具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法.pdf

《具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法.pdf（8页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010891460.3 (22)申请日 2020.08.30 (71)申请人 中南林业科技大学 地址 410004 湖南省长沙市天心区韶山南 路498号 申请人 西藏农牧学院 (72)发明人 孙术国罗章杨飞艳 (74)专利代理机构 湖南企企卫知识产权代理有 限公司 43257 代理人 张慧 (51)Int.Cl. C12P 21/06(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (54)发明名称 一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制 备方法 (57)摘要 一种具。

2、有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制 备方法， 包括以下步骤： 取牦牛奶渣粉， 按料液比 1： 35g/ml加入蒸馏水， 得底物， 往底物中加入 复合酶， 超声破碎， 酶解， 沸水浴灭酶， 离心， 取上 清液进行冷冻干燥， 即得具有抗氧化活性的牦牛 奶渣多肽。 所得多肽能有效清除超氧阴离子、 羟 基自由基、 DPPH自由基， 而且具有与铁离子螯合 的能力， 同时具有很好的过氧化氢清除能力。 本 发明提供的牦牛奶渣多肽富集抗氧化活性成分， 可用于药品制备。 此外， 本发明不仅响应了国家 变废为宝的策略， 且方法操作简单， 生产成本低， 对新型抗氧化保健品和食品添加剂开发与应用 具有重要价值。 权利要求。

3、书1页 说明书4页 附图2页 CN 112094880 A 2020.12.18 CN 112094880 A 1.一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 取牦牛奶渣粉， 按料液比1： 35g/ml加入蒸馏水， 得底物， 往底物中加入复合酶， 均质， 3738水浴酶解24h， 酶解12次， 沸水浴10min以上灭酶， 离心， 取上清液进行冷冻干 燥， 即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。 2.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 其特征在于， 复 合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。 3.根据权利要求2所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的。

4、制备方法， 其特征在于， 胃 蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1 0.81.2。 4.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 其特征在于， 复 合酶与底物的质量之比为1： 80120。 5.根据权利要求2所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 其特征在于， 胃 蛋白酶的效能为1： 30000， 胰蛋白酶的酶活为大于250USPu/mg。 6.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 其特征在于， 离 心的条件为1200015000rpm/min离心2030min。 7.根据权利要求6所述的具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 其特征在于， 120。

5、00rpm/min离心20min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112094880 A 2 一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 涉及生物工程技术 领域。 背景技术 0002 奶渣是将牦牛全乳提制酥油后的脱脂乳加热处理后， 再加入皱胃酶或酸奶后经过 滤、 晒干而成。 牦牛奶渣质地坚硬呈碎渣状， 易于保存， 有着丰富的蛋白质、 16种氨基酸、 钙、 铁、 维生素、 乳糖， 脂肪含量低， 具有巨大的市场潜力和发展前景， 是高原牧民重要的食物蛋 白来源之一， 在野外放牧生活中十分方便。 但目前奶渣的研究及产品开发。

6、有限， 除自食与送 与宾客以外， 多用于饲养牲畜， 利用价值较低， 工业化生产更是少之又少， 只有极少数转化 为经济来源。 0003 CN110904176A公开了一种北芪菇蛋白源抗氧化肽的制备方法， CN106317170B公开 了一种紫苏籽抗氧化肽及其应用， 序列为Tyr-Leu(YL)。 这些方案中不乏存在具有抗氧化活 性的多肽， 但来源对象多为肉源蛋白肽和植物源蛋白肽， 乳制品类蛋白肽却鲜少。 0004 另一方面， 在将牦牛乳制成酥油过程中， 不可避免的产生大量奶渣， 这些奶渣含有 丰富的蛋白质及其他营养物质， 目前由于技术的限制， 这些奶渣蛋白并没有被充分利用， 造 成资源的浪费。 。

7、发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是， 克服现有技术的不足， 提供一种工艺简单的具有抗 氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法。 0006 本发明解决其技术问题采用的技术方案是， 一种具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽 的制备方法， 包括以下步骤： 0007 取牦牛奶渣粉， 按料液比1： 35g/ml加入蒸馏水， 得底物， 往底物中加入复合酶， 均质(均质转速优选10000转/min， 时间优选5min)， 3738水浴酶解24h， 酶解12次， 沸水浴10min以上灭酶， 离心， 取上清液进行冷冻干燥(优选冷冻干燥温度-40,干燥48h)， 即得具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽。 0008 进一步，。

8、 复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。 优选胃蛋白酶和胰蛋白酶的质 量比为1 0.81.2。 复合酶与底物的质量之比为1： 80120。 0009 胃蛋白酶的效能为1： 30000， 胰蛋白酶的酶活为大于250USP u/mg。 0010 离心的条件为1200015000rpm/min离心2030min。 优选12000rpm/min离心 20min。 0011 胃蛋白酶、 胰蛋白酶是常用的蛋白质降解酶， 主要来源于动物。 用胃蛋白酶+胰蛋 白酶酶解得到的奶渣多肽， 可防止奶渣多肽进入体内被小肠和胃部所吸收， 从而达到抗氧 化的效果， 具有使用安全、 量少、 酶解效果好等优点， 并在肉类、 植。

9、物类、 水产品、 乳制品等中 得到广泛应用。 说明书 1/4 页 3 CN 112094880 A 3 0012 本发明方法简单， 所得多肽具有较强的抗氧化活性， 并且可以将该多肽应用于保 健食品和药品的开发与研究。 而且本发明的原料是现有技术中不能加以高价值应用的奶 渣， 资源得到最有效的应用。 0013 所得多肽能有效清除超氧阴离子、 羟基自由基、 DPPH自由基， 而且具有与铁离子螯 合的能力， 同时具有很好的过氧化氢清除能力。 本发明提供的牦牛奶渣多肽富集抗氧化活 性成分， 可用于药品制备。 此外， 本发明不仅响应了国家变废为宝的策略， 且方法操作简单， 生产成本低， 对新型抗氧化保健。

10、品和食品添加剂开发与应用具有重要价值。 附图说明 0014 图1是实施例中所得多肽对DPPH自由基清除活性的作用效果图； 0015 图2是实施例中所得多肽对超氧阴离子自由基清除能力的作用效果图； 0016 图3是实施例中所得多肽对羟基自由基清除能力的作用效果图； 0017 图4是实施例中所得多肽对铁离子还原抗氧化能力的作用效果图； 0018 图5是实施例中所得多肽对过氧化氢清除能力的作用效果图； 0019 N1： 来源海拔2800m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽； 0020 N2： 来源海拔3500m4000m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽； 0021 N3： 。

11、来源海拔4300m的奶渣通过胃蛋白酶+胰蛋白酶酶解所得的奶渣多肽； 0022 N1非酶解： 来源海拔2800m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽； 0023 N2非酶解： 来源海拔3500m4000m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽； 0024 N3非酶解： 来源海拔4300m的奶渣直接水解得到的奶渣多肽。 具体实施方式 0025 在下文的描述中， 给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为详细的理解。 为 了彻底了解本发明， 将在下面描述中提出详细的解构。 本发明的较佳实施例详细描述如下。 0026 下面的实施例说明本发明所得多肽对DPPH自由基、 超氧阴离子自由基、 羟基自由 基、 铁还原抗氧化能力以。

12、及过氧化氢清除能力的作用效果。 0027 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。 0028 实施例1 0029 本实施例之具有抗氧化活性的牦牛奶渣多肽的制备方法， 包括以下步骤： 0030 取牦牛奶渣粉， 按料液比1： 4g/ml加入蒸馏水， 得底物， 往底物中加入复合酶， 均质 5min(均质转速10000转/min)， 37水浴酶解2h， 酶解2次， 沸水浴10min灭酶， 离心， 上清液 即为奶渣多肽上清液； 取上清液进行冷冻干燥(冷冻干燥温度-40,干燥48h)， 即得具有抗 氧化活性的牦牛奶渣多肽。 0031 复合酶为胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶。 胃蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1。

13、 1。 复 合酶与底物的质量之比为1： 100。 0032 离心的条件为12000rpm/min离心20min。 0033 实施例2 0034 对实施例1中得到的奶渣多肽的抗氧化性进行研究。 0035 DPPH自由基清除作用： 用无水乙醇配置浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液， 取实施例1 说明书 2/4 页 4 CN 112094880 A 4 所得的奶渣多肽上清液， 按表1所示的用量逐个加入DPPH溶液和无水乙醇， 混匀后， 于室温 下避光放置30min后， 在518nm处测定吸光度， 平行测定3次， 按下列公式计算清除率。 0036 0037 表1 0038 0039 超氧阴离子自由。

14、基清除作用： 用蒸馏水配置50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)， 用0.01mol/L的HCl溶液配置0.3mmol/L的邻苯三酚溶液。 自氧化速率V0的测定： 在试 管中加入5ml Tris-HCl缓冲液， 25恒温水浴中放置20min， 再加入0.5ml邻苯三酚溶液， 立 即混匀倒入比色杯中， 在325nm处测定A值， 每反应30s记录一组， 共反应5min。 将记录的数据 以时间为横坐标， 吸光值为纵坐标， 作直线回归得到的斜率表示邻苯三酚自氧化速率V0。 0040 奶渣多肽酶解液清除超氧阴离子速率V1的测定： 在试管中加入5ml Tris-HCl缓冲 液， 加入1。

15、ml蒸馏水， 1ml奶渣多肽上清液于25恒温水浴中放置20min， 再加入0.5ml邻苯三 酚溶液， 立即混匀倒入比色杯中， 在325nm处测定A值， 每反应30s记录一组， 共反应5min。 将 记录的数据以时间为横坐标， 吸光值为纵坐标， 做直线回归得到的斜率表示奶渣多肽酶解 液清除超氧阴离子的速率V1。 清除率计算公式为： 0041 0042 羟基自由基清除作用： 用蒸馏水配置pH7.4、 0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液， 5mmol/L的邻菲罗啉， 7.5mmol/L的硫酸亚铁以及1的过氧化氢溶液。 在试管中分别加入 2ml磷酸盐缓冲液， 0.3ml邻菲罗啉溶液， 充分混匀后， 加入。

16、0.2ml FeSO4溶液， 每加一管后立 即混匀。 然后向其中加入奶渣多肽上清液， 混匀， 再加入2ml H2O2， 最后补充体积至8ml。 另再 做损伤管和未损伤管， 其中损伤管中加入1ml H2O2， 未损伤管不加H2O2， 最后补充各管体积 至8ml。 于37下保温1h， 测在536nm下的吸光值， 计算清除率， 其计算公式为： 0043 0044 A0-未损伤管的吸光值； 0045 A1-损伤管的吸光值； 0046 A2-加奶渣多肽上清液的吸光值。 0047 铁离子还原抗氧化能力(FRAP)作用： 用蒸馏水配置pH3.6的醋酸钠缓冲溶液， 说明书 3/4 页 5 CN 1120948。

17、80 A 5 20mmol/L的三氯化铁， 用40mmol/L的HCl溶液配置10mmol/L的TPTZ。 将醋酸钠缓冲液、 三氯 化铁、 TPTZ按10： 1： 1的比例混合制得工作液。 取0.5ml 70乙醇、 0.5ml奶渣多肽上清液、 9ml工作液混合于37下恒温培养10min， 得混合液； 以缓冲液为空白， 测其在593nm下的吸 光度值， 计算公式为： 0048 0049 式中： 0050 V1： 奶渣多肽酶解液(奶渣多肽上清液)总体积， ml； 0051 V2： 所测样品(酶解液混合液)体积， ml； 0052 m： 奶渣(奶渣指牦牛奶经过打酥油后， 残渣干燥后所得的奶渣)质量，。

18、 g。 0053 过氧化氢清除能力(H2O2)作用： 用蒸馏水配制0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)， 用缓冲溶液配制4mmol/L过氧化氢溶液、 4.5mmol/L苯酚红溶液， 用苯酚红溶液配制 300ug/ml HRPase得HRPase-苯酚红溶液。 取2ml奶渣多肽上清液与800ul过氧化氢溶液混 合， 室温培养20min， 以蒸馏水为对照， 再加入1200ul HRPase-苯酚红溶液室温培养10min， 用分光光度计在610nm下测吸光度值， 计算公式如下： 0054 0055 在本实施例中， 对三个不同海拔所得到的奶渣进行酶解与不酶解的上清液的DPPH 自由基清除能力、 超氧自由基清除能力、 羟基自由基清除能力、 铁离子还原抗氧化能力、 过 氧化氢清除活性进行测定。 结果表示， 三个不同海拔的奶渣均有抗氧化能力， 经过胃蛋白酶 +胰蛋白酶酶解后， 具有更强的抗氧化能力， 且将奶渣酶解与不酶解之间抗氧化能力存在显 著性差异， 见图1图5。 说明书 4/4 页 6 CN 112094880 A 6 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 7 CN 112094880 A 7 图4 图5 说明书附图 2/2 页 8 CN 112094880 A 8 。