利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011039169.X (22)申请日 2020.09.28 (71)申请人 广东永顺生物制药股份有限公司 地址 511356 广东省广州市黄埔区田园西 路35号广东永顺生物制药股份有限公 司 (72)发明人 杨傲冰陈坚史大庆穆光慧 胡美容王千菊郑铁锁侯高伟 孙彩宜陈金仙 (74)专利代理机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通合伙) 11498 代理人 王加岭 (51)Int.Cl. C12N 7/02(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A6。

2、1P 31/16(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活 疫苗的方法 (57)摘要 本发明通过对种毒稀释液进行改良， 在磷酸 缓冲液的基础上， 添加了特定比例的天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子， 实现了低免鸡胚中H7亚 型禽流感病毒的高效增殖， 其病毒增殖水平和制 备的疫苗的免疫效果与SPF鸡胚、 非免鸡胚生产 疫苗的水平基本接近， 然而有效的降低了生产成 本， 降低了生产门槛， 对于H7亚型禽流感疫苗的 生产具有积极的意义。 权利要求书2页 说明书6页 CN 112143714 A 2020.12.29 CN 11。

3、2143714 A 1.一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法， 所述方法是将H7亚型禽流感病毒 毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚， 接种后置3637继续孵育72-96小时， 收获活 胚的鸡胚液， 经离心、 浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液， 其特征在于， 所述种毒稀释液是 添加了天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。 2.一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法， 包括利用低免鸡胚生产 H7亚型禽流感病毒原液， 经灭活后， 向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型 禽流感病毒灭活疫苗， 所述利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液的方法， 所述方法是。

4、 将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚， 接种后置3637继续孵 育72-96小时， 收获活胚的鸡胚液， 经离心、 浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液， 其特征在 于， 所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL， ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL。 4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法， 其特征在于， 磷酸盐缓冲液按照如下方法 配制： 取NaCl 8.0g， KCl 0.2g， Na2HPO4 12H2O 2。

5、.9g， KH2PO4 0.2g， 将以上试剂依次溶解于 800mL双蒸馏水中， 边加边搅拌使其溶解， 然后用NaOH或HCl调节至pH 7.4， 最后加双蒸水至 1000mL， 灭菌备用。 5.根据权利要求3或4所述的方法， 所述种毒稀释液采用如下方法制备得到： 按照天冬 氨酸的浓度为1.5mg/mL， ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL的 浓度将天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合， 采用0.22 m的滤器过滤除 菌， 4下保存， 备用。 6.根据权利要求1或2所述的方法， 所述H7亚型禽流感病毒优选为H7N9亚型H7-Re2株。。

6、 7.根据权利要求1或2所述的方法， 所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子。 8.根据权利要求1或2所述的方法， 所述低免鸡胚中母源抗体含量3log2。 9.一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法， 其特征在于， 所述方法 包括如下步骤： 步骤一， 取H7亚型禽流感病毒毒种用权利要求5所述的种毒稀释液作10倍系列稀释， 取 10-4稀释度的病毒液， 尿囊腔内接种1011日龄低免鸡胚， 每胚0.1ml， 接种后置3637继 续孵育， 不必翻蛋； 步骤二， 鸡胚接种后， 每日照蛋2次， 将在24小时前死亡的鸡胚弃去， 24小时以后死亡的 鸡胚随时取出， 至72小时， 将活胚全部取出，。

7、 气室向上直立， 置于28冷库冷却1224小 时； 步骤三， 将冷却1224小时的鸡胚取出， 表面消毒后， 将其推入收获操作间， 采用全自 动收获机对活胚吸取鸡胚液， 每若干个鸡胚的胚液混合为一组， 在收获胚液的同时， 应逐个 检查鸡胚， 如胎儿腐败、 胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用； 步骤四， 收获后的胚液置于灭菌瓶中， 每组抽样测定血凝价， 血凝价应不低于1:256， 并 逐瓶抽样23ml留样， 收获的胚液灭活前置28保存， 应不超过3日； 步骤五， 将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后， 混合于一个浓缩罐内， 在无菌条件下 用灭菌的二级预过滤柱滤过， 除去病毒液的残渣和其他杂质， 再用。

8、超滤浓缩装置， 将病毒液 连续循环， 水分不断渗去， 浓缩至原体积的1/3， 完成病毒浓缩过程， 同时取样测定毒价， 其 权利要求书 1/2 页 2 CN 112143714 A 2 HA效价不低于1： 512； 步骤六， 采用甲醛灭活， 准确量取甲醛， 用注射用水配制成10%的甲醛溶液， 混合均匀， 然后往鸡胚液加入甲醛溶液， 随加随搅拌， 使其充分混合， 按抗原量计， 使甲醛最终浓度为 0.2%， 甲醛加入完毕后， 启动浓缩罐升温系统， 抗原温度达到37时， 将抗原倒到另一个已 灭菌的灭活罐内开始计时， 灭活24小时， 期间不停搅拌， 至灭活24小时， 取样做无菌检验和 灭活检验； 步骤七。

9、， 向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112143714 A 3 利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法 0001 技术领域： 本发明属于生物技术领域， 具体涉及利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的 方法。 0002 背景技术： 禽流感 （Avian Influenza） 是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染 病， 被OIE定为I类传染病， 其是以侵害呼吸系统为主的疾病， 常常导致家禽发病甚至死亡， 亦可感染哺乳动物和人。 2003年以来， 高致病性禽流感在我国和世界许多国家广泛流行， 给 养禽。

10、业造成巨大的经济损失， 同时， 威胁人类的健康。 目前对于禽流感的防控， 疫苗免疫接 种是最主要的预防手段。 0003 在禽流感疫苗生产中， 目前主要依靠鸡胚法， 通常采用SPF鸡胚或者非免鸡胚进行 培养， 但是SPF鸡饲养条件苛刻， SPF鸡胚成本相对较高， 非免疫鸡需要养殖场所处位于非疫 区， 且不能采用疫苗免疫， 常规的养殖场所难以达到非免疫的要求。 王志方等人研究表明， 禽流感病毒可以在含有一定量母源抗体的低免鸡胚中进行培养。 0004 发明内容： 本发明针对现有技术中H7亚型禽流感病毒灭活疫苗主要依赖SPF鸡胚或者非免鸡胚， 其生产成本高的问题， 旨在提供一种利用低免鸡胚生产H7亚型。

11、禽流感病毒灭活疫苗的方 法。 0005 为解决以上技术问题， 本发明采用如下技术方案： 一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法， 所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒 种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚， 接种后置3637继续孵育72-96小时， 收获活胚 的鸡胚液， 经离心、 浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液， 其特征在于， 所述种毒稀释液是添 加了天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。 0006 本发明还请求保护一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法， 包 括利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液， 经灭活后， 向灭活的病毒液中加矿物油佐剂 混合乳化制成H7亚。

12、型禽流感病毒灭活疫苗， 所述利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液 的方法， 所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚， 接种 后置3637继续孵育72-96小时， 收获活胚的鸡胚液， 经离心、 浓缩后得到H7亚型禽流感 病毒原液， 其特征在于， 所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子的磷酸 盐缓冲液。 0007 所述磷酸盐缓冲液按照如下方法配制： 取NaCl 8.0g， KCl 0.2g， Na2HPO4 12H2O 2.9g， KH2PO4 0.2g， 将以上试剂依次溶解于800mL双蒸馏水中， 边加边搅拌使其溶解， 然后用 NaOH或HCl调。

13、节至pH 7.4， 最后加双蒸水至1000mL， 灭菌备用。 0008 所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL， ZnCl2的质量百分比为0.05mg/ mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL。 0009 所述种毒稀释液采用如下方法制备得到： 按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL， ZnCl2 的质量百分比为0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、 ZnCl2和表皮 说明书 1/6 页 4 CN 112143714 A 4 生长因子与磷酸盐缓冲液混合， 采用0.22 m的滤器过滤除菌， 4下保存， 备用。 0010 所述H7亚型禽流感病毒优选为H7N9亚。

14、型H7-Re2株， 由中国农业科学哈尔滨兽医研 究所鉴定、 保管和供应， 本公司被授权生产。 0011 所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子 （rhEGF） ， 购自武汉艾美捷科技有限公 司， 产品货号为PRP100159。 0012 所述低免鸡胚中母源抗体含量3log2。 0013 本发明还请求保护一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法， 其 特征在于， 所述方法包括如下步骤： 步骤一， 取H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释， 取10-4稀释度的病 毒液， 尿囊腔内接种1011日龄低免鸡胚， 每胚0.1ml， 接种后置3637继续孵育， 不必翻 蛋； 步骤二， 。

15、鸡胚接种后， 每日照蛋2次， 将在24小时前死亡的鸡胚弃去， 24小时以后死亡的 鸡胚随时取出， 至72小时， 将活胚全部取出， 气室向上直立， 置于28冷库冷却1224小 时。 0014 步骤三， 将冷却1224小时的鸡胚取出， 表面消毒后， 将其推入收获操作间， 采用 全自动收获机对活胚吸取鸡胚液， 每若干个鸡胚的胚液混合为一组， 在收获胚液的同时， 应 逐个检查鸡胚， 如胎儿腐败、 胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用； 步骤四， 收获后的胚液置于灭菌瓶中， 每组抽样测定血凝价， 血凝价应不低于1:256， 并 逐瓶抽样23ml留样， 收获的胚液灭活前置28保存， 应不超过3日； 步骤五，。

16、 将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后， 混合于一个浓缩罐内， 在无菌条件下 用灭菌的二级预过滤柱滤过， 除去病毒液的残渣和其他杂质， 再用超滤浓缩装置， 将病毒液 连续循环， 水分不断渗去， 浓缩至原体积的1/3， 完成病毒浓缩过程， 同时取样测定毒价， 其 HA效价不低于1： 512； 步骤六， 采用甲醛灭活， 准确量取甲醛， 用注射用水配制成10%的甲醛溶液， 混合均匀， 然后往鸡胚液加入甲醛溶液， 随加随搅拌， 使其充分混合， 按抗原量计， 使甲醛最终浓度为 0.2%， 甲醛加入完毕后， 启动浓缩罐升温系统， 抗原温度达到37时， 将抗原倒到另一个已 灭菌的灭活罐内开始计时， 灭活24小。

17、时， 期间不停搅拌。 至灭活24小时， 取样做无菌检验和 灭活检验； 步骤七， 向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。 0015 基于以上技术方案， 本发明具有如下优点和有益效果： 本发明通过对种毒稀释液进行调整和优化， 以磷酸缓冲液为基础， 通过添加天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子， 实现了H7亚型禽流感病毒在低免鸡胚中的高效增殖， 采用所述方法 制备得到的疫苗， 其病毒含量、 HA效价以及免疫后HI抗体水平均达到非免鸡胚同样的生产 水平， 而低免鸡胚的价格低于非免鸡胚和SPF鸡胚， 该项技术的推广能够帮助企业降低生产 成本， 且能在一定程度上减少低免或非免。

18、鸡胚原料产量限制对于生产的约束。 0016 另外， 在本发明的种毒稀释液中首次添加了ZnCl2和表皮生长因子， 试验表明， 两 者的配合试验能够提高低免鸡胚接种后的活胚数量， 减少鸡胚的死亡， 另外， 单胚尿囊液的 收获量、 病毒含量相比磷酸缓冲液作为种毒稀释液得到了很大的提高， 病毒含量相比提高 了约12倍， 活胚数提高了9.1%， 平均单枚活胚收获量提高了12.01%， 其极大地提高了生产产 说明书 2/6 页 5 CN 112143714 A 5 出和生产效率。 并且， 单独提高ZnCl2或表皮生长因子水平， 其相应的技术效果相应下降， 也 就是说， 仅有在本发明限定的ZnCl2的浓度为。

19、0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL的情 况下， 才能取得最佳的培养结果。 以上试验表明， 在该种毒稀释液中， ZnCl2和表皮生长因子 在特定浓度比例下发挥了相互协同的作用， 不仅能够提高活胚比例， 减少死胚的发生， 而且 其也能促进尿囊液的增加以及尿囊液中病毒的增殖。 0017 综上所述， 本发明通过对种毒稀释液进行改良， 在磷酸缓冲液的基础上， 添加了特 定比例的天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子， 实现了低免鸡胚中H7亚型禽流感病毒的高效增 殖， 其病毒增殖水平和制备的疫苗的免疫效果与SPF鸡胚、 非免鸡胚生产疫苗的水平基本接 近， 然而有效的降低了生产成本， 降低了。

20、生产门槛， 对于H7亚型禽流感疫苗的生产具有积极 的意义。 0018 具体实施方式： 本发明所选用的种毒为H7N9亚型H7-Re2株， 由中国农业科学哈尔滨兽医研究所鉴定、 保管和供应， 所述种毒毒液的病毒含量为109.5EID50/0.1mL， HA效价为10log2。 0019 实施例1： 种毒稀释液对低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的影响 本公司在研发中发现， 天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子对于鸡胚的生长以及鸡胚中病 毒的增殖存在一定的影响， 为了得到最合适的种毒稀释液， 以提高低免鸡胚中病毒的增殖 效果， 本公司优化了天冬氨酸、 ZnCl2和表皮生长因子的添加量， 通过前期研发， 。

21、发现天冬氨 酸最合适的浓度为1.5 mg/mL， 因此， 本发明中进一步对ZnCl2和表皮生长因子及其用量进 行了进一步的优化试验， 具体试验设计如下： H7亚型禽流感病毒的培养方法， 将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后， 10-4 稀释度的病毒液接种于鸡胚， 接种后置37继续孵育72小时， 收获活胚的鸡胚液， 经离心后 取上清液， 即为H7亚型禽流感病毒培养液。 0020 在收获过程中记录活胚数、 尿囊液总收获量， 并测定病毒培养液的EID50 值。 0021 试验设计中， 选取低免活鸡胚 （母源抗体含量3log2） 600枚， SPF活鸡胚100枚。 0022 试验分为7组， 其中。

22、组1-6为低免鸡胚组， 每组采用100枚低免活鸡胚， 组5位实验 组， 采用本发明优化后的种毒稀释液； 组6位空白对照组， 采用磷酸盐缓冲液作为种毒稀释 液； 组7为SPF对照组， 分别采用磷酸盐缓冲液作为种毒稀释液， 接种鸡胚为SPF活鸡胚。 组1- 4为对照试验组。 试验过程中， 种毒及稀释度、 接种方式、 孵育条件等均相同， 区别仅在于种 毒稀释液的组成。 具体种毒稀释液的试验设计参见以下表1。 0023 表1 种毒稀释液组成对H7亚型禽流感病毒增殖的影响试验设计 说明书 3/6 页 6 CN 112143714 A 6 通过对收获的鸡胚进行检验， 分别记录活胚数、 尿囊液总收获量， 并。

23、测定病毒培养液的 EID50 值。 具体试验结果见下表2。 0024 表2 鸡胚收获和病毒增殖生产情况 基于以上表2的试验结果可知， 试验组5 （种毒稀释液组成为天冬氨酸的浓度为1.5mg/ mL， ZnCl2的浓度为0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL） 的活胚数达到96枚， 其平均收 获量为14.64mL/枚， 病毒含量为108.64EID50/0.1mL， 均高于空白对照组6和对照试验组1-4， 经测定， 组5的病毒含量相比空白对照组6提高了约12倍， 且其活胚数提高了9.1%， 平均单枚 活胚收获量提高了12.01%； 其达到常规SPF活鸡胚中同样的增殖水平， 甚至略高。

24、， 如平均收 获量高于组7的13.95mL。 通过组5和组1、 组2的比较可知， 单独添加ZnCl2或者表皮生长因子 均不能保证鸡胚的存活率、 单胚的收获量， 且病毒含量低； 虽然组3和组4中均添加了ZnCl2 和表皮生长因子， 其中组3中的ZnCl2浓度远高于本发明最优的水平， 组4中过量添加了表皮 生长因子， 尽管其取得了优于空白对照组6的活胚数和平均收获量， 但是， 相比而言， 仅有在 本发明限定的ZnCl2的浓度为0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL的情况下， 才能取得 最佳的培养结果。 以上试验表明， 在该种毒稀释液中， ZnCl2和表皮生长因子在特定浓度比 例下发挥。

25、了相互协同的作用， 不仅能够提高活胚比例， 减少死胚的发生， 而且其也能促进尿 囊液的增加以及尿囊液中病毒的增殖， 这在先前报道和现有文献中均不曾报道。 并且， 通过 比较可知， 本发明的低免鸡胚增殖方法的病毒培养效果接近SPF鸡胚常规培养方式， 然而， 低免鸡胚的成本大大低于SPF鸡胚， 其能为企业节约大量的成本。 0025 实施例2： 利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法 说明书 4/6 页 7 CN 112143714 A 7 步骤一， 取H7亚型禽流感病毒H7-Re2株毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释， 取10-4稀 释度的病毒液， 尿囊腔内接种1011日龄低免鸡胚， 每胚。

26、0.1ml， 接种后置37继续孵育， 不 必翻蛋； 步骤二， 鸡胚接种后， 每日照蛋2次， 将在24小时前死亡的鸡胚弃去， 24小时以后死亡的 鸡胚随时取出， 至72小时， 将活胚全部取出， 气室向上直立， 置于28冷库冷却12小时。 0026 步骤三， 将冷却12小时的鸡胚取出， 表面消毒后， 将其推入收获操作间， 采用全自 动收获机对活胚吸取鸡胚液， 每若干个鸡胚的胚液混合为一组， 在收获胚液的同时， 应逐个 检查鸡胚， 如胎儿腐败、 胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用； 步骤四， 收获后的胚液置于灭菌瓶中， 每组抽样测定血凝价， 血凝价应不低于1:256， 并 逐瓶抽样23ml留样， 收。

27、获的胚液灭活前置28保存， 应不超过3日； 步骤五， 将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后， 混合于一个浓缩罐内， 在无菌条件下 用灭菌的二级预过滤柱滤过， 除去病毒液的残渣和其他杂质， 再用超滤浓缩装置， 将病毒液 连续循环， 水分不断渗去， 浓缩至原体积的1/3， 完成病毒浓缩过程， 同时取样测定毒价， 其 HA效价不低于1:512； 步骤六， 采用甲醛灭活， 准确量取甲醛， 用注射用水配制成10%的甲醛溶液， 混合均匀， 然后往鸡胚液加入甲醛溶液， 随加随搅拌， 使其充分混合， 按抗原量计， 使甲醛最终浓度为 0.2%， 甲醛加入完毕后， 启动浓缩罐升温系统， 抗原温度达到37时， 将抗原。

28、倒到另一个已 灭菌的灭活罐内开始计时， 灭活24小时， 期间不停搅拌。 至灭活24小时， 取样做无菌检验和 灭活检验； 步骤七， 向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。 0027 所述种毒稀释液采用如下方法制备得到： 按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL， ZnCl2 的质量百分比为0.05mg/mL， 表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、 ZnCl2和表皮 生长因子与磷酸盐缓冲液混合， 采用0.22 m的滤器过滤除菌， 4下保存， 备用。 0028 发明人还采用以上同样的方法， 将同批次的种毒采用磷酸盐缓冲液稀释后接种非 免鸡胚制备得到灭活疫苗， 其。

29、生产过程与以上方法的差异仅在于鸡胚为非免鸡胚， 种毒稀 释液为磷酸盐缓冲溶液， 将其作为对照组。 同时， 还设置了空白对照组， 其是将同批次的种 毒采用磷酸盐缓冲液稀释后接种同批次的低免鸡胚制备得到灭活疫苗， 其生产过程与以上 方法的差异仅在于种毒稀释液为磷酸盐缓冲溶液。 0029 以上试验组、 对照组和空白对照组所涉及的活鸡胚数均为200枚。 0030 在试验过程中， 分别测定了步骤四中收获的胚液、 步骤五中经浓缩后的胚液中的 HA效价和EID50。 具体结果见下表3。 0031 表3 浓缩前后的胚液HA效价和EID50 基于以上试验结果可知， 采用本发明的疫苗生产方法， 其所生产的疫苗原液。

30、中的抗原 说明书 5/6 页 8 CN 112143714 A 8 水平达到了常规采用非免鸡胚生产的工艺， 而当单独采用低免鸡胚进行接种时， 其抗原HA 水平达不到本公司相关的生产标准， 即浓缩后的HA效价不低于1:512。 0032 对于制备的疫苗， 通过接种试验对本发明的低免鸡胚制备的疫苗 （本发明的种毒 缓冲液） 以及以上采用非免鸡胚制备得到的疫苗进行了免疫效力比对。 0033 取21日龄的SPF鸡30只， 随机分为3组， 其中组1接种本发明的低免鸡胚制备的疫苗 （本发明的种毒缓冲液） ， 组2接种采用非免鸡胚制备得到的疫苗， 组3为对照组， 注射等量的 生理盐水， 接种量为0.3mL/羽。 免疫21天后采血检测HI抗体， 经测定， 组1中低免鸡胚制苗试 验组的HI抗体效价HI均值为10.3， 组2中采用非免鸡胚制备疫苗组的HI抗体效价HI均值为 10.2， 空白对照组3中经检测， 其呈现HI抗体阴性。 以上试验结果表明， 采用低免鸡胚制备得 到的疫苗， 其免疫性能与采用非免鸡胚制备得到疫苗的免疫性能基本一致。 说明书 6/6 页 9 CN 112143714 A 9 。