高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010638123.3 (22)申请日 2020.07.06 (71)申请人 曲阜师范大学 地址 273165 山东省济宁市曲阜市静轩西 路57号 (72)发明人 赵峰董梅 (74)专利代理机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 代理人 朱红星 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 15/78(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/90(2006.01) C12P 19/44(2006.01) G。

2、01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种高产单鼠李糖脂的基因 改造方法， 其特征在于： 根据铜绿假单胞菌的 rhlC基因序列设计PCR引物， PCR产物纯化后克隆 到pMD系列T simple载体中构建pMDrhlC， 酶切 rhlC基因序列内部， 构建目标基因内部序列缺失 的质粒pMD rhlC， 通过双酶切将 rhlC片段插 入到质粒pK18mobSacB中构建打靶质粒pK18 rhlC， 导入铜绿假单胞菌内， 经筛选压力。

3、作用发 生二次同源重组， 获得敲除rhlC基因的铜绿假单 胞菌敲除株， 敲除菌株发酵验证产生的单鼠李糖 脂。 本发明在鼠李糖脂的发酵生产和开发利用方 面具有应用价值。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 111849846 A 2020.10.30 CN 111849846 A 1.一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法， 其特征在于该方法是以铜绿假单胞菌为出发 菌株， 以催化单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶 （RhlC） 的编码基因rhlC为改 造目标， 且按如下步骤进行： 1） 根据铜绿假单胞菌的rhlC基因序列设计PCR引物； 所设计的铜绿假单胞菌的rhlC基 因的。

4、PCR引物为C-f ： 5 -CCGAAGCTTATGAGCGGCCTGTTCCACT-3 ， C-r: 5 - CTTGGAATTCCCGGAAGCTACGGACG-3， 上下游引物中分别引入在rhlC基因序列中没有、 且在 pK18mobSacB的多克隆位点 （MCS） 中含有的酶切位点 （引物中划线部分） ， Hind 和EcoR ； 2） 以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板， PCR扩增rhlC基因， 克隆到pMD系列载体中， 构建 重组质粒pMD-rhlC； 3） 根据rhlC基因序列内部特有的酶切位点， 酶切rhlC基因序列内部， 纯化自连， 构建 rhlC基因内部序列缺失的新质粒p。

5、MD- rhlC； 4） 通过双酶切方法将 rhlC片段插入到质粒pK18mobSacB中构建打靶质粒pK18- rhlC； 5） 打把质粒pK18- rhlC导入到铜绿假单胞菌内， 在筛选压力作用下， 质粒pK18- rhlC与铜绿假单胞菌染色体基因发生二次同源重组， 获得敲除rhlC基因的铜绿假单胞菌敲 除菌株； 6） 铜绿假单胞菌敲除菌株发酵生产验证， 利用HPLC-MS方法验证单鼠李糖脂产物， 利用 排油圈法测定单鼠李糖脂产量。 2.权利要求1所述的方法， 其中步骤2） ： PCR扩增rhlC基因的反应体系： 10PCR Buffer 2.5 L， 2.5mM 的dNTP Mixtur。

6、e 2 L， 10m的C-f和C-r引物各0.8 L， Extaq Polymerase 0.125 L， 铜绿假单胞菌基因组DNA 1 L， 补充PCR水至总体系25 L； 反应条件： 95预变性 3min， 35个循环： 94变性1min、 56退火30s、 72延伸1min30s， 72 10min； PCR产物经 1.2%琼脂糖电泳、 试剂盒切胶纯化后， rhlC基因片段与pMD系列 （18/19/20） T simple载体 进行AT连接， 构建重组质粒pMD-rhlC。 3.权利要求1所述的方法， 其中步骤3） ： 利用限制性内切酶Sal 试剂盒酶切质粒pMD- rhlC的rhlC。

7、基因内部序列， 酶切产物经1.2%琼脂糖电泳、 试剂盒切胶纯化后， 自连， 得到 rhlC基因内部缺失400500bp序列的新质粒pMD- rhlC。 4.权利要求1所述的方法， 其中步骤4） ： 利用限制性内切酶Hind 和EcoR 试剂盒， 双 酶切质粒pMD- rhlC和铜绿假单胞菌的自杀性质粒pK18mobSacB， rhlC片段和 pK18mobSacB质粒的双酶切产物经1.2%琼脂糖电泳、 试剂盒切胶纯化后， 连接， 构建打靶质 粒pK18- rhlC。 5.权利要求1所述的方法， 其中步骤5） ： 打把质粒pK18- rhlC先转化到大肠杆菌S17-1 感受态细胞中， 构建重组大。

8、肠杆菌 S17-1 (pK18- rhlC)， 再通过接合转移方法将质粒 pK18- rhlC导入到铜绿假单胞菌内； 在氨苄青霉素、 卡那霉素和蔗糖的筛选压力作用下质 粒pK18- rhlC与铜绿假单胞菌染色体rhlC基因的同源序列发生二次同源重组， 缺失内部 序列的 rhlC基因片段替换掉染色体上的rhlC基因， 筛选获得rhlC基因被破坏的铜绿假单 胞菌敲除菌株。 6.权利要求1所述的方法， 其中步骤6） ： 铜绿假单胞菌敲除菌株经摇瓶发酵410天； 收 集0.21L无菌体发酵上清液， 利用0.63L的乙酸乙酯萃取发酵液中鼠李糖脂产物， 提取物 权利要求书 1/2 页 2 CN 11184。

9、9846 A 2 溶解于10%乙腈水中， 鼠李糖脂浓度3001000mg/L， 样品经0.45 m有机滤膜过滤； HPLC-MS的 相关参数： 进样量 5 L， 乙腈水溶液线性梯度洗脱 （10%乙腈水1min， 乙腈的体积分数30min 内从10%升到60%， 60%乙腈 20min， 乙腈的体积分数5min内由60%降到10%） ， 0.6mL/min流 速， 流出物经1:1分流后进入质谱系统， 离子源温度120， 负离子模式检测， 质谱扫描范围 501000m/z； 取10 L的稀释10100倍的发酵液滴在油膜上， 根据排油圈直径与鼠李糖脂浓 度的线性关系和发酵液的稀释倍数计算单鼠李糖脂产。

10、量。 7.权利要求1所述高产单鼠李糖脂的基因改造方法在铜绿假单胞菌的基因改造和鼠李 糖脂的生产、 开发利用方面的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111849846 A 3 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域和鼠李糖脂生产应用领域， 具体为用于铜绿假单胞 菌高产单鼠李糖脂的基因改造方法， 解决了现有方法通过异源表达rhlAB基因合成单鼠李 糖脂产量低和从常规鼠李糖脂产物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐等技术问题， 为单鼠李 糖脂的应用与研究奠定基础。 背景技术 0002 鼠李糖脂是主要由铜绿假单胞菌代谢合成的一种生物表面活性剂， 因其表。

11、/界面 活性高、 安全无毒、 临界胶束浓度低、 可生物降解、 稳定性高等优势， 广泛应用于石油开采、 环境污染修复、 医药、 食品、 农业生防控制、 堆肥等领域。 鼠李糖脂是一系列同系物， 由1到2 个鼠李糖基和1到2个饱和或不饱和的不同碳链长度的脂肪酸链组成。 据报道已发现的不同 结构的鼠李糖脂分子有近60种。 0003 根据鼠李糖脂分子中鼠李糖基的个数多少， 将鼠李糖脂分为单鼠李糖脂和双鼠李 糖脂。 鼠李糖脂所含鼠李糖基的个数必然影响其理化活性， 即单鼠李糖脂和双鼠李糖脂存 在活性差异， 应用潜力也不同。 研究表明单鼠李糖脂与双鼠李糖脂相比具有更好的亲油特 性和乳化活性。 这使得单鼠李糖脂。

12、在提高疏水性有机污染物的生物可利用性、 乳化携带驱 油、 石油乳化降粘等方面具有很大的应用优势。 因此， 单鼠李糖脂的生产制备具有重要应用 价值。 0004 现有技术方法通过将铜绿假单胞菌中合成单鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶 （RhlAB） 的编码基因rhlAB在大肠杆菌等宿主中异源表达， 虽然可以实现单鼠李糖脂的合 成， 但是单鼠李糖脂产量很低， 约几百毫克每升。 从野生型铜绿假单胞菌的鼠李糖脂产物中 提取分离单鼠李糖脂操作繁琐、 费时费力。 如果敲除铜绿假单胞菌中催化单鼠李糖脂合成 双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶 （RhlC） 的编码基因rhlC， 将会使鼠李糖脂合成途径终止在 单鼠李糖脂， 将能。

13、够解决上述瓶颈问题。 本发明以敲除rhlC基因的铜绿假单胞菌为生产菌， 既实现了合成的鼠李糖脂全部为单鼠李糖脂， 又实现了高产单鼠李糖脂， 为单鼠李糖脂的 应用与研究奠定了基础。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种用于铜绿假单胞菌高产单鼠李糖脂的基因改造方法， 有利于解决现有方法通过异源表达rhlAB基因合成单鼠李糖脂产量低和从常规鼠李糖脂产 物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐等技术问题， 为单鼠李糖脂的应用与研究奠定基础。 采 用该方法可以定向、 高效地构建高产单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌工程菌。 0006 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为： 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法， 该。

14、方法是以铜绿假单胞菌为出发菌株， 以催化 单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶 （RhlC） 的编码基因rhlC为改造目标； 包括 以下主要步骤： 1） 根据铜绿假单胞菌的rhlC基因序列设计PCR引物； 2） 以铜绿假单胞菌基因 说明书 1/6 页 4 CN 111849846 A 4 组DNA为模板， PCR扩增rhlC基因， 克隆到pMD系列载体中， 构建重组质粒pMD-rhlC； 3） 根据 rhlC基因序列内部特有的酶切位点， 酶切rhlC基因序列内部， 纯化自连， 构建rhlC基因内部 序列缺失的新质粒pMD- rhlC； 4） 通过双酶切方法将 rhlC片段插入到质粒pK18。

15、mobSacB 中构建打靶质粒pK18- rhlC； 5） 打把质粒pK18- rhlC导入到铜绿假单胞菌内， 在筛选压 力作用下， 质粒pK18- rhlC与铜绿假单胞菌染色体基因发生二次同源重组， 获得敲除rhlC 基因的铜绿假单胞菌敲除菌株； 6） 铜绿假单胞菌敲除菌株发酵生产验证， 利用HPLC-MS方法 验证单鼠李糖脂产物， 利用排油圈法测定单鼠李糖脂产量。 0007 步骤1） 所设计的铜绿假单胞菌的rhlC基因的PCR引物为C-f和C-r， 引物序列如下 C-f： 5-CCGAAGCTTATGAGCGGCCTGTTCCACT-3， SEQ ID NO:1 C-r: 5-CTTGGA。

16、ATTCCCGGAAGCTACGGACG-3 SEQ ID NO:2 上下游引物中分别引入在rhlC基因序列中没有、 且在pK18mobSacB的多克隆位点 （MCS） 中含有的酶切位点 （引物中划线部分） ， Hind 和EcoR 。 0008 步骤2） PCR扩增rhlC基因的反应体系： 10PCR Buffer 2.5 L， 2.5mM 的dNTP Mixture 2 L， 10m的C-f和C-r引物各0.8 L， Extaq Polymerase 0.125 L， 铜绿假单胞菌 基因组DNA 1 L， 补充PCR水至总体系25 L； 反应条件： 95预变性3min， 35个循环： 94。

17、变性 1min、 56退火30s、 72延伸1min30s， 72 10min； PCR产物经1.2%琼脂糖电泳、 试剂盒切 胶纯化后， rhlC基因片段与pMD系列 （18/19/20） T simple载体进行AT连接， 构建重组质粒 pMD-rhlC。 0009 步骤3） 利用限制性内切酶Sal 试剂盒酶切质粒pMD-rhlC的rhlC基因内部序列， 酶切产物经1.2%琼脂糖电泳、 试剂盒切胶纯化后， 自连， 得到rhlC基因内部缺失400500bp 序列的新质粒pMD- rhlC。 0010 步骤4） 利用限制性内切酶Hind 和EcoR 试剂盒， 双酶切质粒pMD- rhlC和铜 绿。

18、假单胞菌的自杀性质粒pK18mobSacB， rhlC片段和pK18mobSacB质粒的双酶切产物经 1.2%琼脂糖电泳、 试剂盒切胶纯化后， 连接， 构建打靶质粒pK18- rhlC。 0011 步骤5） 打把质粒pK18- rhlC先转化到大肠杆菌S17-1感受态细胞中， 构建重组大 肠杆菌 S17-1 (pK18- rhlC)， 再通过接合转移方法将质粒pK18- rhlC导入到铜绿假单 胞菌内； 在氨苄青霉素、 卡那霉素和蔗糖的筛选压力作用下质粒pK18- rhlC与铜绿假单胞 菌染色体rhlC基因的同源序列发生二次同源重组， 缺失内部序列的 rhlC基因片段替换掉 染色体上的rhlC。

19、基因， 筛选获得rhlC基因被破坏的铜绿假单胞菌敲除菌株。 0012 步骤6） 铜绿假单胞菌敲除菌株经摇瓶发酵410天； 收集0.21L无菌体发酵上清 液， 利用0.63L的乙酸乙酯萃取发酵液中鼠李糖脂产物， 提取物溶解于10%乙腈水中， 鼠李 糖脂浓度3001000mg/L， 样品经0.45 m有机滤膜过滤； HPLC-MS的相关参数： 进样量 5 L， 乙 腈水溶液线性梯度洗脱 （10%乙腈水1min， 乙腈的体积分数30min内从10%升到60%， 60%乙腈 20min， 乙腈的体积分数5min内由60%降到10%） ， 0.6mL/min流速， 流出物经1:1分流后进入质 谱系统， 。

20、离子源温度120， 负离子模式检测， 质谱扫描范围501000m/z。 取10 L的稀释10 100倍的发酵液滴在油膜上， 根据排油圈直径与鼠李糖脂浓度的线性关系和发酵液的稀释 倍数计算单鼠李糖脂产量。 0013 发酵培养基配方为甘油3060g， NaNO3 36g， 酵母粉0.51.5g， KH2PO4 35g， K2HPO4 35g， MgSO4 0.41.0 g， 氯化钠 0.52g去离子水1L。 培养温度3040、 转速160 说明书 2/6 页 5 CN 111849846 A 5 220rpm。 0014 本发明进一步公开了用于高产单鼠李糖脂的基因改造方法在铜绿假单胞菌的基 因改造。

21、和鼠李糖脂的生产、 开发利用方面的应用， 实验结果显示： 本发明方法能够定向改造 铜绿假单胞菌菌株， 改造效率高、 目标明确； 利用本发明方法改造的铜绿假单胞菌敲除菌株 合成的鼠李糖脂产物全部为单鼠李糖脂， 并且产量高。 0015 本发明主要解决了通过现有方法异源表达铜绿假单胞菌rhlAB基因合成单鼠李糖 脂产量很低， 从常规鼠李糖脂产物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐、 费时费力等问题。 本发 明以铜绿假单胞菌为出发菌株， 以催化单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶 （RhlC） 的编码基因rhlC为改造目标， 获得鼠李糖脂产物全部为单鼠李糖脂的铜绿假单胞菌 敲除菌株， 主要的难点在于含rh。

22、lC基因上下游同源序列打靶质粒的构建。 0016 本发明公开的一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法的有益效果在于： 利用该方法改造铜绿假单胞菌， 目标性强、 改造效率高、 工程菌稳定性好； 利用本发明 方法构建的铜绿假单胞菌敲除菌株， 在不影响鼠李糖脂产量的同时， 还能使合成的鼠李糖 脂产物全部为单鼠李糖脂， 从而实现高产单鼠李糖脂， 为单鼠李糖脂的研究与应用奠定方 法基础。 附图说明 0017 图1为实施例2中铜绿假单胞菌敲除菌株的鼠李糖脂产物HPLC-MS分析结果； 图中出现的鼠李糖脂产物色谱峰信息如下表所示： 图2为实施例3中不同基因工程菌的单鼠李糖脂产量。 具体实施方式 0018 结合下述。

23、具体实施例对本发明进行详细的说明， 使本领域的普通技术人员更全面 的理解本发明， 但不以任何方式限制本发明。 在如下实施例中， 如无特殊说明， 所用的材料 和试剂均可从生化试剂材料公司购买到。 0019 实施例1 本实施例中用于构建rhlC基因敲除的铜绿假单胞菌工程菌的培养基如下： 液体LB培养基： 蛋白胨10g， 酵母粉 5g， NaCl 10g， 去离子水1L， pH 7.0。 0020 LB琼脂培养基： 蛋白胨10g， 酵母粉 5g， NaCl 10g， 琼脂18 g， 去离子水1L， pH 7.0。 说明书 3/6 页 6 CN 111849846 A 6 0021 1） 铜绿假单胞菌。

24、的rhlC基因的PCR引物设计 从NCBI数据库中下载铜绿假单胞菌的rhlC基因序列， Genbank序列号分别为： AE004091.2， CP000438.1， CP002496.1。 根据下载的铜绿假单胞菌rhlC基因序列， 利用 Primer Premier 5软件设计rhlC基因的PCR引物， 所设计的铜绿假单胞菌rhlC基因的PCR引 物序列如下C-f： 5-CCGAAGCTTATGAGCGGCCTGTTCCACT-3， SEQ ID NO:1 C-r: 5-CTTGGAATTCCCGGAAGCTACGGACG-3， SEQ ID NO:2 上下游引物中分别引入在rhlC基因序列中。

25、没有、 且在pK18mobSacB的多克隆位点 （MCS） 中含有的酶切位点 （引物中划线部分） ， Hind 和EcoR 。 0022 2） PCR扩增rhlC基因 取10mL的LB液体培养基在37、 180rpm条件下培养鼠李糖脂高产菌株铜绿假单胞菌 SG， 培养12h后， 取2mL培养液离心 （10,000rpm， 2min） 收集菌体， 利用细菌基因组提取试剂盒 提取铜绿假单胞菌SG的基因组DNA。 以铜绿假单胞菌SG的基因组DNA为模板， PCR扩增rhlC基 因。 反应体系： 10PCR Buffer 2.5 L， 2.5mM 的dNTP Mixture 2 L， 10m的C-f和。

26、C-r引物 各0.8 L， Extaq Polymerase 0.125 L， 铜绿假单胞菌SG基因组DNA 1 L， 补充PCR水至总体 系25 L； 反应条件： 95预变性3min， 35个循环： 94变性1min、 56退火30s、 72延伸 1min30s， 72 10min。 0023 3） 构建重组质粒pMD-rhlC PCR产物经1.2%琼脂糖电泳后， 利用凝胶纯化试剂盒切胶纯化rhlC基因片段； 利用 Extaq聚合酶PCR扩增后rhlC基因片段上的末端A碱基与pMD19-T simple载体末端的T碱基 进行AT连接； 连接液42热激60s转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 转。

27、化液涂布含100mg/L氨 苄青霉素的LB琼脂培养基平板， 37培养18h； 挑取阳性转化子接种到10mL含100mg/L氨苄 青霉素的LB液体培养基中， 在37、 180rpm条件下培养12h， 取4mL培养液离心 （10,000rpm， 2min） 收集菌体， 利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pMD-rhlC。 0024 4） 构建rhlC基因内部序列缺失的新质粒pMD- rhlC 经序列分析rhlC基因内部存在2个Sal 酶切位点， 利用限制性内切酶Sal 试剂盒酶 切质粒pMD-rhlC， 从rhlC基因内部切下493bp的序列， 酶切后的pMD-rhlC片段经1.2%琼脂糖 电泳后， 。

28、利用凝胶纯化试剂盒切胶纯化pMD-rhlC酶切片段， 利用T4 DNA连接酶使pMD-rhlC 酶切片段自连， 构建rhlC基因内部缺失493bp序列的新质粒pMD- rhlC； 连接液42热激 60s转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 转化液涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基平 板， 37培养18h； 挑取阳性转化子接种到10mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中， 在 37、 180rpm条件下培养12h， 取4mL培养液离心 （10,000rpm， 2min） 收集菌体， 利用质粒提取 试剂盒提取重组质粒pMD- rhlC。 0025 5） 构建打靶质粒pK18- r。

29、hlC 利用限制性内切酶Hind 和EcoR 试剂盒， 双酶切质粒pMD- rhlC和铜绿假单胞菌 的自杀性质粒pK18mobSacB， rhlC片段和pK18mobSacB质粒的双酶切产物经1.2%琼脂糖电 泳后， 利用凝胶纯化试剂盒切胶纯化， 利用T4 DNA连接酶连接纯化片段， 构建打靶质粒 pK18- rhlC； 连接液42热激60s转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 转化液涂布含100mg/L氨 苄青霉素的LB琼脂培养基平板， 37培养18h； 挑取阳性转化子接种到10mL含50mg/L卡那霉 素的LB液体培养基中， 在37、 180rpm条件下培养12h， 取4mL培养液离心 （10。

30、,000rpm， 2min） 说明书 4/6 页 7 CN 111849846 A 7 收集菌体， 利用质粒提取试剂盒提取重组质粒pK18- rhlC。 0026 6） 打把质粒pK18- rhlC导入到铜绿假单胞菌, 筛选敲除rhlC基因的铜绿假单胞 菌敲除菌株 打把质粒pK18- rhlC先42热激60s转化到大肠杆菌S17-1感受态细胞中， 转化液涂 布含50mg/L卡那霉素的LB琼脂培养基平板， 37培养18h， 筛选重组大肠杆菌 S17-1 (pK18- rhlC)； 将重组大肠杆菌 S17-1 (pK18- rhlC)与铜绿假单胞菌菌悬液以1:2比例 混合， 混合液转移到LB琼脂培。

31、养基中37培养12h， 以接合转移方法将质粒pK18- rhlC导 入到铜绿假单胞菌内； 刮取平板上的菌苔至1mL的LB液体培养基中， 稀释5倍， 取150 L稀释 液涂布含100mg/L氨苄青霉素和350mg/L卡那霉素的双抗LB琼脂平板， 37培养24h； 挑取阳 性克隆10个， 利用rhlC基因引物进行菌落PCR验证， 反应体系和反应条件同“本实施例的 2)” 中所述， 筛选得到单交换子菌株； 制备单交换子菌悬液稀释106倍， 取稀释液150 L涂布 含100mg/L氨苄青霉素和50g/L蔗糖的LB琼脂平板， 37培养24h， 利用质粒pK18- rhlC上 的蔗糖SacB基因筛选压力，。

32、 诱导发生二次重组； 挑取阳性克隆10个， 利用rhlC基因引物进行 菌落PCR验证， 筛选敲除掉rhlC基因的铜绿假单胞菌敲除菌株SG rhlC。 结果充分显示了本 发明作为改造铜绿假单胞菌rhlC基因方法的高效性和可行性。 0027 实施例2 应用本发明实施例1中的铜绿假单胞菌敲除菌株SG rhlC为发酵菌株， 本实施例中所 用的培养基如下： 液体LB培养基： 蛋白胨10g， 酵母粉 5g， NaCl 10g， 去离子水1L， pH 7.0。 0028 发酵培养基： 甘油45g， NaNO3 3g， 酵母粉1g， KH2PO4 3g， K2HPO4 3 g， MgSO4 0.5 g， 氯化。

33、钠 1g， 去离子水1L， pH 6.8。 0029 取铜绿假单胞菌敲除菌株SG rhlC接种到10mL的LB液体培养基在37、 180rpm条 件下培养12h制备种子液， 取种子液1mL接种到含有120mL发酵培养基的三角瓶中， 设置5个 平行实验， 在37、 180rpm条件下培养5d。 0030 收集600mL的发酵液10,000rpm离心10min， 去除菌体细胞， 利用2mol/L的HCl溶液 调整上清液pH至2.0； 利用等体积 （600mL） 乙酸乙酯萃取上清液3次， 收集有机相置于真空旋 转蒸发仪 （50,60rpm） 中， 得到浅黄色粘稠物体即为发酵液中鼠李糖脂的提取物。 0。

34、031 鼠李糖脂提取物溶解于10%乙腈水中， 鼠李糖脂浓度500mg/L， 样品经0.45 m有机 滤膜过滤后进行HPLC-MS分析。 HPLC-MS的相关参数： 进样量 5 L， 乙腈水溶液线性梯度洗脱 （10%乙腈水1min， 乙腈的体积分数30min内从10%升到60%， 60%乙腈 20min， 乙腈的体积分 数5min内由60%降到10%） ， 0.6mL/min流速， 流出物经1:1分流后进入质谱系统， 离子源温度 120， 负离子模式检测， 质谱扫描范围501000m/z。 HPLC-MS分析的结果如图1所示。 0032 实施例2的结果 （图1） 表明， 铜绿假单胞菌敲除菌株SG。

35、 rhlC发酵生产的鼠李糖脂 产物全部为单鼠李糖脂。 结果充分显示了本发明作为铜绿假单胞菌生产单鼠李糖脂的基因 改造方法的可靠性。 0033 实施例3 比较不同基因工程菌株的单鼠李糖脂产量， 本实施例中所用的培养基如下： 液体LB培养基： 蛋白胨10g， 酵母粉 5g， NaCl 10g， 去离子水1L， pH 7.0。 0034 发酵培养基： 甘油45g， NaNO3 3g， 酵母粉1g， KH2PO4 3g， K2HPO4 3 g， MgSO4 0.5 g， 说明书 5/6 页 8 CN 111849846 A 8 氯化钠 1g， 去离子水1L， pH 6.8。 0035 取合成单鼠李糖脂。

36、的3种基因工程菌， 大肠杆菌DH5 (pBBR1-2rhl)、 施氏假单胞 菌DNB (pBBR1-2rhl)、 铜绿假单胞菌SG rhlC的甘油管菌种， 分别接种到10mL的LB液体培 养基中， 在37、 180rpm条件下培养12h制备种子液， 分别取种子液1mL接种到含有120mL发 酵培养基的三角瓶中， 每株菌发酵实验设置3个平行， 在37、 180rpm条件下培养5d。 分别从 各个三角瓶中取2mL发酵液10,000rpm离心5min， 去除菌体细胞； 铜绿假单胞菌SG rhlC的 发酵液上清稀释32倍， 大肠杆菌DH5 (pBBR1-2rhl)和施氏假单胞菌DNB (pBBR1-2。

37、rhl) 的 发酵液上清不做稀释处理。 0036 取直径为90mm的培养皿放到毫米坐标纸上， 加入30ml 蒸馏水， 再在培养皿中水面 的中央滴20 l 的粘度为20 mPas原油， 在水面上形成一层油膜； 取10 l 的上述发酵液上 清样品溶液滴到油膜中央， 记录排油圈直径。 根据排油圈直径 （y, mm） 与单鼠李糖脂浓度 （x, mg/L） 的线性关系 （y=0.0632x+4.6484, R2=0.9939） 和发酵液的稀释倍数计算单鼠李 糖脂产量， 结果如图2所示， 利用本发明方法改造的铜绿假单胞菌SG rhlC的单鼠李糖脂产 量达到15g/L， 远超过铜绿假单胞菌rhlAB基因异源。

38、表达的2株基因工程菌。 0037 实施例3的结果 （如图2） 表明， 利用本发明方法改造rhlC基因的铜绿假单胞菌SG rhlC能够高产单鼠李糖脂， 有效解决了现有方法异源表达铜绿假单胞菌rhlAB基因合成单 鼠李糖脂产量低的技术问题。 实施例3结果证明了本发明作为铜绿假单胞菌高产单鼠李糖 脂的基因改造方法的可靠性和实用性。 说明书 6/6 页 9 CN 111849846 A 9 SEQUENCE LISTING 曲阜师范大学 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用 2 PatentIn version 3.5 1 28 DNA 人工序列 1 ccgaagctta tgagcggcct gttccact 28 2 26 DNA 人工序列 2 cttggaattc ccggaagcta cggacg 26 序列表 1/1 页 10 CN 111849846 A 10 图1 图2 说明书附图 1/1 页 11 CN 111849846 A 11 。