水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1、分子标记及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011224993.2 (22)申请日 2020.11.05 (71)申请人 中国科学院合肥物质科学研究院 地址 230031 安徽省合肥市蜀山区蜀山湖 路350号 (72)发明人 叶亚峰陶亮之刘斌美任艳 吴跃进 (74)专利代理机构 合肥市浩智运专利代理事务 所(普通合伙) 34124 代理人 叶濛濛 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(200。

2、6.01) (54)发明名称 水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1、 分子标 记及其应用 (57)摘要 本发明公开水稻抗草铵膦除草剂突变基因 GLR1， 涉及生物技术领域， 突变基因GLR1定位在 水稻第6号染色体上， 位于分子标记FSR28与 FM064之间610.7kb的区段内， 本发明还提供上 述水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1的分子标 记及应用。 本发明的有益效果在于： 本发明中的 水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1为辅助选育 抗草铵膦除草剂水稻新品种提供便捷， 从而最终 达到省时、 省工、 省力有效清除稻田杂草、 增产增 收的目的， 同时为该基因的克隆以及功能解析打 下基础。 权利要。

3、求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 112143740 A 2020.12.29 CN 112143740 A 1.一种水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1， 其特征在于： 所述突变基因GLR1定位在水 稻第6号染色体上， 位于分子标记FSR28与FM06-4之间610.7kb的区段内。 2.根据权利要求1所述的水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1， 其特征在于： 所述FSR28 的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示， 所述FM06-4的上下游引物分别如 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 3.根据权利要求1所述的水稻抗草铵膦除草剂突。

4、变基因GLR1， 其特征在于： 所述突变基 因GLR1与分子标记FM06-14和FM06-15共分离， 所述FM06-14的上下游引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示， 所述FM06-15的上下游引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所 示。 4.一种根据权利要求1所述的突变基因GLR1的分子标记， 其特征在于： 所述分子标记包 括紧密连锁的分子标记， 所述紧密连锁的分子标记包括FSR28和FM06-4， 所述突变基因GLR1 位于分子标记FSR28和FM06-4之间的610.7kb的区域内； 所述FSR28的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和S。

5、EQ ID NO.2所示； 所述FM06-4的上下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 5.根据权利要求4所述的突变基因GLR1的分子标记， 其特征在于： 所述分子标记还包括 共分离的分子标记， 所述共分离的分子标记包括FM06-14和FM06-15； 所述FM06-14的上下游引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示； 所述FM06-15的上下游引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。 6.一种采用权利要求1所述的突变基因GLR1在抗草铵膦除草剂水稻培育中的应用。 7.一种采用权利要求4所述的突变基因GLR1的分子标记在抗。

6、草铵膦除草剂水稻培育、 辅助选育中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112143740 A 2 水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1、 分子标记及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1、 分 子标记及其应用。 背景技术 0002 水稻作为世界上主要的粮食作物之一， 其总产量占世界粮食总产量的1/4， 全球一 半以上的人口以水稻为主食。 水稻在生产过程中农田杂草(例如： 千金子， 稗草等)问题成为 影响其产量的主要因素之一。 由于人工除草的耗时耗力， 而且不便于农业集约化生产， 严重 制约了农作物种植向高产、 优质和低成本方向。

7、的发展进程。 随着水稻直播栽培技术的快速 发展和应用， 稻田除草剂以其省时、 省工、 省力的优点得到大面积推广。 草铵膦属于膦酸类 除草剂， 能够抑制植物氮代谢途径中的谷氨酰胺合成酶， 从而干扰植物的代谢， 使植物死 亡。 草铵膦具有杀草谱广、 低毒、 活性高和环境相容性好等特点， 应用前景广阔。 0003 草铵膦对现有的水稻品种也同样具有灭杀作用， 虽然可以通过转基因技术转入吸 水链霉菌(S .hygroscopicus)的菌株中分离得到的Bar基因和绿色产色链霉菌 (S.viridochromogenes)的菌株分离得到的Pat基因(这两个基因具有80的同源性)， 使水 稻表达草铵膦乙酰化。

8、酶， 使进入水稻体内的草铵膦失活， 降低草铵膦对水稻的危害， 从而起 到抗草铵膦除草剂的效果。 如申请人为拜尔生物科学股份有限公司、 公开号为CN1335886A 的专利公开一种草铵膦耐受性稻， 在稻基因组特定位点存在CaMV35S启动子控制下的bar基 因。 0004 但基于转基因品种商业化复杂的申报程序以及人们对转基因稻米安全性的担忧， 现阶段很难在生产上得到推广应用， 而且抗草铵膦除草剂转基因水稻品种在我国推广应用 还受到国外专利的限制。 0005 因此， 创建非转基因抗草铵膦除草剂种质资源， 定位克隆抗草铵膦除草剂基因， 并 选育抗草铵膦除草剂水稻新品种， 对促进我国的水稻生产具有重大。

9、意义。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的草铵膦抗性基因的应用依赖转基 因技术， 提供一种非转基因抗草铵膦突变基因GLR1、 分子标记及其应用。 0007 本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的： 0008 一种水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1， 所述突变基因GLR1定位在水稻第6号染 色体上， 位于分子标记FSR28与FM06-4之间610.7kb的区段内。 0009 有益效果： 本发明定位的水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1为辅助选育抗草铵膦 除草剂水稻新品种提供便捷， 从而最终达到省时、 省工、 省力有效清除稻田杂草、 增产增收 的目的， 同时为该基因的。

10、克隆以及功能解析打下基础。 0010 优选地， 所述FSR28的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示， 所述 FM06-4的上下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 说明书 1/5 页 3 CN 112143740 A 3 0011 优选地， 所述突变基因GLR1与分子标记FM06-14和FM06-15共分离， 所述FM06-14的 上下游引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示， 所述FM06-15的上下游引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。 0012 本发明还提供上述水稻抗草铵膦除草剂突。

11、变基因GLR1的分子标记， 所述分子标记 包括紧密连锁的分子标记， 所述紧密连锁的分子标记包括FSR28和FM06-4， 所述突变基因 GLR1位于分子标记FSR28和FM06-4之间的610.7kb的区域内； 0013 所述FSR28的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示； 0014 所述FM06-4的上下游引物分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 0015 优选地， 所述分子标记还包括共分离的分子标记， 所述共分离的分子标记包括 FM06-14和FM06-15； 0016 所述FM06-14的上下游引物分别如SEQ ID NO.5和SEQ。

12、 ID NO.6所示； 0017 所述FM06-15的上下游引物分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。 0018 有益效果： 本发明中的水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1定位在一个610.7kb的 染色体片段内， 并与分子标记FM06-14和FM06-15共分离， 和分子标记FSR28和FM06-4紧密连 锁。 GLR1基因的鉴定为培育更多的抗草铵膦除草剂水稻品种提供新的基因资源。 FSR28， FM06-4， FM06-14和FM06-15等分子标记的开发可以高效准确的对glr1进行筛选， 从而提高 以glr1为草铵膦除草剂抗性基因的抗草铵膦除草剂水稻品种的培育效率。 0。

13、019 本发明还提供上述水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1在抗草铵膦除草剂水稻培 育中的应用。 0020 本发明还提供上述水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1的分子标记在抗草铵膦除 草剂水稻培育、 辅助选育中的应用。 0021 有益效果： 本发明所述的共分离分子标记所扩增的产物在大部分籼稻品种中与金 粳818或glr1突变体间具有多态性， 即共分离分子标记扩增产物在籼稻与金粳818或glr1突 变体具有大小差异， 因此可以利用这一特征， 将glr1突变体中的突变后的草铵膦除草剂抗 性基因GLR1导入到大部分籼稻中， 培育籼型的抗草铵膦除草剂的水稻新品种。 0022 本发明的优点在于： 0023 。

14、(1)本发明获得并定位到了一个新的抗草铵膦除草剂基因， 为培育更多的抗草铵 膦除草剂水稻品种提供新的基因资源。 0024 (2)glr1突变体由物理诱变得来， 可以直接应用于抗草铵膦除草剂水稻新品种的 选育， 为现有的主栽品种导入抗草铵膦除草剂基因， 具有巨大的经济价值， 为辅助选育抗草 铵膦除草剂水稻新品种提供便捷， 从而最终达到省时、 省工、 省力有效清除稻田杂草、 增产 增收的目的， 同时为该基因的克隆以及功能解析打下基础。 0025 (3)本发明发现的分子标记FSR28、 FM06-4、 FM06-14和FM06-15与GLR1基因的共分 离或紧密连锁， 为检测或鉴定glr1基因提供了。

15、科学有效的方法。 附图说明 0026 图1为本发明实施例1中抗草铵膦除草剂突变体筛选过程及结果； 0027 图2为本发明实施例1中草铵膦除草剂处理野生型和glr1突变体的比较图； 0028 图3为本发明实施例2中GLR1基因定位图； 说明书 2/5 页 4 CN 112143740 A 4 0029 图4为本发明实施例2中分子标记FSR28的连锁图； 0030 图5为本发明实施例2中分子标记FM06-4的连锁图； 0031 图6为本发明实施例2中分子标记FM06-14的连锁图； 0032 图7为本发明实施例2中分子标记FM06-15的连锁图； 0033 图8为本发明实施例3中glr1突变体与其。

16、他水稻品种之间多态性检测结果图。 具体实施方式 0034 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例是本发明一部 分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出 创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0035 下述实施例中所用的试验材料和试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0036 实施例中未注明具体技术或条件者， 均可以按照本领域内的文献所描述的技术或 条件或者按照产品说明书进行。 0037 实施例1 。

17、0038 水稻抗草铵膦除草剂突变体glr1的表型与遗传分析 0039 (1)glr1突变体的筛选 0040 2018年4月用重离子12C6+诱变(能量80MeV， 剂量120Gy)诱变粳稻品种金粳818品种 获得M0代种子。 诱变后的种子种植于中国科学院合肥物质科学研究院试验田， 成熟后单株 收种， 获得约5000份的M1代种子。 将M1代种子在海南省三亚市南繁试验田进行直播， 苗龄在 三叶期时， 用草铵膦除草剂进行喷施处理， 一周后， 进行第二次草铵膦除草剂喷施处理， 一 月后， 如图1所示， 发现5株存活的植株， 将其分别命名为glr1-glr5， 并选取glr1突变体进行 后续深入研究。。

18、 0041 (2)glr1突变体的表型分析 0042 为进一步验证glr1突变体的遗传稳定性， 与其野生型金粳818同时播种， 苗龄在三 叶期时对其进行草铵膦除草剂处理， 经过一周的恢复期， 再进行第二次草铵膦除草剂喷施 处理， 两周后观察野生型金粳818与glr1突变体的存活及生长情况。 结果如图2， 显示glr1突 变体的存活率以及生长量明显比野生型金粳818要高。 因此可以推断glr1突变体具有明显 的草铵膦除草剂耐受性， 并且能够稳定遗传。 0043 (3)glr1突变体的遗传分析 0044 为进一步研究glr1突变体的抗草铵膦除草剂的分子机制， 首先对其进行遗传分 析。 利用glr1。

19、突变体与野生型金粳818杂交构建回交群体， 在120株F2代的分离群体中， 通过 草铵膦除草剂的喷施处理， 其中存活28株， 死亡92株， 存活与死亡株数分离比符合1:3( 2 1:30.180.05)， 利用glr1突变体与籼稻品种93-11进行杂交， 在200株 的F2代分离群体中， 通过草铵膦除草剂的喷施处理， 其中存活53株， 死亡147株， 存活与死亡 株数分离比同样符合1:3( 21:30.240.05)。 上述结果表明glr1突变体 的抗草铵膦除草剂的性状受一对单基因隐性控制， 并且不受遗传背景的影响。 0045 实施例2 0046 水稻抗草铵膦除草剂基因GLR1的基因定位 说明。

20、书 3/5 页 5 CN 112143740 A 5 0047 (1)定位群体的构建 0048 利用glr1突变体与籼稻93-11， 华粳籼74， 五山丝苗等品种进行杂交， 分别获得的 不同杂交组合的F1代自交获得分离群体的种子， 将这些种子进行田间直播， 三叶期时进行 草铵膦除草剂喷施处理， 选取存活的单株作为定位单株。 每个单株取100mg左右的叶片， 用 来提取DNA。 0049 (2)简单重复序列(SSR， Simple Sequence Repeat)多态性筛选 0050 利用已报道的均匀分布水稻12条染色体上的SSR引物对glr1突变体和籼稻93-11 进行多态性筛选， 获得具有多。

21、态性的SSR引物进行下一步实验。 0051 (3)GLR1基因的初步定位 0052 首先选用glr1突变体和籼稻93-11构建的分离群体中存活单株中的随机21株进行 GLR1基因的初步定位。 选用筛选获得的具有多态性的SSR引物对这21个单株进行连锁分析。 结果发现在第6号染色体长臂端上的分子标记FSR20、 FSR22、 FSR25和FSR32， 与突变基因有 明显的连锁， 如图3所示， 图中Recombinants表示重组子， 进一步分析表明GLR1基因位于 FSR25与FSR32之间(图3A)， 该区间大约7.03Mb范围。 0053 (4)GLR1基因的精细定位 0054 为进一步缩小。

22、GLR1基因的定位区间， 在FSR25与FSR32分子标记之间寻找更多的具 有多态性的引物， GLR1基因定位所用引物序列如表1所示， 并扩大定位群体数量， 对更大的 定位群体进行连锁分析， 如图3所示， 图中Recombinants表示重组子， 最终将GLR1基因精细 定位在Indel标记FSR28和FM06-4之间(图3B， 图4， 图5)， 大约610.7Kb的区段内， 并且与其中 分子标记FM06-14和FM06-15共分离(图6， 图7)。 本发明通过图位克隆的方法， 将草铵膦除草 剂抗性基因GLR1精细定位在第6号染色体长臂上的两个标记FSR28和FM06-4之间610.7kb的 。

23、区域内， 该区域内含有一个水稻抗草铵膦除草剂基因GLR1。 0055 表1实施例2中用到的引物序列 0056 0057 本发明将一个新的水稻草铵膦除草剂抗性基因GLR1定位在一个610.7kb的染色体 片段内， 并与分子标记FM06-14和FM06-15共分离， 和分子标记FSR28和FM06-4紧密连锁。 GLR1基因的鉴定为培育更多的抗草铵膦除草剂水稻品种提供新的基因资源。 FSR28， FM06- 4， FM06-14和FM06-15等分子标记的开发可以高效准确的对glr1进行筛选， 从而提高以glr1 为草铵膦除草剂抗性基因的抗草铵膦除草剂水稻品种的培育效率。 0058 实施例3 00。

24、59 分子标记FSR28， FM06-4， FM06-14和FM06-15在不同品种中的多态性 0060 为了验证FSR28， FM06-4， FM06-14和FM06-15四个标记在指示glr1突变体抗草铵膦 说明书 4/5 页 6 CN 112143740 A 6 除草剂表型上的特异性， 本发明分析了在多个品种中四个标记的多态性。 这些品种包括两 系不育系1892S， 新安S， 312S， 三系不育系93-11B， 常规品种金粳818， 中嘉早17， 五山丝苗， 93-11， 华粳籼74， 武运粳7号。 0061 glr1突变体与这些品种的杂种F1均不表现出抗草铵膦除草剂特性。 图8显示，。

25、 四个 分子标记除了glr1与金粳818和武运粳7号没有多态性外， 与其他的品种均有多态性。 表明 这四个分子标记表现出与大部分籼稻品种的多态性， 说明这4个标记可以在大部分籼稻品 种中特异性标记glr1的抗草铵膦除草剂的表型。 0062 本发明所述的共分离分子标记所扩增的产物在大部分籼稻品种中与金粳818或 glr1突变体间具有多态性， 即共分离分子标记扩增产物在籼稻与金粳818或glr1突变体具 有大小差异， 因此可以利用这一特征， 将glr1突变体中的突变后的草铵膦除草剂抗性基因 GLR1导入到大部分籼稻中， 培育籼型的抗草铵膦除草剂的水稻新品种。 0063 实施例4 0064 利用gl。

26、r1突变体转育新的抗草铵膦除草剂品种 0065 用glr1突变体与正常的受体， 如93-11， 五山丝苗， 1892S等， 进行杂交， 回交和自 交， 并在此过程中用分子标记进行GLR1基因和遗传背景选择， 最终获得93-11， 五山丝苗， 1892S等背景下带有纯合GLR1突变基因的抗草铵膦除草剂的新品种。 具体实施步骤如下： 0066 (1)以受体亲本， 如93-11， 五山丝苗， 1892S等， 为父本与glr1杂交获得F1。 0067 (2)以F1为母本与受体亲本， 如93-11， 五山丝苗， 1892S等， 回交获得BC1F1。 0068 (3)种植BC1F1， 分别使用引物序列如S。

27、EQ ID NO.2-3或SEQ ID NO.4-5或SEQ ID NO.6-7或SEQ ID NO.8-9的引物检测glr1基因型， 选择glr1杂合基因型， 即以上四对引物 PCR扩增产物的条带均为双带。 0069 (4)使用水稻12对染色体上分布均匀的(包括但不限于SSR、 SNP、 InDel、 EST、 RFLP、 AFLP、 RAPD、 SCAR类型标记)， 且在glr1突变体和轮回亲本之间存在多态性的分子标记， 对步 骤(3)中选出的单株进行遗传背景鉴定， 选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于75)的 植株。 0070 (5)用步骤4中选出的植株与受体亲本， 如93-11， 五山。

28、丝苗， 1892S等， 回交获得 BC2F1。 0071 (6)种植BC2F1， 重复步骤(3)和步骤(4)， 选出glr1基因型杂合， 遗传背景回复率高 (如大于95)的植株， 收自交种BC2F2。 0072 (7)种植BC2F2， 重复步骤(3)和步骤(4)， 选出glr1基因型杂合， 遗传背景纯合率最 高的植株， 收取BC2F3。 BC2F3后代中分离的glr1纯合株即含GLR1基因的抗草铵膦除草剂的 品系。 0073 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前述各实施 例所记载的。

29、技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或者 替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。 说明书 5/5 页 7 CN 112143740 A 7 SEQUENCE LISTING 中国科学院合肥物质科学研究院 水稻抗草铵膦除草剂突变基因GLR1、 分子标记及其应用 中国科学院合肥物质科学研究院 8 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 aaacgagaac caaccgacac 20 2 20 DNA 人工序列 2 ggagggagga atgggtacac 20 3 20 DNA 人工序列 3 a。

30、attgcacac agggttcaca 20 4 20 DNA 人工序列 4 gtgcaagcgt ttacaatccc 20 5 20 DNA 人工序列 5 ccttggtagt taagggtgag 20 6 20 序列表 1/2 页 8 CN 112143740 A 8 DNA 人工序列 6 ccgcaaagca tttgcccggc 20 7 20 DNA 人工序列 7 ccgcaaagca tttgcccggc 20 8 21 DNA 人工序列 8 gtgagtgatc catatcctct c 21 序列表 2/2 页 9 CN 112143740 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 10 CN 112143740 A 10 图4 图5 图6 图7 说明书附图 2/3 页 11 CN 112143740 A 11 图8 说明书附图 3/3 页 12 CN 112143740 A 12 。