产物； B为阴性对照。 0054 图5SARS-CoV 2 S-Ferritin纳米颗粒蚕血淋巴样品经初步纯化后用透射电镜检 测， 标尺尺寸： 50nm； 图中可观察到符合预期大小的大量球状物质， 表明融合蛋白成功自组 装成纳米颗粒抗原。 具体实施方式 0055 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。 但这些实施例仅是范例性的， 不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员应 该理解的是， 在不偏离本发明。

36、的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换， 但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。 0056 1、 试验材料与试剂 0057 (1)菌株、 病毒株与载体： 原核表达载体pET-28a(+)、 大肠杆菌TOP10菌株、 转移载 体pVL1393、 原核表达菌株BL21(DE3)、 家蚕细胞BmN、 Sf-9细胞、 Hi5昆虫细胞、 家蚕核型多角 体病毒亲本株BmBacmid、 苜蓿斜纹夜蛾多角体病毒亲本株AcBacmid、 家蚕品种JY1均为中国 农业科学院生物技术研究所分子微生物实验室保存； 0058 (2)铁蛋白序列和新冠病毒S蛋白基因序列： 通过分析得到的共有序列送。

37、至金斯瑞 公司合成， 并克隆到载体pUC57载体上。 0059 (4)培养基： 大肠杆菌培养基为LB培养基； 家蚕昆虫细胞培养基为TC-100购自 AppliChem公司； 0060 (5)新冠病毒与铁蛋白融合构建的纳米疫苗的动物实验在隔离实验室进行。 0061 实施例1 S ECD-Ferritin、 S S1-Ferritin、 S RBD-Ferritin融合序列纳米颗粒疫 苗的制备与效力检测 0062 1有关溶液和培养基的配置 0063 有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(Joseph et al.,分子克隆实验指 南第三版， 2002； 奥斯伯， 等人， 精编分子生物学指南， 。

38、1998)。 0064 2 SARS-CoV 2 S蛋白基因序列和铁蛋白基因序列的合成。 0065 为了使新冠病毒S蛋白与铁蛋白更好的融合表达， 利用信号肽分析软件(SignalP) 和跨膜结构域分析软件(TMHMM)分别对新冠病毒S蛋白(NCBI上GenBank序列号： YP_ 009724390)的氨基酸序列进行分析， 得出新冠病毒(SARS-CoV)2 S蛋白信号肽为前13个氨 基酸， 其胞外结构域为前1213个氨基酸， 本试验分别选用ECD、 S1、 RBD序列进行融合。 说明书 6/24 页 8 CN 112076315 A 8 0066 为了促进新冠病毒与铁蛋白融合纳米颗粒的表达效。

39、率并提高可溶表达， 将幽门螺 杆菌铁蛋白氨基酸序列(NCBI上GenBank序列号： WP_000949190)中第19位天冬酰胺(N)突变 为谷氨酰胺(Q)， 以消除糖基化位点。 其中新冠病毒S蛋白序列与铁蛋白序列之间由一段连 接肽连接(SGG)， 将铁蛋白氨基酸序列前4个氨基酸去掉， 然后将连接肽连在铁蛋白N端第5 个氨基酸上。 0067 为了提高目的基因在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率， 在基因前面 加了Kozak序列AAC， 为了提高翻译终止效率， 终止密码子改为TAA。 此外， 还去除了基因序列 内部的BamHI、 EcoRI等限制性酶切位点， 在基因上游加上了BamHI，。

40、 在基因下游加上了EcoRI 限制性酶切位点， 以便后续克隆到真核转移载体pVL1393中。 0068 将目的基因序列去掉信号肽， 利用pET-28a(+)载体上的ATG进行起始起始翻译。 此 外， 还去除了基因序列内部的BamHI、 EcoRI等限制性酶切位点， 在基因上游加上了BamHI， 在 基因下游加上了EcoRI限制性酶切位点， 以便后续克隆到原核载体pET-28a(+)上。 0069 将新冠病毒S蛋白的ECD(胞外结构域)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连 接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示； 将新冠病毒S蛋白的S1亚基和单体铁蛋 白亚基的N端通过连接肽S。

41、GG连接得到融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示； 将新冠 病毒S蛋白的RBD(受体结合区)和单体铁蛋白亚基的N端通过连接肽SGG连接得到融合蛋白 的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示； 其中， SEQ ID NO.1所示融合蛋白的编码基因的核苷酸 序列为SEQ ID NO.2所示， SEQ ID NO.4所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示， SEQ ID NO.7所示融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示。 0070 本发明利用OptimumGeneTM技术对新冠病毒S蛋白原始氨基酸序列和铁蛋白单体亚 基氨基酸序列根据家蚕密码子。

42、偏好性分别对SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8所 述的编码基因的核苷酸序列进行优化改造， 对影响基因转录效率、 翻译效率和蛋白折叠的 GC含量、 CpG二核苷酸含量、 密码子偏好性、 mRNA的二级结构、 mRNA自由能稳定性、 RNA不稳定 性基因序列、 重复序列等多种相关参数进行优化设计， 并保持最终翻译成的蛋白序列不变, 优化后的编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.9所示。 0071 将上述所设计的新冠病毒S蛋白基因序列和铁蛋白序列进行人工合成。 0072 3新冠病毒S蛋白和铁蛋白原始融合。

43、蛋白的质粒构建 0073 3.1新冠病毒和铁蛋白原始融合蛋白的PCR扩增 0074 用融合PCR技术将新冠病毒和铁蛋白融合构建。 0075 3.1.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增 0076 PCR扩增S-ECD序列： 以质粒pUC57-SARS-CoV 2 S为模板 0077 F15 -GGATCCATGTTTGTTTTTCTTGTTTT-3 R15 -TTGATGATGTCGCCACCGGATGGCCATTTTATATACTGCT-3 0078 PCR扩增Ferritin序列： 以pUC57-Ferritin为模板 0079 F25 -AGCAGTATATAAAATGGCCATCCGGTGG。

44、CGACATCATCAA-3 R25 -GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3 0080 以PCR产物S-ECD和Ferritin为模板， Overlap-PCR扩增出S ECD-Ferritin 0081 F15 -GGATCCATGTTTGTTTTTCTTGTTTT-3 说明书 7/24 页 9 CN 112076315 A 9 R25 -GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3 0082 PCR扩增S-S1序列： 以质粒pUC57-SARS-CoV 2 S为模板 0083 F15 -GGATCCATGTTTGTTTTTCTTGTTTT-3 R15 -TT。

45、GATGATGTCGCCACCGGAACGTGCCCGCCGAGGAGAAT-3 0084 PCR扩增Ferritin序列： 以pUC57-Ferritin为模板， 0085 F25 -ATTCTCCTCGGCGGGCACGTTCCGGTGGCGACATCATCAA-3 R25 -GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3 0086 以PCR产物S-S1亚基和Ferritin为模板， Overlap-PCR扩增出S S1-Ferritin 0087 F15 -GGATCCATGTTTGTTTTTCTTGTTTT-3 R25 -GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-。

46、3 0088 PCR扩增S RBD序列： 以质粒pUC57-SARS-CoV 2 S为模板 0089 F15 -GGATCCTCTAACTTTAGAGTCCAACC-3 R15 -TTGATGATGTCGCCACCGGAATTGAAGTTGAAATTGACAC-3 0090 PCR扩增Ferritin序列： 以pUC57-Ferritin为模板， 0091 F25 -GTGTCAATTTCAACTTCAATTCCGGTGGCGACATCATCAA-3 R25 -GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3 0092 以PCR产物S RBD和Ferritin为模板， Overlap-。

47、PCR扩增出S RBD-Ferritin 0093 F15 -GGATCCTCTAACTTTAGAGTCCAACC-3 R25 -GAATTCTTAGCTCTTGCGGGACTTGG-3 0094 4新冠病毒和铁蛋白融合蛋白的编码基因优化后序列的PCR扩增 0095 用融合PCR技术将新冠病毒和铁蛋白进行融合构建。 0096 4.1大肠杆菌表达质粒的PCR扩增 0097 S ECD-Ferritin-O(SEQ ID NO.3)融合PCR引物： 0098 S ECD PCR引物： 0099 F3： 5 -CGGGATCCGCCAACATGCCGATGGGTA-3 0100 R3： 5 -TTG。

48、ATGATGTCACCACCGCTCGGCCACTTAATGTATTGTT-3 0101 Ferritin PCR引物： 0102 F4： 5 -AACAATACATTAAGTGGCCGAGCGGTGGTGACATCATCAA-3 0103 R4： 5 -CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3 0104 Over-lapPCR引物： 0105 F3： 5 -GGATCCGCCAACATGCCGATGGGTA-3 0106 R4： 5 -CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3 0107 S S1-Ferritin-O(SEQ ID NO.6)融合PCR引物： 0108 S。

49、 S1 PCR引物： 0109 F3： 5 -CGGGATCCGCCAACATGCCGATGGGTA-3 0110 R3： 5 -TTGATGATGTCACCACCGCTCGGCCACTTAATGTATTGTT-3 0111 Ferritin PCR引物： 0112 F4： 5 -AACAATACATTAAGTGGCCGAGCGGTGGTGACATCATCAA-3 说明书 8/24 页 10 CN 112076315 A 10 0113 R4： 5 -CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3 0114 Over-lapPCR引物： 0115 F3： 5 -GGATCCGCCAACAT。

50、GCCGATGGGTA-3 0116 R4： 5 -CGGAATTCTTAGCTCTTACGGCT-3 0117 S RBD-Ferritin-O(SEQ ID NO.9)融合PCR引物： 0118 S RBD PCR引物： 0119 F3： 5 -CGGGATCCGCCAACATGCCGATGGGTA-3 0120 R3： 5 -TTGATGATGTCACCACCGCTCGGCCACTTAATGTATTGTT-3 0121 Ferritin PCR引物： 0122 F4： 5 -AACAATACATTAAGTGGCCGAGCGGTGGTGACATCATCAA-3 0123 R4： 5 -CG。