一株异源表达纤维素酶基因EG的毕赤酵母工程菌株及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010535506.8 (22)申请日 2020.06.12 (83)生物保藏信息 CGMCC No.18421 2019.08.26 (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开 发区第十三大街29号 (72)发明人 钟成王新光沈钰清贾士儒 李文超 (74)专利代理机构 北京瑞盛铭杰知识产权代理 事务所(普通合伙) 11617 代理人 郑海松 (51)Int.Cl. C12N 9/42(2006.01) C12N 15/81(2006.01)。

2、 C12N 1/19(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一株异源表达纤维素酶基因EG的毕赤酵 母工程菌株及应用 (57)摘要 本发明公开了一种异源表达纤维素酶基因 EG的毕赤酵母工程菌及其应用， 所述的工程菌 为Pichia pastoriseg4， 其于2019年8月保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 保藏编号为CGMCC No.18421。 通过PCR方法从 里氏木霉获得葡萄糖内切酶基因(EG)， 将其克 隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中， 获 得pPIC9Keg4表达载体。 通过电转化将载体导入 到毕赤酵母GS115。

3、中获得重组毕赤酵母菌株， 用 不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质 粒的重组酵母菌株。 并通过摇瓶发酵初步优化确 定了最佳诱导条件， 同时对纯化后的重组蛋白酶 酶学性质分析。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 111893107 A 2020.11.06 CN 111893107 A 1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EG蛋白的构建方法， 包括以下步骤： (1)里氏木霉RNA和cDNA的获得： 培养里氏木霉QM9414， 直至出绿色孢子， 然后接种于固 体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体， 用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA； (2)目的基因的克隆： 设计合理。

4、引物， 合适的条件， PCR扩增出EG的基因； (3)构建表达载体： 以Ppic9k质粒为载体， 将EG基因插入启动子AOX1下游， 5端酶切 位点为EcoR ， 3端酶切位点为Not ， 构建Ppic9k-EG表达载体； (4)获取重组菌株： 以bgl 为Ppic9k-EG表达载体的线性化位点。 实现表达载体线性 化， 然后通过电转化转入毕赤酵母， 得到EG的重组酵母； (5)重组菌株的筛选： 利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整合质 粒的重组酵母菌株； (6)诱导表达条件的优化： 将菌株P.pastoris-eg2-3接至BMMY(含0.5甲醇)中诱导， 29， 28。

5、0rpm， 振荡培养。 24h、 48h、 72h、 96h、 120、 144、 168取样， 每次取样都会补充一定量的 甲醇， 通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间； 将重组菌株接至BMMY(含0.5甲 醇)中进行不同温度(24、 26、 28、 30)诱导， 280rpm， 振荡培养， 在最佳诱导时间取样， 每24h 补充一定量的甲醇， 确定最佳诱导温度； 将重组菌株接至含0.5甲醇的发酵培养基BMMY中 进行不同转速诱导， 在最佳温度培养， 最佳诱导时间取样， 每24h补充一定量的甲醇， 确定最 佳诱导转速； (7)重组菌株的诱导产酶： 将筛选后的菌株， 摇瓶发酵， 加入适当甲醇。

6、诱导产酶； (8)重组蛋白活性检测： 刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素 降解酶； SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量； (9)酶学性质分析： 通过硫酸铵沉淀、 镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶， 在不同pH条 件下测酶活， 确定最适pH； 在最适pH， 不同温度条件下测定重组酶酶活， 确定最适温度； 在重 组酶的最适pH和最适温度下， 取不同浓度的底物CMC， 测得相应的反应速度V， 得到重组酶的 动力学常数； (10)菌株的保藏： 表达纤维素酶基因EG的毕赤酵母工程菌株的保藏单位： 中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)； 地址。

7、： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所； 保藏日期： 2019年8月26日； 酵母工程菌株编号： CGMCC No.18421； 毕赤酵母工程菌株的分类命名为： 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。 2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达EG蛋白的构建方法， 其特征在于， 诱导重组菌株表达产酶时， 研究了其诱导表达条件： 发酵液中目的蛋白EG酶活在120h， 28 ， 260rpm时达到最大酶活值， EG酶活力可达4.87IU/mL， 得到较大产量的目的蛋白， 便于 后续目的蛋白的纯化。 3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达EG蛋白的构建方。

8、法， 其特征在于， 优化了目的基因的引物序列,合理引入6个组氨酸(His)对应的密码子， 以使得表达的目的 蛋白中含组氨酸， 通过镍柱对目的蛋白进行分离纯化， 便于后续对重组蛋白酶酶学性质分 析。 4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达EG蛋白的构建方法， 其特征在于， 酶学性质测得EG的最适pH为5.0、 最适温度为60、 Km值约为2.4mg/mL， Vmax值约为 权利要求书 1/2 页 2 CN 111893107 A 2 156.6IU/mg， 得到重组酶的基本酶学性质与天然里氏木霉分泌酶的酶学性质相似， 可代替 里氏木霉天然分泌核心酶组分用于纤维素基质水解中。 5.根据权利。

9、要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达EG蛋白的构建方法， 其特征在于， 实现了纤维素酶蛋白EG在毕赤酵母中的异源表达,加入适量甲醇诱导产酶， 提高了产酶 效率， 提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111893107 A 3 一株异源表达纤维素酶基因EG的毕赤酵母工程菌株及应用 技术领域 0001 本发明属于纤维素酶基因工程技术领域， 尤其涉及异源表达纤维素酶基因EG的 毕赤酵母菌株的构建及应用。 背景技术 0002 木质纤维素是一种丰富的可再生资源， 其可以转化为多种生物能源和化学产品。 将木质纤维素转化为燃料乙醇的研究正受到越来越多的关注。 但是木质纤维素转。

10、化生产燃 料乙醇过程中， 酶制剂成本及酶解过程约占其生产成本的40， 所以降低纤维素酶生产成 本或通过统合生物加工过程(Consolidated bioprocessing， CBP)整合酶解和发酵过程是 提高木质纤维素乙醇生产经济性的重要手段。 0003 纤维素酶是由多种酶系组成的复合酶系统， 包括内切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶和 -葡萄糖苷酶。 市场上大多数商业纤维素酶是由木霉菌和曲霉分泌的， 如里氏木霉、 康氏木 霉与黑曲霉等。 其中里氏木霉抗代谢抑制能力强， 生产的纤维素酶具有较高的酶活性， 已成 为工业上应用最广泛的纤维素酶生产菌株。 然而， 里氏木霉的酶系中存在多种蛋白质， 导致 纤。

11、维素酶所占的比例不高， 并且各纤维素酶的比例主要由其自身调控， 很难进行人工控制。 通过在酵母中表达外源基因生产纤维素酶不仅能够使酵母具备直接降解纤维素的能力， 而 且可以通过人工手段来调控酶的合成与分泌， 有利于对纤维素酶的酶学性质和相互作用进 行研究， 从而进一步提高其酶活能力。 0004 目前， 重组蛋白表达系统主要有： 大肠杆菌、 酵母、 昆虫细胞、 哺乳动物细胞、 转基 因植物或动物表达系统和体外翻译系统。 其中， 真核生物具有生长快、 培养容易、 遗传操作 简单， 同时还可以对表达蛋白进行加工、 修饰和折叠等特点， 因此真核生物的表达系统越来 越受到重视和广泛应用。 其中巴斯德毕赤。

12、酵母表达系统是最近发展起来的较为完善的、 应 用最广泛的甲醇营养型酵母表达系统。 重组毕赤酵母菌株外源基因表达能力强， 稳定性高， 可以胞外分泌纤维素酶蛋白， 并且自身分泌的蛋白成分极少有利于表达蛋白的分离纯化。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种重组表达EG酶的毕赤酵母工程菌， 即利用基因工程的 技术手段， 将里氏木霉的纤维素内切葡聚糖酶EG基因转化入毕赤酵母中， 构建毕赤酵母 工程菌株。 该菌株能高效表达纤维素内切葡聚糖酶EG， 为了提高重组菌株的产酶量， 研究 了摇瓶培养的诱导时间、 温度、 转速。 并且对分离纯化后的蛋白酶进行了酶学性质分析。 最 终将菌株保藏于中国微生物菌种保。

13、藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。 0006 本发明所采用的技术方案是： 0007 (1)里氏木霉RNA和CDNA的获得： 将里氏木霉QM9414培养出绿色孢子， 接种于诱导 培养基获得菌丝体， 用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA； 0008 (2)目的基因的克隆： 设计合理引物， PCR扩增出目的基因； 0009 (3)构建表达载体： 以Ppic9k质粒为载体， 将EG基因插入启动子AOX1下游， 5端 说明书 1/5 页 4 CN 111893107 A 4 酶切位点为EcoR ， 3端酶切位点为Not ， 构建Ppic9k-EG表达载体； 0010 (4)获得重组菌株： 以。

14、里氏木霉cDNA为模板， 通过PCR成功扩增出目的片段， 经双酶 切法成功构建了重组质粒pPIC9K-EG； 通过电转将重组质粒转入毕赤酵母， 通过MD平板、 MM平板、 YPD平板(含不同浓度浓度的G418)、 基因组PCR获得重组菌株； 0011 (5)重组菌株的筛选： 利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整 合质粒的重组酵母菌株； 0012 (6)诱导表达条件的优化： 将菌株P.pastoris-eg4-4接至BMMY(含0.5甲醇)中诱 导， 29， 280rpm， 振荡培养。 24h、 48h、 72h、 96h、 120、 144、 168取样， 每次取样都会补。

15、充一定 量的甲醇， 通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间； 将重组菌株接至BMMY(含 0.5甲醇)中进行不同温度(24、 26、 28、 30)诱导， 280rpm， 振荡培养， 在最佳诱导时间取 样， 每24h补充一定量的甲醇， 确定最佳诱导温度； 将重组菌株接至含0.5甲醇的发酵培养 基 BMMY中进行不同转速诱导， 在最佳温度培养， 最佳诱导时间取样， 每24h补充一定量的甲 醇， 确定最佳诱导转速； 0013 (7)重组菌株的诱导产酶： 使筛选后的菌株在已优化的诱导表达条件中产酶； 0014 (8)重组蛋白活性检测： 利用SDS-PAGE检测分泌的蛋白是否有目的蛋白以及刚果 红。

16、 -CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶 0015 (9)酶学性质分析： 通过硫酸铵沉淀、 镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶， 在不同 pH条件下测酶活， 确定最适pH； 在最适pH， 在不同温度条件下测定重组酶酶活， 确定最适温 度； 在重组酶的最适pH和最适温度下， 取不同浓度的底物CMC， 测得相应的反应速度V， 得到 重组酶的动力学常数。 0016 (10)菌株保藏： 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)； 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所； 保藏日期： 2019年8 月26日； 酵母工程菌株编号： CG。

17、MCC No.18421； 毕赤酵母工程菌株的分类命名为： 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。 0017 本发明的优点： 0018 1.本发明将与组氨酸(His)对应的6个密码子导入基因的引物中， 使目的蛋白带有 His 标签， 有利于镍柱对其进行纯化。 0019 2.本发明诱导表达毕赤酵母重组菌株时， 对诱导表达条件进行了优化， 并添加适 量甲醇， 使诱导效果最佳， 提高了重组菌株的产酶效率。 0020 3.本发明对重组酶的基本酶学性质进行了测定， 发现重组酶的基本酶学性质与天 然里氏木霉分泌酶的酶学性质相似， 可代替里氏木霉天然分泌核心酶组分用于纤维素基质 水解中。 002。

18、1 4.本发明实现了纤维素酶蛋白EG在毕赤酵母中的异源表达， 提高了重组毕赤酵 母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率， 提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。 附图说明 0022 图1是EG的PCR扩增图； 0023 图2是Ppic9k-EG的菌落PCR验证图； 0024 图3是Ppic9k-EG表达质粒图谱； 说明书 2/5 页 5 CN 111893107 A 5 0025 图4是线性化核酸电泳图EG； 0026 图5是EG重组毕赤酵母的基因组PCR图； 0027 图6是刚果红-CMC验证诱导酶是否活性EG； 0028 图7是EG菌株发酵液上清的SDS-PAGE图； 0029 图8是PCR扩增E。

19、G的测序对比图。 具体实施方式 0030 实施案例1目的基因的克隆 0031 1.将保存于甘油管的里氏木霉QM9414孢子悬液， 从-80冰箱中取出置于冰(或4 冰箱)中解冻， 至孢子悬液完全融化。 将孢子悬液振荡混合均匀， 接种环沾取少量菌液， 在 PDA培养基平板上划线接种。 用封口膜将平板封口后， 正置于28培养箱中培养。 培养约 5- 7天， 至培养基表面上布满绿色孢子。 将平板从培养箱中取出， 置于4冰箱中备用。 0032 2.将新鲜孢子接种于纤维素酶固体诱导培养， 表面铺上灭菌的玻璃纸， 静置培养， 直到菌丝长出来。 从玻璃纸上刮下菌丝， 用液氮冷冻研磨仪处理后， RNA的提取用U。

20、NIQ-10柱 式总RNA抽提试剂盒， RNA的反转录用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。 0033 3.以合成的的里氏木霉cDNA模板， 通过引物PCR扩增出QM9414的EG所对应的基 因序列， 扩增PCR图见图1， 测序对比结果见图8。 0034 引物： Eg4-F CGGAATTCATGCATGGACATATTAATGACATTGTCATC 0035 Eg4-R TTGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTAAGGCACTGGGC 0036 PCR扩增体系： 0037 0038 实施案例2表达载体Ppic9k-EG的构建 00。

21、39 1.利用限制性内切酶EcoRI/Not I， 双酶切Ppic9k和目的基因。 利用两种酶的黏性 末端将两者连接起来。 按下表配制双酶切体系， 金属浴37反应50min。 回收试剂盒进行回 收。 0040 双酶切体系： 说明书 3/5 页 6 CN 111893107 A 6 0041 0042 2.以5端EcoR 为酶切位点,3端Not 为酶切位点， 插入Ppic9k质粒载体启动子 AOX1 下游,构建表达载体Ppic9k-EG。 表达载体图谱见图3。 菌落PCR验证见图2。 并通过单 酶切对表达载体进行验证， 以确定表达载体Ppic9k-EG构建成功。 0043 连接体系： 0044 。

22、0045 实施案例3重组毕赤酵母的构建 0046 1.使用限制性内切酶bgl， 对重组表达质粒Ppic9k-EG进行单酶切， 配制线性 化体系， 混合均匀， 金属浴37温育1h， 使表达载体由环状成为线状， 有利于后期转化。 核酸 电泳对线性化后的质粒进行验证,见图4。 通过电转化转入毕赤酵母GS115感受态细胞， 涂板 得到转化子。 0047 线性化体系： 0048 0049 2.利用SDS热裂解法粗提1得到的重组酵母转化子的基因组， 通过PCR验证其正确 性和表型， 基因组PCR核酸图见图5。 挑取MM平板上转化子， 依次点接至含不同浓度G418 抗 生素的YPD培养基平板上， 30倒置培。

23、养， 观察菌落形态， 筛选出多拷贝转化子。 0050 实施案例4毕赤酵母重组菌株的诱导表达及条件优化 0051 1.YPD平板一级活化后， 取单菌落接至三角瓶中(25mL BMGY)， 29， 280rpm， 振荡 培养至OD6002.0。 4， 7000rpm离心5min收集菌体， BMMY重悬菌体， 使OD6001.0 左右。 将收集到的菌液加入1L三角瓶， 纱布封口， 29， 280rpm， 振荡培养。 每24h添加甲醇至终浓 说明书 4/5 页 7 CN 111893107 A 7 度0.5。 取样1mL， 4， 12000rpm离心5min， 留上清液4保存。 0052 2.诱导时间。

24、： 方法同1毕赤酵母重组菌株的诱导表达， 29， 280rpm振荡培养， 24h、 4 8h、 72h、 96h、 120h、 144h、 168h取样。 0053 诱导转速： 方法同上， 29， 最佳诱导时间取样。 转速： 200rpm、 220rpm、 240rpm、 260rpm、 280rpm。 0054 诱导温度： 方法同上， 最佳转速振荡培养， 最佳诱导时间取样。 温度:： 24、 26、 28、 30。 0055 实施案例5诱导重组毕赤酵母产酶并验证其酶活性 0056 1.将高拷贝转化子的单菌落， 接种于25ml BMGY种子培养基， 29290rpm培养至 OD6002(约16。

25、-18h)， 离心5min后收集菌体， 用BMYY培养基重悬至OD6001为止。 灭菌纱布 盖住， 放入摇床29继续培养， 每24小时， 加甲醇至0.5浓度， 直至到达最佳诱导时间。 定 时取样1ml， 室温离心， 收集上清。 0057 2.将100ul上清加到含0.5CMC的琼脂平板的空穴中， 50培养1h。 用0.1刚果 红染色1h， 再用1mol/LNacl脱色40min。 Nacl就可以使结合不牢的刚果红洗去， 这样就留下 大小不一的透明圈， 大的透明圈分解纤维素的能力就强， 如图6。 0058 3.采5浓缩酵； 12分离胶， 加入处理好的样品上清， 其SDS-PAGE见图7。 005。

26、9 实施案例6表达纤维素酶基因EG的毕赤酵母工程菌株的保藏 0060 表达纤维素酶基因EG的毕赤酵母工程菌株的保藏单位： 中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(CGMCC)； 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微 生物研究所； 保藏日期： 2019年8月26日； 酵母工程菌株编号： CGMCC No.18421； 毕赤酵母工 程菌株的分类命名为： 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。 说明书 5/5 页 8 CN 111893107 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 111893107 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 111893107 A 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 111893107 A 11 图7 图8 说明书附图 4/4 页 12 CN 111893107 A 12 。