用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010821052.0 (22)申请日 2020.08.14 (71)申请人 福建医科大学附属协和医院 地址 350000 福建省福州市鼓楼区新权路 29号福建医科大学附属协和医院 (72)发明人 陈良万柴天赐 (74)专利代理机构 成都鱼爪智云知识产权代理 有限公司 51308 代理人 代述波 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/24(2006.01。

2、) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人 脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 (57)摘要 本发明提出了一种用于治疗心肌梗死的高 表达IL10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备 方法， 涉及生物技术领域。 该制备方法包括如下 步骤： 培养过表达IL10的人脂肪间充质干细胞， 收集细胞培养液； 将细胞培养液差速离心， 收集 上清液， 将上清液超速离心， 获得目的微球， 再将 目的微球过滤、 纯化和灭菌， 即得到所述外泌体。 本发明的优点在于， 通过培养过表达IL10的人 脂肪间充质干细胞， 制备得到过表达IL10的人 脂肪间充质干细胞外泌。

3、体， 该过表达IL10的人 脂肪间充质干细胞外泌体含有大量IL10和其他 多种RNA及细胞因子， 有效修复梗死的心肌细胞， 增强心脏功能， 降低代偿性心肌负荷， 缓解心衰， 为心肌梗死提供一种治疗药物或者治疗策略。 权利要求书1页 说明书12页 附图4页 CN 111925983 A 2020.11.13 CN 111925983 A 1.一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法， 包括如下步骤： 培养过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞， 收集细胞培养液； 将细胞培养液 差速离心， 收集上清液， 将上清液超速离心， 获得目的微球， 再将目的微球过滤、 纯化和。

4、灭 菌， 即得到所述外泌体。 2.根据权利要求1所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法， 其特 征在于， 所述过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞通过如下方式制备而成： 制备IL-10过表 达载体， 将IL-10过表达载体转染入所述人脂肪间充质干细胞， 筛选鉴定， 得到过表达IL-10 的人脂肪间充质干细胞。 3.根据权利要求2所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法， 其特 征在于， 将IL-10过表达载体转染入所述人脂肪间充质干细胞所用工具包括腺病毒、 慢病 毒、 Lip2000和Lip3000。 4.根据权利要求3所述的高表达IL-10的人脂肪间充质。

5、干细胞外泌体的制备方法， 其特 征在于， 所述鉴定筛选包括向所述人脂肪间充质干细胞中加入700 g/mL的G418， 培养10 14天。 5.根据权利要求4所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法， 其特 征在于， 所述人脂肪间充质干细胞通过消化人体脂肪组织、 接种和传代培养制得， 消化所述 人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.060.16的IV型胶原酶和质量百分数为0.015 0.02的BSA。 6.根据权利要求5所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法， 其特 征在于， 所述人脂肪间充质干细胞为P2P8代。 7.根据权利要求6所述的高表达IL-10的人脂肪。

6、间充质干细胞外泌体的制备方法， 其特 征在于， 消化所述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.1的IV型胶原酶和质量百分数为 0.02的BSA， 消化的时间为3035min。 8.根据权利要求1-7任意一项所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 其特征在于， 培养所述人脂肪间充质干细胞的培养液为体积百分数为10的无外 泌体的胎牛血清培养基。 9.根据权利要求1-7任意一项所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 其特征在于， 接种时， 所述人脂肪间充质干细胞接种的密度为26104cells/cm2。 10.根据权利要求1-7任意一项所述的高表达IL-1。

7、0的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 其特征在于， 对所述上清液进行超速离心时， 所述差速离心包括以1500g离心10min 后再以10000g离心10min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111925983 A 2 一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细 胞外泌体的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 涉及一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10 的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法。 背景技术 0002 冠状动脉粥样硬化性心脏病， 是由于脂质代谢不正常， 血液中的脂质沉着在原本 光滑的动脉内膜上， 并逐渐堆积形成白色斑块， 引起血管。

8、腔狭窄或阻塞， 严重可导致冠状动 脉闭塞， 血流中断， 使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死， 造成心肌梗死。 发生 心肌梗死后， 部分心肌细胞由于缺血缺氧难以修复， 使得心脏功能降低， 代偿性心肌负荷增 加， 久而久之会造成心衰等严重并发症。 冠心病发病时， 冠状动脉会闭塞20-30分钟， 这样的 心肌损伤通常为可逆性的， 但是随时间推移， 坏死的心肌量会逐渐增加。 如果冠状动脉闭塞 时间延长至2-6小时， 受累心肌边缘会有波浪状纤维形成， 超过6小时至梗死后3天， 心肌会 呈凝固性坏死、 间质充血、 水肿和中性粒细胞浸润。 如果有足够量的心肌受累， 可诱发心室 舒张和收缩功能障碍， 。

9、产生一系列的血流动力学变化。 0003 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。 由于心肌梗死的高致死率以及干 细胞较强的分化能力， 以干细胞为基础的细胞治疗成为心肌梗死的研究热点。 虽然利用干 细胞治疗心肌梗死理论上安全可行， 但是细胞移植后在损伤区域分布的数量及滞留率是否 足以治疗或保护心肌梗死细胞还有待研究。 众所周知， 细胞在移植后凋亡较快， 凋亡过程中 产生的活性物质是否致瘤也不明确。 因此， 深入研究干细胞对心肌梗死产生的治疗或保护 作用以及寻找干细胞治疗心肌梗死的新的靶点和方法具有重要意义。 0004 脂肪间充质干细胞是干细胞中优势较明显的一种， 相对于其他干细胞， 具有一些 。

10、特殊的优点： 如取材方便、 来源广泛、 更强的增殖、 分化能力、 成瘤率低以及不涉及社会和道 德伦理等方面的争议。 多项研究表明， 脂肪间充质干细胞分泌物中含有大量的细胞因子和 蛋白等， 可用于多种疑难杂症的治疗， 是一种来源极为广泛， 取材简单且方便的新型生物医 学材料。 然而， 目前脂肪间充质干细胞也存在普通干细胞常见的一些问题， 比如虽然脂肪间 充质干细胞含有较多的生物活性因子， 但这些生物活性因子的含量低、 性质不稳定、 在病灶 区域滞留率低， 这些问题都极大程度的限制了脂肪间充质干细胞在临床上的广泛应用。 0005 外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜囊泡，。

11、 其 中包含DNA片段、 mRNA、 功能蛋白及转录因子等多种具有生物活性的物质， 外泌体的膜结构 还可表达多种抗原、 抗体分子， 这些生物活性物质进入靶细胞， 可参与调节靶细胞内的多种 生理生化过程， 进而产生各种生物学效应。 外泌体的发现， 为干细胞以及脂肪间充质干细胞 心肌梗死方面的进一步应用提供了思路。 虽然目前有研究表明， 干细胞来源的外泌体在心 肌梗死方面作用显著， 其能够抑制心机细胞凋亡、 促进新生血管生成、 改善心肌梗死后心肌 细胞的功能。 但由于不同来源的干细胞的表达的外泌体中生物活性物质有很大差异， 脂肪 间充质干细胞来源的外泌体是否表达能治疗心肌梗死的活性物质还需要较多研。

12、究证明。 说明书 1/12 页 3 CN 111925983 A 3 0006 白介素-10(IL-10)是一种多细胞源、 多功能的细胞因子， 能参与调解细胞的生长 与分化， 参与炎性反应和免疫反应， 是目前公认的验证与免疫抑制因子。 有研究表明， IL-10 可以促进IL-1受体拮抗剂表达， 有利于抗动脉粥样硬化， 提示其可能在冠心病治疗中发挥 一定的作用。 外源性补充IL-10可作为冠状动脉粥样硬化性心脏病引起的心肌梗死的新途 径。 但外源性IL-10在受损区域的留滞率和机体本身的排异反应都会影响其功能， 如何使 IL-10能在心肌梗死受损区域稳定的发挥作用， 还有待进一步研究。 0007。

13、 本发明通过构建SD大鼠， 验证过表达IL-10的脂肪间充质干细胞来源的外泌体对 心肌细胞的保护作用， 并以此构建脂肪间充质干细胞系， 为过表达IL-10的脂肪间充质干细 胞来源的外泌体用于治疗心肌梗死提供技术支持。 发明内容 0008 本发明的目的在于提供一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干 细胞外泌体的制备方法， 制备的人脂肪间充质干细胞外泌体可有效修复心肌梗死细胞。 0009 本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。 0010 本申请实施例提供一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞 外泌体的制备方法， 包括如下步骤： 培养过表达IL-10的人。

14、脂肪间充质干细胞， 收集细胞培 养液； 将细胞培养液差速离心， 收集上清液， 将上清液超速离心， 获得目的微球， 再将目的微 球过滤、 纯化和灭菌， 即得到前述外泌体。 0011 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 前述过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞通过如下方式制备而成： 制备IL-10过表 达载体， 将IL-10过表达载体转染入前述人脂肪间充质干细胞， 筛选鉴定， 得到过表达IL-10 的人脂肪间充质干细胞。 0012 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 将IL-10过表达载体转染入。

15、前述人脂肪间充质干细胞所用工具包括腺病毒、 慢病 毒、 Lip2000和Lip3000。 0013 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 前述鉴定筛选包括向前述人脂肪间充质干细胞中加入700 g/mL的G418， 培养10 14天。 0014 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 前述人脂肪间充质干细胞通过消化人体脂肪组织、 接种和传代培养制得， 消化前述 人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.060.16的IV型胶原酶和质量百分数为0.015 0.02的BSA。 0015 在本发明的一些实施例中，。

16、 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 前述人脂肪间充质干细胞为P2P8代。 0016 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 消化前述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.1的IV型胶原酶和质量百分数为 0.02的BSA， 消化的时间为3035min。 0017 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 培养前述人脂肪间充质干细胞的培养液为体积百分数为10的无外泌体的胎牛血 说明书 2/12 页 4 CN 111925983 A 4 清培养基。 0018 在本发明的一些实施例中，。

17、 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 接种时， 所述人脂肪间充质干细胞接种的密度为26104/cm2。 0019 在本发明的一些实施例中， 上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制 备方法， 对所述上清液进行超速离心时， 前述差速离心包括以1500g离心10min后再以 10000g离心10min。 0020 相对于现有技术， 本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果： 0021 本发明提供的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法， 通过采用 特定的方法分离培养人脂肪间充质干细胞， 再向该人脂肪间充质干细胞稳定过表达IL-10， 并以特定的方式。

18、收集外泌体， 整个过程简单方便， 得到的外泌体效果稳定， 同时， 由于过表 达了IL-10， 使得制得的外泌体修复能力相对于未过表达IL-10的外泌体大大增强。 由于梗 死的心肌细胞较难修复， 以至于心脏功能降低， 代偿性心肌负荷增加， 最终造成心衰等严重 并发症等问题， 但本发明提供的外泌体富含多种生物活性成分， 可有效缓解心肌梗死后心 肌细胞的损伤， 其效果优于未转染IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。 附图说明 0022 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对。

19、 范围的限定， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。 0023 图1是本发明实施例1中酶解液浓度筛选结果I； 0024 图2是本发明实施例1中不同酶解液筛选结果II； 0025 图3是本发明实施例1中原代细胞的鉴定结果； 0026 图4是本发明实施例2和5中不同提取条件下的外泌体相对表达量； 0027 图5是本发明实施例2和5中不同来源人脂肪间充质干细胞外泌体的鉴定结果； 0028 图6是本发明实施例3中传代细胞的鉴定结果； 0029 图7是本发明实施例4中稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞中IL-10的表达 情况； 003。

20、0 图8为本发明实施例7的结果示意图。 具体实施方式 0031 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、 完整地描述。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建 议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产 品。 0032 需要说明的是， 在不冲突的情况下， 本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。 下面将参考具体实施例来详细说明本发明。 0033 本申请实施例提供一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞 外泌体的制备方法， 包括如下步骤： 培养过表达IL-10的人。

21、脂肪间充质干细胞， 收集细胞培 说明书 3/12 页 5 CN 111925983 A 5 养液； 将细胞培养液差速离心， 收集上清液， 将上清液超速离心， 获得目的微球， 再将目的微 球过滤、 纯化和灭菌， 即得到所述外泌体。 0034 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。 0035 实施例1 0036 本实施例的目的在于， 分离培养人脂肪间充质干细胞。 0037 1.材料 0038 准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪， 已签署知情同意书)、 PBS、 BSA、 IV型 胶原酶、 胎牛血清、 CD29+、 CD44+、 CD90+、 CD34-和CD45-的单克隆抗体。。

22、 0039 2.方法 0040 2.1人脂肪间充质干细胞的分离 0041 (1)无菌条件下收集脂肪组织约15mL， 去除脂肪组织表面的结缔组织包膜及血管； 0042 (2)迅速剪碎至糊状， 加入不含外泌体的培养基3mL， 不含外泌体的培养基中包含 终浓度为0.060.16的IV型胶原酶和0.0150.02的BSA， 37恒温120r/min振荡消化 3035min， 随时观察组织消化状态， 期间每隔58min取出混匀， 终止消化后用100目和200 目筛网依次过滤， 去除未消化组织， 收集滤液； 不同的消化条件对分离出的原代细胞的的活 性及后续的增殖率影响较大， 因此， 本实施例中探讨不同消化。

23、条件对细胞活性和细胞增殖 率的影响。 消化条件分组如下： 0043 表1消化条件 0044 0045 0046 (3)将步骤(2)中所获得的滤液以1500r/min离心15min， 弃上清， 得到沉淀； 0047 (4)将沉淀用37PBS轻轻吹打清洗23遍， 再向沉淀中加入含体积分数为10的 无外泌体的胎牛血清的培养基重悬， 26104cells/cm2的密度接种， 于37、 5CO2、 100相对湿度的培养箱中培养， 培养1214h后， 首次换液， 换液动作要轻， 防止刚贴壁的 说明书 4/12 页 6 CN 111925983 A 6 细胞被换下， 之后每48h更换1次新鲜培养基并用显微镜。

24、观察细胞形态。 0048 2.2细胞增殖率分析 0049 于固定时间向细胞中加入20 L MTT溶液(5mg/mL)， 于37培养箱孵育4h后吸除上 清液， 每孔加入150 L二甲基亚砜。 摇床震荡10min， 酶联免疫检测细胞490nm波长检测各孔 光密度(OD)值。 计算均值， 以时间为横坐标， (特定时间点光密度-第0天光密度)/第0天光密 度*100， 即为不同时间点细胞的增殖率， 以此为纵坐标绘制生长曲线。 0050 2.3细胞表面标志蛋白检测 0051 显微镜下观察细胞状态及细胞融合度， 待细胞状态良好且融合度超过95时， 消 化细胞， 待细胞边缘开始脱离培养板后， 加入培养基中止。

25、消化， 离心后取沉淀， 再用新鲜培 养基重悬细胞调整细胞浓度， 准备多个离心管， 分别加入含1106个细胞的细胞悬液， 再分 别加入粘附分子受体表达标记物CD29+和CD44+、 干细胞标记物CD90+以及造血细胞标记物 CD34-和CD45-， 孵育后上机检测。 0052 3.结果 0053 3.1不同消化条件得到的h-MSCs的细胞活性 0054 消化结果如图1所示， 由图1可知， 0.1IV型胶原酶组的细胞活性显著(P0.05)高 于0.12IV型胶原酶， 极显著高于其他组的细胞活性(P0.01)， 当加入0.0150.02的 BSA进行消化时， 0.015BSA能一定程度提高得到的h-。

26、MSCs的细胞活性， 但不具有统计学上 的显著差异， 0.02BSA能显著提高0.1IV型胶原酶消化的h-MSCs的细胞活性(P0.05)。 0055 3.2不同消化条件得到的h-MSCs的细胞增殖率 0056 细胞增殖率结果如图2所述(除4、 7和8组外， 其他组未示出)， 相对于0.1IV型胶 原酶组， 虽然加入0.0150.02的BSA进行消化时， 对h-MSCs的细胞活性无统计学意义上 的提升， 但添加0.02的BSA能极显著提升相应时间点h-MSCs的早期增殖(第13d， 尤其是 12d)(P0.01)， 0.015的BSA能显著提升h-MSCs的早期增殖(第13d， 尤其是12d)。

27、(P 0.05)， 并且添加一定量的BSA能一定程度延长h-MSCs的对数期。 0057 由此可见， 消化酶液中IV型胶原酶的浓度优选为0.1IV型胶原酶， 而BSA的浓度 优选为0.02。 0058 3.3h-MSCs鉴定结果 0059 电镜观察细胞形态发现， 该细胞为成纤维样， 呈涡旋状。 取0.1IV型胶原酶+ 0.02的BSA组培养5d后的细胞， 以流式测量h-MSCs表面标志蛋白CD29+、 CD44+、 CD90+、 CD34-和CD45-， 结果如图3所示， 由此可见， 该细胞高表达粘附分子受体表达标记物CD29+和 CD44+、 干细胞标记物CD90+， 低表达造血细胞标记物C。

28、D34-和CD45-， 该结果符合国际细胞治 疗协会对MSCs的鉴定标准。 因此， 本实施例分离的细胞为h-MSCs。 0060 实施例2 0061 本实施例的目的在于， 分离并提纯人脂肪间充质干细胞来源的人脂肪间充质干细 胞外泌体， 包括如下步骤： 0062 1.材料方法 0063 准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪， 已签署知情同意书)、 PBS、 BSA、 IV型 胶原酶、 胎牛血清、 CD9、 CD63、 CD81、 -actinin-4和CD40的单克隆抗体以及二甲基乙二酰基 甘氨酸。 说明书 5/12 页 7 CN 111925983 A 7 0064 2.收集人脂肪间充质干细。

29、胞外泌体 0065 (1)收集人脂肪间充质干细胞， 接种， 用无外泌体的血清培养基在37、 5CO2条 件下开始培养； 0066 (2)培养12h后， 换入含有300 mol/L二甲基乙二酰基甘氨酸的无人脂肪间充质干 细胞外泌体的血清培养基， 继续培养36h， 收集细胞培养液； 0067 (3)将步骤(2)中得到的细胞培养液于4进行差速离心， 即在1500g条件下离心 10min， 再以10000g离心10min去除细胞碎片和大分子蛋白质后， 得到上清液； 0068 (4)将步骤(3)中的上清液进行超速离心， 即在100000g超速离心2h， 收集沉淀， 即 获得目的微球； 0069 (5)向。

30、步骤(4)中的目的微球中加入生理盐水重悬， 得到重悬液， 再将重悬液用 0.22 m过滤膜过滤， 去除凋亡小体和微泡， 再将过滤后的目的微球进行纯化， 得到纯化后的 人脂肪间充质干细胞外泌体(EVs)， 将纯化后的人脂肪间充质干细胞外泌体灭菌后即得到 人脂肪间充质干细胞外泌体； 0070 (6)电子显微镜鉴定上述人脂肪间充质干细胞外泌体； 并利用Elisa对得到的人脂 肪间充质干细胞外泌体进行鉴定。 0071 3.结果 0072 3.1本实施例分组信息 0073 本实施例中， 按照下述方式进行分组探索添加二甲基乙二酰基甘氨酸及差速离心 对外泌体含量的影响，“+” 表示按照加入二甲基乙二酰基甘氨。

31、酸或差速离心，“-” 代表不添 加二甲基乙二酰基甘氨酸或者按照常规方式离心。 具体如表2所示： 0074 表2分组信息 0075 组别二甲基乙二酰基甘氨酸差速离心 A- B+- C-+ D+ 0076 3.2外泌体表达量及电镜检查结果 0077 由图4可知， 相对于不添加二甲基乙二酰基甘氨酸， 不采用差速离心的A组， 添加二 甲基乙二酰基甘氨酸并利用差速离心的D组能有效提升人脂肪间充质干细胞外泌体的含量 (P0.01)。 使用电子显微镜对步骤(6)中得到的人脂肪间充质干细胞外泌体的形态进行鉴 定， 结果显示， 人脂肪间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形， 有完整薄膜结构， 直径在40 120nm。。

32、 0078 3.3Elisa检测结果 0079 利用Elisa对得到的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定， EVs标记物包括CD9、 CD63、 CD81、 -actinin-4和CD40， 检测结果表示(如图5所示)， 该人脂肪间充质干细胞外泌 体能表达外泌体标志物CD9、 CD63、 CD81、 -actinin-4和CD 40。 由此可见， 本实施例制备的 外泌体为人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。 0080 需要注意的是， 本实施例中涉及的人脂肪间充质干细胞培养步骤未说明的地方， 则与实施例1相同。 说明书 6/12 页 8 CN 111925983 A 8 0081 实施例3 0082 。

33、本实施例的目的在于培养h-MSCs细胞系。 0083 1.材料 0084 准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪， 已签署知情同意书)、 PBS、 BSA、 IV型 胶原酶、 胎牛血清、 CD29+、 CD44+、 CD90+、 CD34-和CD45-的单克隆抗体。 0085 2.h-MSCs传代 0086 (1)按实施例1中所示方法收集脂肪组织， 以0.1IV型胶原酶+0.02BSA组的消 化条件消化后， 按照实施例1中所述方法培养细胞至8090融合时， 用0.25胰酶- 0.02EDTA消化， 离心后得到细胞沉淀； 0087 (2)将细胞沉淀用新鲜无外泌体的培养基重悬， 按照1:24传代，。

34、 培养至P10， 每代 细胞分别命名为P1-h-MSCs、 P2-h-MSCs、 P3-h-MSCs、 P4-h-MSCs、 P5-h-MSCs、 P6-h-MSCs、 P7- h-MSCs、 P8-h-MSCs、 P9-h-MSCs和P10-h-MSCs； 0088 (3)收集P2-h-MSCs、 P5-h-MSCs、 P8-h-MSCs和P10-h-MSCs， 分别消化后制成单细胞 悬液， 分别通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记CD29+、 CD44+、 CD90+、 CD34-和CD45-的表 达。 0089 3.结果 0090 3.1不同传代比例对细胞增殖率的影响 0091 不同传代条。

35、件的细胞传代时间和细胞增殖率如表3所示， 由表3可知， 按照1:3比例 传代， 细胞的增殖率显著大于同期按1:2传代比例得到的细胞的增殖率(P0.05)， 极显著高 于同期按1:4传代比例得到的细胞的增殖率(P0.01)， 由此可见， 按1:3传代能得到最佳传 代时间间隔和细胞增殖率， 利于后期试验的进行。 0092 表3不同传代条件的细胞传代时间和细胞增殖率 0093 0094 3.2不同代细胞的细胞标志物表达情况 0095 流式检测结果表明， 如图6所示， 本实施例培养的人脂肪间充质干细胞的细胞形态 良好， P2P8中CD29+、 CD44+和CD90+高表达， CD34-和CD45-基本。

36、不表达， P10中CD29+、 CD44+和 CD90+表达开始下降， 但CD34-和CD45-依然不表达。 由此可见， 本实施例提供的分离培养方法 和传代方法， 能得到稳定的人脂肪间充质干细胞， 至少可顺利传到至P8。 0096 本实施例通过选择适宜的消化体系消化脂肪组织， 并通过贴壁筛选， 形成了一种 简单高效的分离培养人脂肪间充质干细胞的方法。 结果显示， 本实施例特定比例的胶原酶 浓度和消化条件可以有效分离纤维结缔组织与脂肪组织， 并提高原代细胞的浓度、 纯度和 说明书 7/12 页 9 CN 111925983 A 9 活性， 使原代细胞至少能稳定传代至P8。 0097 实施例4 0。

37、098 本实施例的目的在于， 构建稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞。 0099 1.构建IL-10过表达载体 0100 (1)在NCBI数据库中查找人IL-10的编码区， 利用primer 5.0设计引物， 并送往华 大基因合成， 得到引物组； 0101 (2)利用RNA试剂盒提取人白细胞mRNA， 再通过反转录试剂盒合成cDNA， 以cDAN为 模板， 利用步骤(1)中得到的引物组， 通过RT-PCR扩增IL-10编码区， 酶切回收IL-10编码区 目的片段， 将该目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(A)， 筛选阳性克隆， 将阳 性克隆送至生物公司测序， 将测。

38、序正确的阳性克隆的菌液保存备用； 0102 (3)将步骤(2)得到的菌液按1:50的体积比接种至新鲜培养基中， 37震荡培养过 夜， 收集菌液， 将菌液离心后取沉淀， 得到菌体沉淀， 利用质粒抽提试剂盒按照说明书提取 菌体沉淀中的质粒， 将得到的质粒利用PCR鉴定， 鉴定正确的质粒即为IL-10过表达载体 pcDNA3.1-IL-10； 0103 2.人脂肪间充质干细胞G418浓度筛选 0104 (1)取实施例3中的人脂肪间充质干细胞， 优选P2P8代， 解冻复苏后， 以26 104cells/cm2的密度接种， 于37、 5CO2、 100相对湿度的培养箱中培养； 0105 (2)待步骤(1。

39、)中细胞培养至贴壁后， 将细胞分为pcDNA3.1-IL-10转染组(过表达 IL-10)和pcDNA3.1空载组， 分别换入含有0 g/mL、 200 g/mL、 400 g/mL、 700 g/mL、 1100 g/ mL和1500 g/mL G418的新鲜培养基， 每隔3天换入对应浓度的新鲜培养基， 连续观察7天， 其 中700 g/mL组导致未转染组细胞完全死亡， 由此可见， 后续筛选可以将700 g/mL作为筛选 浓度。 0106 3.人脂肪间充质干细胞转染 0107 (1)取实施例3中的人脂肪间充质干细胞， 优选P2P8代， 解冻复苏后， 以26 104cells/cm2的密度接种。

40、， 于37、 5CO2、 100相对湿度的培养箱中培养； 0108 (2)待细胞汇合度达到8090时， 制备转染混合液， 转染混合液制备过程如 下， 将0.3 g IL-10溶于100 L Opti-MEM无血清培养基中， 混匀， 制成A液体， 再将10 L Lipofectamine 2000TM溶于100 L Opti-MEM无血清培养基， 混匀， 得到B溶液， 室温静置 5min， 将A液和B液混合制成转染复合体， 并将细胞培养基换为Opti-MEM无血清培养基， 再将 转染复合体滴入细胞， 培养46h后换成完全培养基继续培养3d； 0109 (3)按步骤(2)中细胞按照1:3传代， 加。

41、入含700 g/mL G418的新鲜培养基， 每隔3天 换入对应浓度的新鲜培养基， 筛选1014d， 没有转染入pcDNA3.1-IL-10的人胚胎间充质干 细胞死亡， 转染入pcDNA3.1-IL-10的人胚胎间充质干细胞出现抗性克隆； 0110 (4)将步骤(3)中克隆消化稀释后进行扩大培养， 最终得到稳定过表达IL-10的人 脂肪间充质干细胞； 0111 (5)取部分扩大培养的细胞分别提取总RNA和蛋白， 利用RT-qPCR和Western Blotting检测IL-10表达情况。 结果如图7所示， 表明稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细 胞构建成功。 0112 实施例5 说明书 8。

42、/12 页 10 CN 111925983 A 10 0113 本实施例的目的在于， 制备稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌 体。 0114 1.材料方法 0115 PBS、 BSA、 IV型胶原酶、 胎牛血清、 CD9、 CD63、 CD81、 -actinin-4和CD40的单抗、 二 甲基乙二酰基甘氨酸和实施例4中稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞。 0116 2.收集稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体 0117 (1)收集实施例4提供的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞， 接种， 在无外泌 体的血清培养基在37、 5CO2条件下开始培养； 。

43、0118 (2)培养12h后， 换入含有300 mol/L二甲基乙二酰基甘氨酸的无外泌体的血清培 养基， 继续培养36h， 收集细胞培养液； 0119 (3)将步骤(2)中得到的细胞培养液于4进行差速离心， 即在1500g条件下离心 10min， 再以10000g离心10min去除细胞碎片和大分子蛋白质后， 得到上清液； 0120 (4)将步骤(5)中的上清液进行超速离心， 即在100000g超速离心2h， 收集沉淀， 即 获得目的微球； 0121 (5)向步骤(4)中的目的微球中加入生理盐水重悬， 得到重悬液， 再将重悬液用 0.22 m过滤膜过滤， 去除凋亡小体和微泡， 再将过滤后的目的微。

44、球进行纯化， 得到纯化后的 外泌体(EVs)， 将纯化后的外泌体灭菌后即得到外泌体； 0122 (6)电子显微镜鉴定上述人脂肪间充质干细胞外泌体； 并利用Elisa对得到的人脂 肪间充质干细胞外泌体进行鉴定。 0123 3.结果 0124 3.1外泌体表达量及电镜检查结果 0125 分组信息如表2所示。 由图4可知， 相对于不添加二甲基乙二酰基甘氨酸， 不采用差 速离心的A组， 添加二甲基乙二酰基甘氨酸并利用差速离心的D组能有效提升稳定过表达 IL-10的人脂肪间充质干细胞的外泌体的含量(P0.01)。 0126 3.2Elisa检测结果 0127 利用Elisa对得到的稳定过表达IL-10的。

45、人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定， EVs标记物包括CD9、 CD63、 CD81、 -actinin-4和CD40， 检测结果表示(如图5所示)， 该稳定过 表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体能表达外泌体标志物CD9、 CD63、 CD81、 -actinin- 4和CD 40。 0128 实施例6 0129 本实施例的目的在于， 构建心肌梗死SD大鼠模型。 0130 心肌梗死SD大鼠模型具体构建方法如下： 0131 (1)饲养SPF级SD雄性大鼠至23月龄， 体重为2.5921g； 0132 (2)利用水合氯醛溶液(10w/v)进行腹腔注射麻醉， 每只SD雄性大鼠麻醉时水合 氯醛溶液。

46、(10w/v)的用量为0.3mL/100g； 0133 (3)调整麻醉后的SD雄性大鼠的呼吸频率至70次/分， 吸气/呼气比值至1:3， 潮气 量约为3mL/100g， 同时进行呼吸机辅助呼吸； 0134 (4)冠脉结扎： 在麻醉后的SD雄性大鼠的左侧胸部常规脱毛并消毒， 依次切开皮 肤、 浅筋膜和深筋膜， 用止血钳钝性分离胸大肌和前锯肌交界处， 在靠胸骨缘处用止血钳钝 说明书 9/12 页 11 CN 111925983 A 11 性分离第3-4肋间进胸， 剪断第3-4肋软骨， 撑开肋间露出心脏， 用两个带橡皮圈的小拉钩拉 开手术切口两侧组织， 用湿润的棉签小心推开心脏周围的肺组织， 扩大手。

47、术视野， 用镊子提 起心包壁层， 再用眼科剪小心剪开心包， 棉签向上推开胸腺即可清楚暴露左冠状静脉， 以左 冠状静脉为标志， 用7-0眼科无创带线缝合针穿过其深部， 进针深度为0.51.0mm并打结， 在大鼠左心耳与肺动脉圆椎间， 距主动脉根部约3mm结扎冠状动脉； 0135 (5)术后处理： 术毕， 将步骤(4)中大鼠放入小饲养笼中， 30条件下苏醒， 每只存 活的大鼠放入小饲养笼中单独饲养(主要防止术后因为大鼠的伤口或者血腥味相互打斗)， 共饲养7d， 术后肌肉注射青霉素预防感染并给予姜黄素腹腔注射治疗。 将饲养7d后的小鼠 分组备用。 0136 实施例7 0137 本实施例的目的在于， 。

48、验证实施例5提供的外泌体对心肌梗死SD大鼠模型中梗死 心肌组织修复的影响。 0138 将实施例6中存活的心肌梗死SD大鼠均分为3组， 编号为A、 B、 C、 D、 E， 分别注射生理 盐水、 实施例1提供的脂肪间充质干细胞、 实施例2提供的人脂肪间充质干细胞外泌体、 实施 例4提供的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞和实施例5提供的外泌体。 A组为心肌梗 死模型组， 每次按0.5ml/只注射生理盐水； B组为人脂肪间充质干细胞组， 按照0.5ml/只注 射实施例1提供的人脂肪间充质干细胞悬液， 人脂肪间充质干细胞悬液中细胞密度为5 105cells/ml； C组按0.5ml/只注射实施例。

49、2提供的外泌体； D组按0.5ml/只注射实施例4提供 的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞， 细胞密度为5105cells/ml； E组按0.5ml/只 注射实施例5提供的外泌体。 AE五组分别处理3次， 每隔5d处理一次。 0139 处理结果如图8和表4所示。 图8中AE图以及表4中的AE组均分别对应本实施例 中AE组。 0140 表4不同处理方式处理心肌梗死SD大鼠后的结果 0141 0142 由图8可知， A组注射生理盐水后， 梗死面积远远大于注射脂肪间充质干细胞的B 组， 而B组和D组的梗死面积又远大于C组和E组的梗死面积(p0.05)， 同时， E组的梗死面积 显著小于C组的。

50、梗死面积， 结合表4， 可以得知， 实施例2和5提供的外泌体可以明显促进梗死 说明书 10/12 页 12 CN 111925983 A 12 后心肌组织修复， 且效果优于脂肪间充质干细胞， 差异显著， 其中， 以实施例4中提供的外泌 体的效果最优。 0143 外泌体作为一种膜囊泡， 可以通过生长因子、 趋化因子、 细胞因子、 转录因子、 基因 和RNA等起到一定的作用。 干细胞本身是具有极大的医用价值的生物材料， 也有较多的干细 胞被应用于心肌梗死、 心理衰竭等心脏疾病及心脏相关的疾病， 目前的研究仍然面临一些 障碍， 比如细胞在损伤区留置率比较低， 细胞植入人体后存活率也比较低。 并且， 。