药用植物活性化合物生物合成基因SNP位点的鉴定方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010939258.3 (22)申请日 2020.09.09 (71)申请人 深圳市兰科植物保护研究中心 地址 518000 广东省深圳市罗湖区东湖街 道望桐路889号 (72)发明人 王志才王美娜陈建兵赵美丽 崔洪秋张佳莹 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 44281 代理人 周建军郭燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 药用植物活性化合物生物合成基因SNP位。

2、点 的鉴定方法 (57)摘要 本发明提供一种药用植物活性化合物生物 合成基因单核苷酸多态性(SNP)位点的鉴定方 法， 包括： 参考序列获取步骤， 包括获取目标化合 物的生物合成相关基因的参考序列； 测序步骤， 包括根据所述参考序列设计用于扩增目的基因 的特异性引物， 从取自生物体的样本中扩增获得 可生物合成所述目标化合物的目的基因， 测序得 到基因序列； 比对步骤， 包括将所述参考序列与 测序得到的所述基因序列进行比对， 找出候选单 核苷酸多态性位点。 本发明建立了一种基于扩增 子序列快速获取及鉴定SNP位点的方法， 能够快 速准确鉴定SNP位点， 能够针对任何代谢途径中 的多种基因进行针对。

3、性的SNP位点开发。 权利要求书2页 说明书9页 序列表5页 附图3页 CN 111876521 A 2020.11.03 CN 111876521 A 1.一种药用植物活性化合物生物合成基因单核苷酸多态性位点的鉴定方法， 其特征在 于， 包括： 参考序列获取步骤， 包括获取目标化合物的生物合成相关基因的参考序列； 测序步骤， 包括根据所述参考序列设计用于扩增目的基因的特异性引物， 从取自生物 体的样本中扩增获得可生物合成所述目标化合物的目的基因， 测序得到基因序列； 比对步骤， 包括将所述参考序列与测序得到的所述基因序列进行比对， 找出候选单核 苷酸多态性位点。 2.如权利要求1所述的鉴定方。

4、法， 其特征在于， 所述测序步骤中， 测序方法包括Sanger 法。 3.如权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述比对步骤中， 对比分析候选单核苷 酸多态性位点突变对应的氨基酸序列变化。 4.如权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述参考序列获取步骤中， 从数据库获 取所述参考序列； 任选地， 所述数据库包括GeneBank数据库、 EMBL数据库、 DDBJ数据库。 5.如权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述目标化合物选自石斛碱、 石斛酚、 石 斛多糖、 类黄酮、 丹参酮、 青蒿素、 长春新碱中的至少一种； 任选地， 所述生物体选自药用植物、 药食同源植物中的至少一种。

5、； 任选地， 所述药用植物选自石斛、 白芨、 天麻、 青蒿、 党参、 何首乌中的至少一种。 6.如权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述测序步骤中， 以样品的cDNA为模板， 扩增获得目的基因产物； 任选地， 扩增获得所述基因产物后， 分离纯化， 获得目的基因产物； 任选地， 将所述目的基因产物连接至载体， 然后转化至感受态细胞， 进行抗性筛选， 获 得阳性菌落； 任选地， 以所述阳性菌落为模板， 使用引物进行菌落鉴定， 挑取阳性菌进行测序， 得到 所述基因序列； 任选地， 所述引物为载体通用引物； 任选地， 所述引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物含有如SEQ ID NO.13。

6、所示 序列， 所述下游引物含有如SEQ ID NO.14所示序列； 任选地， 所述菌落的鉴定方法为PCR鉴定； 任选地， 菌落鉴定后， 挑取阳性菌培养， 对培养所得的阳性菌进行测序； 任选地， 测序方法包括Sanger法。 7.如权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 还包括验证步骤， 使用目的基因的特异 性引物， 以样品的cDNA为模板进行扩增， 对扩增产物进行测序， 然后将所得序列与所述参考 序列进行序列比对， 验证候选单核苷酸多态性位点是否真实存在； 任选地， 去除比对步骤中存在而验证步骤中比对后不存在的单核苷酸多态性位点， 留 下的单核苷酸多态性位点即为真实存在的单核苷酸多态性位点。。

7、 8.如权利要求1所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述目标化合物包括石斛碱； 任选地， 所述目标化合物的生物合成相关基因包括： 乙酰CoA酰基转移酶基因、 2-C-甲 基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因、 细胞色素氧化酶基因、 甲羟戊酸激酶基因中的至少 权利要求书 1/2 页 2 CN 111876521 A 2 一种； 任选地， 所述目标化合物的生物合成相关基因的参考序列在Gene Bank数据库中的编 号为LOC110096518、 KP860080.1、 LOC110116548、 LOC110113415中的至少一种； 任选地， 所述目标化合物的生物合成相关基因的参考序列为SEQ 。

8、ID NO.9SEQ ID NO.12中的至少一种； 任选地， 所述AACT基因的上游引物包含SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列； 任选地， 所述AACT基因的下游引物包含SEQ ID NO.2所示序列或其互补序列； 任选地， 所述MCT基因的上游引物包含SEQ ID NO.3所示序列或其互补序列； 任选地， 所述MCT基因的下游引物包含SEQ ID NO.4所示序列或其互补序列； 任选地， 所述CYP94C1基因的上游引物包含SEQ ID NO.5所示序列或其互补序列； 任选地， 所述CYP94C1基因的下游引物包含SEQ ID NO.6所示序列或其互补序列； 任选地， 所述MK基因。

9、的上游引物包含SEQ ID NO.7所示序列或其互补序列； 任选地， 所述MK基因的下游引物包含SEQ ID NO.8所示序列或其互补序列。 9.一种基因组合在石斛碱生物合成基因单核苷酸多态性位点鉴定中的应用， 所述基因 组合含有乙酰CoA酰基转移酶基因、 2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因、 细胞色素 氧化酶基因、 甲羟戊酸激酶基因中的至少一种。 10.一种引物组合在石斛碱生物合成基因单核苷酸多态性位点鉴定中的应用， 所述引 物组合含有SEQ ID NO.1SEQ ID NO.8所示序列或其互补序列中的至少一种。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111876521 A 3 药。

10、用植物活性化合物生物合成基因SNP位点的鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及单核苷酸多态性位点鉴定技术领域， 具体涉及药用植物活性化合物生 物合成基因SNP位点的鉴定方法。 背景技术 0002 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism， SNP)是一种新型的分子遗 传标记， 是指基因组序列上单个碱基变异(主要包括转换、 颠换)引起的DNA序列多态性， 在 作物品种鉴定等方面有广泛应用。 与第一代分子标记(如限制性片段长度多态性RFLP)、 第 二代分子标记(如简单重复序列区间标记ISSR)相比， SNP标记具有诸多优点， 如操作相对简 单方便、 位于基因。

11、组上的多态性位点丰富、 利于自动化， 稳定性和可靠性更高等。 目前主要 通过公共数据库序列比对和测序两种常用的方法进行SNP的位点鉴定。 在部分药用植物完 成基因组测序前， SNP可以基于公共数据中的表达序列标签EST序列比对出来。 虽然基于公 共数据库较容易获得大量的SNP， 但根据不同筛选阈值和条件得到的SNP标记存在差异， 在 后期有效的SNP位点验证时工作量较大。 测序法的具体应用主要包括基于二代测序技术和 三代测序技术的全基因组测序和高通量测序进行序列比对， 开发大规模的SNP位点。 除了测 序成本较高外， 所开发的SNP位点是遍在的， 大都与化合物特定理化特性不对应， 因而不具 有。

12、针对性。 发明内容 0003 本发明主要解决的技术问题是如何提高SNP位点鉴定的准确性， 减少SNP位点鉴定 的工作量， 降低SNP鉴定成本。 0004 根据第一方面， 一种实施例中提供一种药用植物活性化合物生物合成基因单核苷 酸多态性位点的鉴定方法， 包括： 0005 参考序列获取步骤， 包括获取目标化合物的生物合成相关基因的参考序列； 0006 测序步骤， 包括根据所述参考序列设计用于扩增目的基因的特异性引物， 从取自 生物体的样本中扩增获得可生物合成所述目标化合物的目的基因， 测序得到基因序列； 0007 比对步骤， 包括将所述参考序列与测序得到的所述基因序列进行比对， 找出候选 单核苷。

13、酸多态性位点。 0008 根据第二方面， 一种实施例中提供一种基因组合在石斛碱生物合成基因单核苷酸 多态性位点鉴定中的应用， 所述基因组合含有乙酰CoA酰基转移酶(AACT)基因、 2-C-甲基- D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶(MCT)基因、 细胞色素氧化酶(CYP94C1)基因、 甲羟戊酸激酶 (MK)基因中的至少一种。 0009 根据第三方面， 一种实施例中提供一种引物组合在石斛碱生物合成基因单核苷酸 多态性位点鉴定中的应用， 所述引物组合含有SEQ ID NO.1SEQ ID NO.8所示序列或其互 补序列中的至少一种。 0010 在一实施例中， 通过扩增子测序， 实现对特定基因的SN。

14、P位点进行鉴定。 说明书 1/9 页 4 CN 111876521 A 4 0011 在一实施例中， 通过设计特异性引物对特定基因的SNP位点进行鉴定， 准确率更 高， 更有针对性。 附图说明 0012 图1显示为铁皮石斛总RNA提取结果图。 0013 图2显示为石斛碱生物合成相关基因PCR扩增结果图。 0014 图3显示为菌落PCR鉴定阳性克隆结果图。 0015 图4显示为AACT的SNP位点及对应的氨基酸变化图。 0016 图5显示为CYP94C1的SNP位点及对应的氨基酸变化图。 0017 图6显示为MCT的SNP位点及对应的氨基酸变化图。 0018 图7显示为MK的SNP位点及对应的氨。

15、基酸变化图。 具体实施方式 0019 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。 其中不同实施方式 中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。 在以下的实施方式中， 很多细节描述是为了 使得本申请能被更好的理解。 然而， 本领域技术人员可以毫不费力的认识到， 其中部分特征 在不同情况下是可以省略的， 或者可以由其他元件、 材料、 方法所替代。 在某些情况下， 本申 请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述， 这是为了避免本申请的核心部分被过 多的描述所淹没， 而对于本领域技术人员而言， 详细描述这些相关操作并不是必要的， 他们 根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了。

16、解相关操作。 0020 另外， 说明书中所描述的特点、 操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各 种实施方式。 同时， 方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易 见的方式进行顺序调换或调整。 因此， 说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一 个实施例， 并不意味着是必须的顺序， 除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。 0021 在一些实施例中， 基于扩增子序列的SNP开发可依据已知基因、 EST序列、 基因组序 列或直系/旁系同源序列设计引物对目标片段进行PCR扩增， 进一步地， 可采用成本较低的 一代Sanger测序比对获得SNP位点。 一代Sanger测序的优点是。

17、SNP开发的准确率高， 成本相 对于二代和三代测序更低， 也可以鉴别单倍型和区分直系/旁系同源序列的SNP。 即使在目 标物种没有完成基因组测序或没有可用的EST序列的情况下， 依然可以选取目标性状相关 联的同源物种对应的代谢路径相关基因进行针对性的SNP开发， 因而适用范围更为广泛， 且 针对性强。 目前一代Sanger测序在药用植物， 尤其是药用兰花石斛属植物中的SNP位点开发 研究还未见报道。 0022 本文中， 除非另有说明， 药用植物， 是指医学上用于防病、 治病的植物。 其植株的全 部或一部分供药用或作为制药工业的原料。 广义而言， 可包括用作营养剂、 某些嗜好品、 调 味品、 色。

18、素添加剂， 及农药和兽医用药的植物资源。 药用植物种类繁多， 其药用部分各不相 同， 全部入药的， 如： 益母草、 夏枯草等； 部分入药的， 如： 人参、 曼陀罗、 原珍向天果、 射干、 桔 梗、 满山红等； 需提炼后入药的， 如： 金鸡纳霜等。 0023 本文中， 除非另有说明， 活性化合物， 也称之为生物活性物质或生理活性物质， 即 具有生物活性的化合物， 是指对生命现象具有影响的物质， 包括但不限于多糖、 萜类、 甾醇 说明书 2/9 页 5 CN 111876521 A 5 类、 生物碱、 肽类、 核酸、 蛋白质、 氨基酸、 甙类、 油脂、 蜡、 树脂类、 植物色素、 矿物质元素、 酶。

19、 和维生素等等。 0024 本文中， 除非另有说明， 药用植物活性化合物是指来源于药用植物的活性化合物。 0025 本文中， SNP是一种新型的分子遗传标记， 是指基因组序列上单个碱基变异(主要 包括转换、 颠换)引起的DNA序列多态性， 在植物品种鉴定等方面有广泛应用。 0026 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism， 简称SNP)主要是指在基因 组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 它是生物体可遗传的变异中最常 见的一种。 SNP在生物基因组中广泛存在。 SNP是一种二态的标记， 由单个碱基的转换或颠换 所引起， 也可由碱基的插入或缺。

20、失所致。 SNP既可能在基因序列内， 也可能在基因以外的非 编码序列上。 0027 在一些实施例中， 提供药用植物活性化合物生物合成基因SNP位点的鉴定方法及 其应用， 以及基于SNP位点的石斛种质资源鉴定方法。 0028 第一方面， 在一些实施例中， 本发明提供的药用植物活性化合物生物合成基因单 核苷酸多态性位点的鉴定方法包括： 0029 参考序列获取步骤， 包括获取目标化合物的生物合成相关基因的参考序列； 0030 测序步骤， 包括根据所述参考序列设计用于扩增目的基因的特异性引物， 从取自 生物体的样本中扩增获得可生物合成所述目标化合物的目的基因， 测序得到基因序列； 0031 比对步骤，。

21、 包括将所述参考序列与测序得到的所述基因序列进行比对， 找出候选 单核苷酸多态性位点。 0032 测序步骤中， 通过设计特异性引物， 针对性地扩增目的基因， 后续开发的SNP位点 与化合物特定理化特性相对应， 针对性强， 也即是说， 可以针对性地开发活性化合物生物合 成代谢途径相关SNP位点。 本方法在药用植物种质资源鉴定等方面具有良好的应用前景。 0033 在一些实施例中， 比对步骤中， 可将测序得到的所述基因序列与数据库中的已知 参考序列进行比对， 找出候选单核苷酸多态性位点。 0034 在一些实施例中， 比对步骤中， 还可以将测序得到的序列与从待鉴定的多个类似 研究对象中获得的参考序列互。

22、为对照， 找出候选单核苷酸多态性位点。 0035 在一些实施例中， 对于已完成基因组测序的研究对象， 可以直接从数据库查询获 取相关基因参考序列， 进而设计基因特异性引物进行PCR扩增； 对于未完成基因组测序但有 可用的EST序列(表达序列标签)的研究对象， 可以通过EST序列设计基因特异性引物， 扩增 得到参考序列； 对于无任何可用基因序列的研究对象， 可以根据近缘物种同源基因序列设 计简并引物， 扩增得到参考序列。 0036 在一些实施例中， 测序步骤中， 测序方法包括Sanger法。 Sanger法又称一代测序 法， 相对于循环阵列合成测序法(二代测序)、 直接测序法(三代测序)， Sa。

23、nger法测序使得 SNP鉴定的准确性更高， 显著降低后续SNP位点筛选的工作量， 成本比二代、 三代测序更低， 也可以鉴别单倍型， 区分直系/旁系同源序列的SNP。 0037 在一些实施例中， 生物合成基因可以是药用植物活性化合物的生物合成关键基 因。 0038 在一些实施例中， 比对步骤中， 对比分析候选单核苷酸多态性位点突变对应的氨 基酸序列变化。 说明书 3/9 页 6 CN 111876521 A 6 0039 在一些实施例中， 参考序列获取步骤中， 从数据库获取参考序列。 0040 在一些实施例中， 数据库包括但不限于GeneBank数据库(来源于NCBI， National Ce。

24、nter for Biotechnology Information， 美国国家生物技术信息中心)、 EMBL数据库(欧 洲EMBL-DNA数据库)、 DDBJ数据库(日本DNA数据库， DNA Data Bank of Japan)、 Ensembl数 据库、 TAIR数据库等等。 0041 在一些实施例中， 目标化合物包括但不限于药用植物活性化合物。 0042 在一优选的实施例中， 目标化合物包括但不限于石斛碱、 石斛酚、 石斛多糖、 类黄 酮、 丹参酮、 青蒿素、 长春新碱等中的至少一种。 0043 在一些实施例中， 生物体包括但不限于药用植物、 药食同源植物等中的至少一种。 0044 。

25、在一些实施例中， 药用植物包括但不限于石斛、 白芨、 天麻、 青蒿、 党参、 何首乌等 中的至少一种。 0045 在一些实施例中， 药用植物包括但不限于药用兰科植物。 0046 在一些实施例中， 药用兰科植物包括但不限于铁皮石斛、 金钗石斛、 鼓槌石斛、 白 芨、 天麻等中的至少一种。 0047 在一些实施例中， 以样品的cDNA为模板， 根据所述参考序列设计用于扩增目的基 因的特异性引物， PCR扩增获得基因产物。 基于参考序列设计用于扩增目的基因的特异性引 物， 特异性扩增目的基因， 使得SNP鉴定的针对性更强。 0048 本文中， cDNA是指互补(有时称拷贝)DNA， 特指在体外经过逆。

26、转录后与RNA互补的 DNA链。 与平常我们所称谓的基因组DNA不同， cDNA没有内含子而只有外显子的序列。 0049 在一些实施例中， 扩增获得基因产物后， 分离纯化， 获得目的基因产物。 0050 在一些实施例中， 将目的基因产物连接至载体， 然后转化至大肠杆菌Dh5 感受态 细胞， 进行抗性筛选， 获得阳性菌落。 0051 在一些实施例中， 以阳性菌落为模板， 使用引物进行菌落鉴定， 挑取阳性菌进行测 序， 得到基因序列。 0052 在一些实施例中， 引物为载体通用引物。 0053 在一优选的实施例中， 引物包括上游引物和下游引物， 上游引物含有如SEQ ID NO.13所示序列， 下。

27、游引物含有如SEQ ID NO.14所示序列。 0054 在一些实施例中， 菌落的鉴定方法为PCR鉴定。 0055 在一些实施例中， 菌落鉴定后， 挑取阳性菌培养， 对培养所得的阳性菌进行测序。 0056 在一些实施例中， 测序方法包括但不限于Sanger法(一代测序)、 循环阵列合成测 序法(二代测序)、 直接测序法(三代测序)等。 0057 在一优选的实施例中， 测序方法为Sanger法。 Sanger法测序使得SNP鉴定的准确性 更高， 降低后续SNP位点筛选的工作量， 成本比二代、 三代测序更低， 也可以鉴别单倍型和区 分直系/旁系同源序列的SNP。 0058 在一些实施例中， San。

28、ger法是根据核苷酸在某一固定的点开始， 随机在某一个特 定的碱基处终止， 并且在每个碱基后面进行荧光标记， 产生以A、 T、 C、 G结束的四组不同长度 的一系列核苷酸， 然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测， 从而获得可见DNA碱基序列的 一种方法。 0059 在一些实施例中， 还包括验证步骤， 使用目的基因的特异性引物， 以样品的cDNA为 说明书 4/9 页 7 CN 111876521 A 7 模板进行扩增， 对扩增产物进行测序， 然后将所得序列与参考序列进行序列比对， 验证候选 单核苷酸多态性位点真实存在。 0060 在一些实施例中， 去除首次比对步骤中存在而验证步骤中比对后不。

29、存在的单核苷 酸多态性位点， 留下的单核苷酸多态性位点即为真实存在的单核苷酸多态性位点。 0061 在一些实施例中， 目标化合物包括石斛碱。 0062 本文中， 石斛碱是一种吡咯里西啶衍生物类生物碱， 最初是从兰科植物金钗石斛 Dendrobium nobile Lindl.的茎中提取分离得到的一种吡咯里西啶衍生物类生物碱。 0063 在一些实施例中， 目标化合物的生物合成相关基因包括但不限于乙酰CoA酰基转 移酶基因(AACT)、 2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因(MCT)、 细胞色素氧化酶基因 (CYP94C1)、 甲羟戊酸激酶基因(MK)。 0064 在一些实施例中， 目。

30、标化合物的生物合成相关基因的参考序列在Gene Bank数据 库中的编号分别为LOC110096518、 KP860080.1、 LOC110116548、 LOC110113415。 0065 在一些实施例中， AACT基因的上游引物包含SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列。 0066 在一些实施例中， AACT基因的下游引物包含SEQ ID NO.2所示序列或其互补序列。 0067 在一些实施例中， MCT基因的上游引物包含SEQ ID NO.3所示序列或其互补序列。 0068 在一些实施例中， MCT基因的下游引物包含SEQ ID NO.4所示序列或其互补序列。 0069 在一些实。

31、施例中， CYP94C1基因的上游引物包含SEQ ID NO.5所示序列或其互补序 列。 0070 在一些实施例中， CYP94C1基因的下游引物包含SEQ ID NO.6所示序列或其互补序 列。 0071 在一些实施例中， MK基因的上游引物包含SEQ ID NO.7所示序列或其互补序列。 0072 在一些实施例中， MK基因的下游引物包含SEQ ID NO.8所示序列或其互补序列。 0073 第二方面， 在一些实施例中， 本发明提供一种基因组合在石斛碱生物合成基因单 核苷酸多态性位点鉴定中的应用， 基因组合含有AACT基因、 MCT基因、 CYP94C1基因、 MK基因 中的至少一种。 0。

32、074 第三方面， 在一些实施例中， 本发明提供一种引物组合在石斛碱生物合成基因单 核苷酸多态性位点鉴定中的应用， 引物组合含有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示序列或其 互补序列中的至少一种。 0075 在一些实施例中， 本发明建立了一种基于扩增子序列快速获取及鉴定SNP位点的 方法， 以铁皮石斛中石斛碱生物合成关键基因SNP鉴定为具体实施例进行了详细阐述， 通过 设计基因特异性引物扩增全长序列； 将序列与NCBI Gene Bank推测序列进行比对， 找出候 选SNP位点， 并通过再次扩增及测序对候选SNP位点进行确证。 该方法能够快速准确鉴定SNP 位点， 能够针对任何代。

33、谢途径中的多种基因进行针对性的SNP位点开发。 0076 铁皮石斛茎中的石斛碱含量最高， 叶中含量次之， 花中含量最低， 石斛碱的含量差 异不显著(张志信等， 铁皮石斛不同部位生药红外光谱分析， 2009， 文山学院学报)。 0077 在一些实施例中， 本发明针对铁皮石斛活性化合物生物合成相关基因进行SNP鉴 定， 能够进一步与产量及活性等性状相关联， 在石斛品质评价及品种鉴定方面具有潜在应 用价值。 0078 兰科石斛属(Dendrobium)约有1500多种植物， 在亚洲、 欧洲及大洋洲等热带及亚 说明书 5/9 页 8 CN 111876521 A 8 热带地区广泛分布。 我国约有石斛属。

34、植物81种， 药用历史悠久， 在 神农本草经 中记载了其 具有生津、 止咳、 润喉等功效。 药用石斛的主要活性成分有生物碱、 多糖等。 石斛碱最早从金 钗石斛中分离获得， 具有止痛、 解热、 降压等功效， 但石斛碱的含量较低， 市场需求较大。 通 过人工合成的方法生产石斛碱步骤繁琐， 成本较高且没有天然产物来源的石斛碱安全有 效， 因此， 石斛碱生物合成受到越来越多关注。 在一些实施例中， 本发明所提出的SNP位点鉴 定方法可应用于药用植物主要活性成分生物合成及产量等优异性状相关联基因的SNP快速 筛选， 对于石斛碱等化合物的生物合成、 石斛等物种的品质评价、 品种鉴定具有重要意义。 0079。

35、 在一些实施例中， 本发明基于全基因组测序推测获得的铁皮石斛石斛碱生物合成 关键基因， 建立了基于扩增子序列获得SNP的有效方法， 有效降低SNP鉴定的成本， 提高了 SNP鉴定效率和准确性。 0080 以下实施例中， 分别对铁皮石斛(Dendrobium catenatum)石斛碱生物合成相关基 因AACT、 MCT、 CYP94C1、 MK的SNP位点进行鉴定。 0081 实施例1 0082 本实施例提供一种石斛碱生物合成关键基因SNP位点的鉴定方法， 包括如下步骤： 0083 1、 检索NCBI Gene Bank数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genba。

36、nk/)， 获 得铁皮石斛石斛碱生物合成相关基因AACT、 MCT、 CYP94C1、 MK编码序列， 基因编号分别为 LOC110096518、 KP860080.1、 LOC110116548、 LOC110113415； 0084 SEQ ID NO.9所示为推测的AACT基因编码序列， 其中， n为简并碱基， 代表A、 T、 C、 G 碱基中的任一种， 在推测序列中， 该位点为未知碱基， 在一些实施例中， 也可采用符号X表 示。 0085 SEQ ID NO.10所示为推测的MCT基因编码序列。 0086 SEQ ID NO.11所示为推测的CYP94C1基因编码序列。 0087 SE。

37、Q ID NO.12所示为推测的MK基因编码序列。 0088 2、 提取铁皮石幼嫩枝条的总RNA， 图1显示为铁皮石斛总RNA提取后的凝胶电泳图， 结果表明， RNA提取质量良好， 28S和18S条带清晰， 且28S条带亮度约为18S条带亮度的两倍， 符合RNA样品逆转录要求。 取1 g总RNA， 采用TaKaRa公司的逆转录试剂盒(货号： RR047A)逆 转录成cDNA。 0089 具体包括如下步骤： 0090 (1)去除基因组DNA。 反应体系为： 5gDNA Eraser Buffer 2 L、 gDNA Eraser 1 L、 总RNA 1 g， 加RNase Free dH2O至1。

38、0 L。 42反应2分钟(或者室温反应5分钟)。 0091 (2)逆转录反应。 反应体系为： 上述步骤(1)的反应液10L、 PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 L、 RT Primer Mix 1 L、 RNase Free dH2O 4 L。 反应条件为： 3715分钟， 855秒。 反应完成后将产物置于-20冰箱中保存。 0092 3、 根据基因组测序推测的基因编码序列(参考文献： The Dendrobium catenatum Lindl.genome sequence provides insights into polysaccharide synthas。

39、e,floral development and adaptive evolution.Zhang GQ,et al.Sci Rep 2016 Jan 12)， 采用 PrimerPremier 5软件设计各基因特异性全长扩增引物。 以铁皮石斛幼嫩枝条cDNA为模板， 采用两步PCR法扩增获得基因产物。 0093 具体地， PCR反应体系为： H2O 6 L， I-5TM 2High-Fidelity Master Mix(北京擎 说明书 6/9 页 9 CN 111876521 A 9 科生物技术有限公司， 货号： TP001)10 L， 基因特异性上游引物(5 M)1 L， 基因特异性下游。

40、 引物(5 M)1 L， cDNA稀释10倍后取2 L做模板。 两步PCR法扩增程序为： 第一步， 982分钟， 9810秒， 5015秒， 721分钟， 10个循环； 第二步， 9810秒， 6015秒， 721分钟， 35个 循环， 最后725分钟。 PCR扩增产物经DNA凝胶电泳、 切胶纯化及回收获得目的基因产物。 具 体地， 采用DNA凝胶回收试剂盒(北京全式金生物技术有限公司， 货号： EG101-01)进行DNA片 段回收。 具体操作步骤为： (1)切取琼脂糖凝胶中的DNA条带， 放入干净的离心管中， 称取凝 胶重量， 按照300 L/100mg加入凝胶溶解液(GSB)于55水浴至。

41、胶完全融化。 (2)冷却凝胶溶 液至室温， 加入离心柱中， 10000g离心1分钟， 弃去流出液。 (3)加入650 L洗涤液(WB)洗涤 离心柱， 10000g离心1分钟， 弃去流出液。 (4)10000g离心2分钟， 弃去残留的WB溶液， 将 离心柱插入新的1.5mL离心管中， 室温干燥6分钟， 使离心柱膜上的酒精挥发干净。 (5)向离 心柱吸附膜的中央加入65预热的无菌去离子水35 L， 10000g离心1分钟， 即获得纯化的 DNA溶液。 PCR扩增产物凝胶电泳检测结果如图2所示， 结果表明， AACT(1218bp)、 MCT (930bp)、 CYP94C1(1521bp)、 MK。

42、(1152bp)均扩增出单一条带， 条带大小符合预期， 表明所设 计引物及扩增条件适宜， 所得产物可以用于凝胶纯化回收及后续载体连接反应。 0094 4、 将目的基因产物连接pEasy-blunt载体(北京全式金生物技术有限公司， 货号： CE211-01)， 转化大肠杆菌感受态细胞， 进行抗性筛选， 获得阳性菌落。 0095 阳性菌落的具体获取步骤如下： (1)载体连接。 取1 L pEasy-blunt、 3 L PCR凝胶 回收产物， 混合， 室温连接20分钟。 (2)大肠杆菌热激转化。 42金属浴热激90秒， 随即置于 冰上2分钟。 (3)复苏细胞。 向热激后的细胞中加入800 L无抗。

43、生素LB液体培养基， 于200rpm、 37摇床复苏培养40分钟。 (4)抗性筛选。 在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养板上过夜培 养， 筛选阳性菌落。 0096 无抗生素LB液体培养基的组成如下： 胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、 酵母提取物 (Yeast extract)5g/L、 氯化钠(NaCl)5g/L。 0097 5、 挑取阳性菌落为模板， 使用通用引物M13进行菌落PCR鉴定。 0098 PCR反应体系为： H2O 8 L、 2EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金生物技术有限 公司， 货号： AS111)10 L、 M13F引物(5 M)1 L、 M1。

44、3R引物(5 M)1 L， 以白色10 L吸头蘸取菌斑 作为模板。 PCR反应程序为： 942分钟， 9430秒， 6030秒， 721分钟， 35个循环， 725分 钟。 图3显示为菌落PCR鉴定阳性克隆的凝胶电泳图， 从图3可知， AACT(1218bp)、 MCT (930bp)、 CYP94C1(1521bp)、 MK(1152bp)四个基因都在部分菌落样本中扩增出了大小一致 的目标条带， 选取对应的菌落作为转化阳性菌落， 各挑取2-3个阳性菌落， 摇菌过夜培养， 取 1mL菌液送华大基因公司进行一代测序。 0099 上述体系中涉及的引物如下： 0100 M13F： 5 -TGTAAA。

45、ACGACGGCCAGT-3 (SEQ ID NO.13)； 0101 M13R： 5 -CAGGAAACAGCTATGACC-3 (SEQ ID NO.14)。 0102 6、 利用DNAMAN软件将2-3个阳性克隆的序列与Gene Bank推测序列进行比对， 找出 候选的SNP位点； 对比分析SNP位点突变对应的氨基酸序列变化。 主要比对参数为： Multiple sequence alignment,DNA sequence alignment,Full alignment,Quick alignment,Gap penalty 7,No.of top diagonals 4,K tup。

46、le 2,Window size 4,Gap open penalty 10, DNA transition weight 0.5,Gap extension penalty 5,Delay divergent seq40,Gap 说明书 7/9 页 10 CN 111876521 A 10 separation distance 8。 0103 图4显示为AACT基因的SNP位点及对应的氨基酸变化图， 第1168位的A颠换成了G， 导致389位异亮氨酸替换成缬氨酸。 第1183位的未知碱基X在实测序列中为G， 编码甘氨酸。 SNP造成的碱基转换或颠换， 进而导致对应位点编码的氨基酸发生改变，。

47、 可能影响目标基因 表达水平或酶的活性， 从而影响代谢产物的成份或含量， 因此能够与研究对象的特定农艺 性状相关联。 0104 图5显示为CYP94C1基因的SNP位点及对应的氨基酸变化图， 第444位的T颠换为C， 但该位点编码的氨基酸并未发生改变。 第535位的T颠换为G， 导致该位点编码的氨基酸由丝 氨酸替换为丙氨酸。 第609位的C颠换为T， 但该位点编码的氨基酸并未发生改变。 0105 图6显示为MCT基因的SNP位点及对应的氨基酸变化图， 第156位的A转换为T， 但该 位点未造成氨基酸的改变。 第269位的C颠换为T， 导致该位点编码氨基酸由脯氨酸替换为亮 氨酸。 第332位的C。

48、颠换为T， 导致该位点编码氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸。 第621位的C颠换 为T， 但该位点编码氨基酸并未发生改变。 0106 图7显示为MK基因的SNP位点及对应的氨基酸变化图， 第474位的A转换为T， 但该位 点编码氨基酸并未发生改变。 第678位的C颠换为T， 也并未导致编码氨基酸发生改变。 0107 图4图7中， 箭头所指的碱基为SNP位点。 0108 7、 为避免PCR扩增及切胶回收时紫外照射等过程可能造成的碱基突变的发生， 使 用各基因特异性引物， 以铁皮石斛cDNA为模板进行再次扩增、 回收、 连接、 转化及测序(参照 步骤3-6进行)， 确证候选SNP位点真实存在。 0109 。

49、列举其中一个SNP位点验证的实施例来说明验证步骤的必要性。 以MCT基因为例， 在初次SNP位点鉴定中鉴定出的SNP位点数量为序列中单下划直线和双下划直线标记的碱 基数的总和(14个)， 但在第二次验证过程筛选掉10个位点(单下划直线标记碱基)， 只剩下4 个确证的位点(双下划直线标记的碱基)。 该实施例说明， 验证步骤是必要的， 可以有效排除 一些假阳性的SNP位点。 0110 序列标示如下： 0111 5 -ATGATGGCACTCCCATATCAGCTCCCACCCTATCGACTTCATTCCGTCCGTCCTGCCTCATCCTA CCTGCCCCATGTGCTCAACATGATTC。

50、CGAAAACTCATTACCGGCTATTCCTTTCTTCCCGATCCCGCCGCCGCTCC GCAGATGTTGGGATAGGAGTGAAGGATGAAACAACTTCAAGTCCGGTTCAGATACATTGCGTTGCCCAAGAAGAAG GAAGACATGAGGGCTCTGGAATTGTGAAGGATAAAAGTGTTTCTGTGATTCCTTTGGCCGGAGGGAAGGGGAAGCG GATGGGGGTAAGTATACCAAAGCAGTACCTTCCTCTCTCGGGGAAACCGATTGCCCTTTATAGTTTCTACACTTTA TCCATGTTAAGTGAAGTG。