眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010820599.9 (22)申请日 2020.08.14 (71)申请人 蒋沁 地址 210029 江苏省南京市汉中路138号南 京医科大学眼科医院 (72)发明人 蒋沁颜标刘明 (74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 11401 代理人 杨采良 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/113(2010.01) (54)发明名称 一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、 。

2、诊断试剂盒及应用 (57)摘要 本发明属于生物医学检测技术领域， 尤其涉 及一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、 诊 断试剂盒及应用。 本发明的试剂盒利用荧光定量 PCR方法对患者血清中hsa_circ_0002484的表达 水平进行检测， 提供了一种眼底血管性疾病的检 测标记物和预后评估方法， 具有深远的临床意义 和推广性， 同时该方法具有创伤性小， 操作方便 等特点。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 111926072 A 2020.11.13 CN 111926072 A 1.一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物， 所述标记物为circ_0002484， 所。

3、述circ_ 0002484的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物， 其特征在于： 所述circ_ 0002484的检测引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 3.一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于： 包括PCR扩增 体系， 所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2， circ_0002484特异性的qRT-PCR上 游引物， circ_0002484特异性的qRT-PCR下游引物， GAPDH定量PCR上游引物， GAPDH定量PCR 下游引物。 4.根据权。

4、利要求3所述的一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特 征在于： 所述circ_0002484的特异性qRT-PCR引物序列如权利要求2所示； 所述GAPDH定量 PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示， 下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。 5.根据权利要求3所述的一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特 征在于： 所述试剂盒还包括反转录反应体系， 所述反转录反应体系包括Oligo dT和Random 6mers， 反转录酶， dNTP Mixture， 反转录buffer。 6.根据权利要求5所述的一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检。

5、测试剂盒， 其特 征在于： 所述试剂盒还包括RNA抽提体系， 所述RNA抽提体系包括Trizol reagent， 氯仿， 无 水乙醇， DEPC ddH2O， ddH2O， 异丙醇。 7.如权利要求1或2所述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用， 特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测眼底血管性疾病诊断试剂中的应用。 8.如权利要求1或2所述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病治疗后的预后评估试 剂中的应用， 特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行眼底血管性疾病治疗后的预后 评估试剂中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111926072 A 2 一种眼底。

6、血管性疾病诊断环状RNA标志物、 诊断试剂盒及应用 技术领域 0001 本发明属于生物医学检测技术领域， 尤其涉及一种眼底血管性疾病诊断环状RNA 标志物、 诊断试剂盒及应用。 背景技术 0002 眼底血管性疾病包括增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)、 湿性年龄相关性黄斑变性 (AMD)和早产儿视网膜病变(ROP)等。 此类疾病已经成为从婴幼儿到老年人各个年龄阶段的 视力障碍和致盲的最主要原因， 严重影响了患者的生活质量。 眼底血管新生是该类疾病的 最重要的病理表现， 其形成多认为是眼组织在缺血缺氧的病理状态下的适代偿性反应。 眼 底新生血管为异常血管， 较正常血管通透性增加， 易发生反复的渗液。

7、、 出血和增殖， 多累及 黄斑和视盘， 造成视力的严重损害甚至失明。 目前， 眼底血管性疾病的诊断主要依靠病史、 形态学和功能学方面的综合检查， 现有的检查手段仍具有一定的局限性， 无法在疾病发展 的早期阶段对该类疾病进行诊断。 同时该类疾病相关的生化检查、 血清学筛查和检测处于 相对空白的状态。 因此寻找一种具有高灵敏度和高特异性的标志物对眼底血管性疾病进行 诊断和监控尤为重要。 0003 环状RNA(circRNA)是一类具有特殊功能的非编码RNA， 具有高稳定性和高保守性 等特征。 circRNA可以在转录后、 翻译和表观遗传等层面发挥调控作用。 circRNA参与细胞增 殖、 细胞分化。

8、、 细胞周期和基因组印记等生理过程， 通过多种分子机制调控基因表达， 例如 可以作为miRNA分子 “海绵” 、 核转录调控因子和RNA结合蛋白。 随着对circRNA结构和功能的 认识， 发现某些circRNA在肿瘤、 心血管和神经系统等疾病中发挥重要的调控作用。 鉴于 circRNA的特征及其疾病相关性， 其有望成为诊断标志物和预后评估的标记。 0004 迄今为止， 利用患者血清通过circRNA表达的检测对眼底血管疾病进行诊断的报 道目前很少。 发明内容 0005 针对现有技术存在的问题， 本发明提供了一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志 物、 诊断试剂盒及应用， 目的在于解决现有技术中。

9、的一部分问题或至少缓解现有技术中的 一部分问题。 0006 本发明是这样实现的， 一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物， 所述标记物为 circ_0002484， 所述circ_0002484的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0007 进一步地， 所述circ_0002484的检测引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。 0008 一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒， 包括PCR扩增体系， 所述 PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2(包括Ex Taq酶， dNTP Mixture， Mg2+， Tli RNaseH， TB G。

10、reen)100 L， circ_0002484特异性的qRT-PCR上游引物， circ_0002484特异性 的qRT-PCR下游引物， GAPDH定量PCR上游引物， GAPDH定量PCR下游引物； ， 引物各1管， 10 M， 100 L/管。 说明书 1/6 页 3 CN 111926072 A 3 0009 进一步地， 所述circ_0002484的特异性qRT-PCR引物序列如上所示； 所述GAPDH定 量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示， 下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。 0010 进一步地， 所述试剂盒还包括反转录反应体系， 所述反转录反应体系包括总R。

11、NA反 转录引物(包括Oligo dT和Random 6mers)， 1管， 浓度： 50 M， 50 L/管， 反转录酶(200U/ L) 50 L， dNTP Mixture(10mM each)50 L， 反转录buffer 50 L。 0011 进一步地， 所述试剂盒还包括RNA抽提体系， 所述RNA抽提体系包括Trizol reagent， 1管， 2000 L/管； 氯仿， 1管， 500 L/管； 无水乙醇， 1管， 8000 L/管； DEPC ddH2O， 1 管， 1000 L/管； ddH2O， 1管， 2000 L/管； 异丙醇， 8000 L/管。 0012 如上述的。

12、环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用， 特别是在制 备基于实时荧光定量PCR技术检测眼底血管性疾病诊断试剂中的应用。 0013 如上述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应 用， 特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂 中的应用。 0014 进一步地， 所述眼底血管性疾病包括糖尿病视网膜病变、 脉络膜新生血管中的至 少一种。 0015 本发明中确定circ_0002484作为眼底血管性疾病的诊断标记物包括如下步骤： 0016 第一步： 样本准备： 收集正常人血清样本(对照组)、 增殖性糖尿病视网膜病变(实 验组)、。

13、 湿性老年黄斑变性(实验组)和白内障病人的血清标本(对照组)， RNA采用TRIzol (Invitrogen)试剂提取， 并保存于-80备用。 0017 第二步： 采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录； 0018 第三步： 采用定量PCR验证芯片分析的实验结果， 验证靶点circ_0002484在不同血 清样本中的表达差异。 0019 本发明的另一目的在于分析circ_0002484作为眼底血管性疾病的预后效果评估 的可行性。 实验步骤包括： 0020 第一步： 样本准备： 收集增殖性糖尿病视网膜病变(实验组， n20)和湿性老年黄 斑变性(实验组， n20)病人治疗前后的血清标本。

14、， RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取， 并保存于-80备用。 0021 第二步： 采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录； 0022 第三步： 采用定量PCR验证芯片分析的实验结果， 验证靶点circ_0002484在不同血 清样本中的表达差异。 0023 综上所述， 本发明的优点及积极效果为： 0024 本发明提供了环状RNA circ_0002484的新用途， 可作为诊断试剂用于眼底血管性 疾病的诊断， 特别是增殖性糖尿病视网膜病变和湿性老年黄斑变性中的诊断和预后评估。 0025 本发明证明通过定量PCR技术， 检测患者血清中circ_0002484的表达来实。

15、现眼底 血管性疾病的诊断是完全可行的。 0026 本发明的试剂盒还适用于： 根据患者年龄、 病史以及局部体征初步怀疑为眼底血 管性疾病的患者。 0027 用本发明的试剂盒分别检测若干已知的眼底血管性疾病患者及若干的正常患者 血清中circ_0002484含量， 以此作为标准。 再用相同的方法测定未知患者血清circ_ 说明书 2/6 页 4 CN 111926072 A 4 0002484含量， 对照上述标准数据， 既可以初步判断患者是否患有眼底血管性疾病， 以便进 一步确诊。 0028 本发明的试剂盒是首次利用荧光定量PCR方法， 通过检测血清中circ_0002484表 达水平进行检测， 。

16、以辅助眼底血管性疾病的诊断和预后评估， 具有深远的临床意义和推广 性， 同时该方法具有创伤性小， 操作方便等特点， 使得circ_0002484有望成为生物标记物， 有助于对眼底血管性疾病发生和患者的预后判断进行科学地判断。 附图说明 0029 图1是实施例1眼底血管性疾病的血清中定量PCR检测结果； 横坐标代表不同患者 血清标本， 纵坐标代表circ_0002484的表达水平； 0030 图2是实施例2眼底血管性疾病的治疗前后， 血清标本的定量PCR检测结果， 横坐标 代表眼底血管性疾病血清标本， 纵坐标代表circ_0002484的表达水平。 具体实施方式 0031 为了使本发明的目的、 。

17、技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例对本发明 进行进一步详细说明， 各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明， 均可从商业 途径得到。 此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。 0032 根据本申请包含的信息， 对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精 确描述进行各种改变， 而不会偏离所附权利要求的精神和范围。 应该理解， 本发明的范围不 局限于所限定的过程、 性质或组分， 因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性 说明本发明的特定方面。 实际上， 本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方 式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。。

18、 0033 为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围， 在本申请中所用的表示用量、 百分比的所有数字、 以及其他数值， 在所有情况下都应理解为以词语 “大约” 所修饰。 因此， 除非特别说明， 否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值， 其可能 会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。 各个数字参数至少应被看作是根据所报告 的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。 本发明中，“约” 指给定值或范围的10 以内， 优选为5以内。 0034 本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件， 不进行额外的冷却或 加热处理， 一般常温控制在1030， 最好是1525。 00。

19、35 本发明披露了一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、 诊断试剂盒及应用， 具体 如下各实施例所示。 本发明中的RNA提取及逆转录等过程可参照市场购买的试剂盒操作。 0036 实施例1circ_0002484在眼底血管性疾病诊断中的应用 0037 血样本及处理： 收集200例糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者的血清， 200例年龄 相关性黄斑变性(AMD)伴发脉络膜新生血管(CNV)患者的血清， 200例白内障患者的血清， 同 时收集200例正常人的血清匹配作为对照。 0038 实验过程 0039 步骤一、 获得待检血液样本 0040 样本为眼底血管性疾病和正常人的加促凝剂的血液样本。 。

20、说明书 3/6 页 5 CN 111926072 A 5 0041 步骤二、 从待检血液样本中提取RNA 0042 a)血清样本或冷冻血清取0.25ml样本移至离心管中， 加1ml Trizol， 用移液枪上 下反复吸打直至细胞完全裂解。 0043 b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖， 剧烈振 荡15sec， 室温静置5min。 0044 c)4离心， 12,000g15min， 从离心机中小心取出离心管， 此时匀浆液分为三层， 即： 无色的上清液、 中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。 吸取上清液转移至另一新 的离心管中(切忌吸出白色中间。

21、层)。 0045 d)向上清液中加入1倍体积异丙醇， 涡旋充分混匀。 0046 e)4离心， 12,000g10min， 一般在离心后， 试管底部会出现沉淀， 弃上清。 0047 f)加入1ml 75乙醇， 用手轻轻颠倒， 12,000g离心5min， 弃去上清。 0048 g)加入1ml无水乙醇， 用手轻轻颠倒， 12,000g离心5min， 弃去上清。 0049 h)室温晾干加入适量的DEPC H2O溶解(65促溶10-15min)， 必要时可用移液枪轻 轻吹打沉淀。 0050 i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。 0051 步骤三、 将获得的RNA逆转录成cDNA。

22、 0052 采用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit， 按照试剂盒提供的体系(25 L) 配置如下： 5PrimeScriptTM Buffer 4 L， PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1 L、 Oligo dT Primer(50 M)1 L、 Random 6mers(100 M)4 L， total RNA 2 L， RNase free ddH2O 13 L。 按下面程序反转为cDNA： 3715min， 855sec， 得到的cDNA放于-20中保存。 0053 步骤四、 实时荧光定量PCR 0054 取本发明所述试剂。

23、盒的PCR反应体系(50 L)， 采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq， 按照说明书提供的体系配置如下： SYBR Premix Ex Taq 25 L， 特异性的qRT-PCR上游 引物、 下游引物各1 L(特异性识别hsa_circ_0002484或GAPDH)， 待测样品cDNA 2 L， RNase free ddH2O补足至50 L。 0055 PCR条件： 92， 5min； (92， 30sec； 56， 30sec； 72， 30sec， 38个循环)； 72， 5min。 0056 五、 数据分析 0057 对同一样本分别进行目标RNA和内参RNA实时荧光。

24、定量PCR检测， 以内参的表达量 为基准， 对目标RNA进行归一化处理， 随后对目标RNA的相对表达量采用本领域通用的Ct 法分析： 将所有血清样本的目的基因circ_0002484的Ct值减去自身内参基因GAPDH的Ct值， 得到所有血清样本的Delta Ct值(Ct)， 公式表达为CtCt(目的基因circ_0002484)- Ct(内参基因GAPDH)。 实验重复三次， 对结果进行统计分析， 通过比较糖尿病性视网膜病变 患者、 年龄相关性黄斑变性伴发脉络膜新生血管患者、 白内障患者和正常人的血清样本中 的circ_0002484的表达差异， 判断待测病人的疾病易感性。 0058 六、 结。

25、果判读 0059 图1为实时荧光定量PCR分析circ_0002484在糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患 者、 年龄相关性黄斑变性(AMD)伴发脉络膜新生血管(CNV)患者、 白内障患者和正常人血清 中的相对表达差异(各从每组200例中选取的50例典型病例)。 通过实时荧光定量PCR的方法 说明书 4/6 页 6 CN 111926072 A 6 检测靶点circ_0002484的表达水平并得出非眼底血管性疾病患者(白内障和正常人)的 Ct范围： 6.5-8.8， 见表1。 若待测样本的Ct在健康人的Ct范围内， 或者小于该Ct范围， 认为待测样本为阴性病人； 若Ct大于该Ct范围， 认为其。

26、为阳性病人。 表2为hsa_circ_ 0002484作为生物标记物进行眼底血管性疾病诊断的结果， 可得出hsa_circ_0002484作为 眼底血管性疾病标记物的灵敏度为87.5， 准确度为85。 0060 表1： 各组样本Ct范围 0061 0062 根据上述结果， 分别收取经临床影像学诊断确诊的200例眼底血管性疾病(包括 PDR、 AMD伴发CNV)和200例非眼底血管性疾病患者血清样本， 分别进行hsa_circ_0002484血 清含量分析。 评价基于检测hsa_circ_0002484血清含量的准确度和灵敏度， 结果如表2所 示。 表明hsa_circ_0002484可作为眼底。

27、血管性疾病诊断的生物学标记物用于眼底血管性疾 病的诊断。 0063 表2： hsa_circ_0002484作为生物标记物进行眼底血管性疾病诊断的结果 0064 0065 实施例2circ_0002484作为预后评估标记的可行性应用 0066 步骤一、 获得待检血液样本 0067 收集抗新生血管治疗前后的200例糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者的血清和 200例年龄相关性黄斑变性(AMD)伴发脉络膜新生血管(CNV)患者的血清。 0068 步骤二、 从待检血液样本中提取RNA 0069 a)血清样本或冷冻血清取0.25ml样本移至离心管中， 加1ml Trizol， 用移液枪上 下反复吸打。

28、直至细胞完全裂解。 0070 b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖， 剧烈振 荡15sec， 室温静置5min。 0071 c)4离心， 12,000g15min， 从离心机中小心取出离心管， 此时匀浆液分为三层， 即： 无色的上清液、 中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。 吸取上清液转移至另一新 的离心管中(切忌吸出白色中间层)。 0072 d)向上清液中加入1倍体积异丙醇， 涡旋充分混匀。 0073 e)4离心， 12,000g10min， 一般在离心后， 试管底部会出现沉淀， 弃上清。 0074 f)加入1ml 75乙醇， 用手轻轻颠倒。

29、， 12,000g离心5min， 弃去上清。 0075 g)加入1ml无水乙醇， 用手轻轻颠倒， 12,000g离心5min， 弃去上清。 0076 h)室温晾干加入适量的DEPC H2O溶解(65促溶10-15min)， 必要时可用移液枪轻 轻吹打沉淀。 0077 i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。 0078 步骤三、 将获得的RNA逆转录成cDNA 说明书 5/6 页 7 CN 111926072 A 7 0079 采用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit， 按照试剂盒提供的体系(25 L) 配置如下： 5PrimeScript。

30、TM Buffer 4 L， PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 1 L、 Oligo dT Primer(50 M)1 L、 Random 6mers(100 M)4 L， total RNA 2 L， RNase free ddH2O 13 L。 按下面程序反转为cDNA： 37 15min， 85 5sec， 得到的cDNA放于-20中保存。 0080 步骤四、 实时荧光定量PCR 0081 取本发明所述试剂盒的PCR反应体系(50 L)， 采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq， 按照说明书提供的体系配置如下： SYBR Premix Ex T。

31、aq 25 L， 特异性的qRT-PCR上游 引物、 下游引物各1 L(特异性识别hsa_circ_0002484或GAPDH)， 待测样品cDNA 2 L， RNase free ddH2O补足至50 L。 0082 PCR条件： 92， 5min， (92， 30sec； 56， 30sec； 72， 30sec， 38个循环)， 72， 5min。 0083 五、 数据分析 0084 基因表达值用Delta Ct的方法计算， 假设目的基因和参照基因扩增效率都接近 100且相对偏差不超过1Ct； Ct目的基因Ct均数-参照基因Ct均数， 其中参照基因选择 GAPDH； 分别确定正常人和眼底。

32、血管性疾病病人的Ct范围。 0085 六、 结果判断 0086 计算出待测样本的Ct， 分析其在抗新生血管治疗前后的变化情况。 结果如图2所 示： 收集抗新生血管治疗前后的糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者和老年黄斑变性(AMD) 患者伴发脉络膜新生血(CNV)患者抗新生血管治疗前后的血清标本； 采用Trizol试剂提取 总RNA， 通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA； 通过实时荧光定量PCR的方法分别检测靶 点circ_0002484的表达水平(各从200例中选取的50例典型病例， 如图2所示)。 图2为实时荧 光定量PCR分析circ_0002484在抗新生血管治疗前后PDR患。

33、者和AMD伴发CNV患者血清中的 表达差异， 结果表明circ_0002484在接受抗新生血管治疗后的PDR患者和AMD伴发CNV患者 血清中表达明显下调， 说明circ_0002484有望成为评估抗新生血管治疗疗效及预后情况的 靶标。 0087 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 111926072 A 8 序列表 蒋沁 一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、 诊断试剂盒及应用 5 SIPOSequenceListing 1.0 1 10。

34、74 DNA circ_0002484 1 gacatttctg atttatttgc atccttgaag agcatctgta gaagaggaag taaaagatgg 60 gtgtgaaaac atttactcat agctcctctt cccacagcca ggaaatgctt ggaaagctaa 120 atatgctgcg aaatgatgga catttttgtg atatcactat tcgtgtccag gacaaaatct 180 tccgggcaca taaggtggta ctagcagctt gcagtgattt ctttcgcacc aaacttgtag 240。

35、 gccaagccga ggatgagaac aagaatgtgt tggatctgca tcatgttaca gtgactggct 300 ttatacctct tttagaatat gcttacacag ccactctatc aattaacaca gaaaatatta 360 ttgatgttct agcagcagcc agctatatgc aaatgttcag tgttgccagc acctgctcag 420 agttcatgaa atcaagcatt ttatggaata cacccaacag ccaacctgaa aagggtctag 480 atgctggaca agaaaata。

36、at tctaactgca attttacttc tcgagatggg agcatttctc 540 ccgtgtcctc agagtgcagt gtggtagaaa gaaccattcc tgtctgccga gaatcccgga 600 gaaagcgcaa aagctacatt gttatgtctc ctgaaagtcc tgtaaagtgt ggcacacaaa 660 caagctcacc ccaggtattg aattcttcag cttcctactc agaaaataga aaccaaccag 720 ttgactcttc cttagctttt ccttggactt ttcctt。

37、ttgg aattgatcga aggattcagc 780 ctgagaaagt taagcaagca gaaaataccc ggactttaga attacctggc ccatctgaga 840 ccggtagaag aatggctgat tatgtgactt gtgagagcac aaaaactacc ttgcctttag 900 gtaccgaaga agatgtccgg gtcaaagtag aaagattaag tgatgaggag gtccatgagg 960 aagtgtccca gcctgtcagt gcatctcaga gttcgctgag tgatcagcag acag。

38、ttccag 1020 gaagtgaaca agtccaagag gaccttctga ttagtccaca gtcttcctct atag 1074 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 gtaagacccc tggaccacca 20 3 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 序列表 1/2 页 9 CN 111926072 A 9 3 caaggggtct acatggcaac t 21 4 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 cagtcttcct ctataggaca tt 22 5 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 gtccatcatt tcgcagcata 20 序列表 2/2 页 10 CN 111926072 A 10 图1 图2 说明书附图 1/1 页 11 CN 111926072 A 11 。