产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010783221.6 (22)申请日 2020.08.06 (71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研 究所 地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 申请人 浙江国光生化股份有限公司 (72)发明人 吕雪峰柴小高黄雪年周昌 王敏刘璐谢义生周凯华 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 王志新 (51)Int.Cl. C12N 1/15(2006.01) C12N 15/80(2006.01) C12P 7/44。

2、(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (54)发明名称 一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建 方法与应用 (57)摘要 一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建 方法与应用， 属于基因工程领域。 为了提高衣康 酸的产量， 本发明提供了一种产衣康酸的重组土 曲霉菌株， 是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌 的反式乌头酸脱羧酶而获得的； 出发菌株为土曲 霉(Aspergillus terreus)； 所述反式乌头酸脱 羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示， 编码所 述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 本发明提供重组菌株的衣康酸发 酵产量普遍高于出发。

3、菌株， 其中产量最高的菌株 在摇瓶水平上比出发菌株提高了约50， 具有很 强的应用价值。 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图5页 CN 111944706 A 2020.11.17 CN 111944706 A 1.一种产衣康酸的重组土曲霉菌株， 其特征在于， 所述重组土曲霉菌株是在出发菌株 中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的 ； 所述出发菌株为土曲霉 (Aspergillus terreus)。 2.根据权利要求1所述产衣康酸的重组土曲霉菌株， 其特征在于， 所述出发菌株为土曲 霉CICC40205、 土曲霉NRRL1960、 土曲霉DSM23081、 土曲霉TN484。

4、或土曲霉TN484-M1。 3.根据权利要求1所述产衣康酸的重组土曲霉菌株， 其特征在于， 所述反式乌头酸脱羧 酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 4.根据权利要求1所述产衣康酸的重组土曲霉菌株， 其特征在于， 编码所述反式乌头酸 脱羧酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 5.根据权利要求1所述产衣康酸的重组土曲霉菌株， 其特征在于， 所述重组土曲霉菌株 中含有反式乌头酸脱羧酶的表达盒， 所述表达盒由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动 子PgpdAt、 反式乌头酸脱羧酶基因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC组成。 6.根据权利要求5所述产衣康酸的重组土曲霉菌株， 其特。

5、征在于， 所述反式乌头酸脱羧 酶的表达盒核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。 7.一种权利要求1-6任意一项所述产衣康酸的重组土曲霉菌株的构建方法， 其特征在 于， 是在土曲霉菌株中导入编码所述反式乌头酸脱羧酶的基因构建重组土曲霉菌株。 8.根据权利要求7所述的构建方法， 其特征在于， 步骤如下： 1)反式乌头酸脱羧酶表达盒的制备： 将反式乌头酸脱羧酶tad1基因针对土曲霉表达进 行密码子优化， 优化后的反式乌头酸脱羧酶tad1基因的5 端与构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢 酶基因启动子PgpdAt相连， 3 端与构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC相连， 连接后获得反 式乌头酸脱羧酶表达盒； 2。

6、)转化： 将所述反式乌头酸脱羧酶表达盒导入土曲霉， 获得重组土曲霉菌株。 9.权利要求1-6任意一项所述产衣康酸的重组土曲霉菌株在制备衣康酸中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述应用是指将所述重组土曲霉菌株培 养于液体发酵培养基经发酵生产衣康酸。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111944706 A 2 一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体涉及一种产衣康酸的重组土曲霉菌株及其构建方 法与应用。 背景技术 0002 衣康酸(itaconic acid)是目前在聚合物工业中用作单体或共聚单体， 主要用于 合。

7、成腈纶化纤、 树脂、 塑料、 橡胶、 涂料、 表面活性剂、 高分子螯合剂、 造纸、 医药、 农药、 轻工、 食品、 丝绸等领域,也被鉴定为哺乳动物体内产生的具有抗菌活性的代谢物。 0003 在土曲霉中， 衣康酸的代谢途径是由三羧酸循环分流出来的， 三羧酸循环中的顺 乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的催化作用下脱羧形 成衣康酸。 玉蜀黍黑粉菌Ustilago maydis是另外一种能天然合成衣康酸的微生物， 2016年 研究人员发现玉蜀黍黑粉菌的衣康酸合成途径与土曲霉有差异， 它是利用反式乌头酸作为 前体， 在反式乌头酸脱羧酶(tr。

8、ans-aconitate decarboxylase， Tad1)的催化作用下脱羧形 成衣康酸(Elena Geiser,Sandra K Przybilla,Alexandra Friedrich et al,Ustilago maydis produces itaconic acid via the unusual intermediate trans- aconitate.Microbial Biotechnology,2016,9,116126)。 0004 近几十年来提高衣康酸产量的尝试集中在进行传统诱变筛选高产菌株和发酵工 艺优化等方面， 但都没有使得衣康酸的发酵产量得到重大突破。

9、。 发明内容 0005 为了提高衣康酸的产量， 本发明提供了一种产衣康酸的重组土曲霉菌株， 所述重 组土曲霉菌株是在出发菌株中过表达玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶而获得的； 所述出 发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)。 0006 在本发明的一个实施例中， 所述出发菌株为土曲霉CICC40205、 土曲霉NRRL1960、 土曲霉DSM23081、 土曲霉TN484或土曲霉TN484-M1。 0007 在本发明的一个实施例中， 所述反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。 0008 在本发明的一个实施例中， 编码所述反式乌头酸脱羧酶基因的核苷酸序列如SE。

10、Q ID No.2所示。 0009 在本发明的一个实施例中， 所述重组土曲霉菌株中含有反式乌头酸脱羧酶的表达 盒， 所述表达盒由构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt、 反式乌头酸脱羧酶基 因和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC组成。 0010 在本发明的一个实施例中， 所述反式乌头酸脱羧酶的表达盒核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。 0011 本发明还提供了上述产衣康酸的重组土曲霉菌株的构建方法， 是在土曲霉菌株中 导入编码所述反式乌头酸脱羧酶的基因构建获得重组土曲霉菌株。 说明书 1/9 页 3 CN 111944706 A 3 0012 在本发明的一个实施例中， 所述重组。

11、土曲霉菌株的构建方法， 步骤如下： 0013 1)反式乌头酸脱羧酶表达盒的制备： 将反式乌头酸脱羧酶tad1基因针对土曲霉表 达进行密码子优化， 优化后的反式乌头酸脱羧酶tad1基因的5 端与构巢曲霉三磷酸甘油醛 脱氢酶基因启动子PgpdAt相连， 3 端与构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC相连， 连接后获 得反式乌头酸脱羧酶表达盒； 0014 2)转化： 将所述反式乌头酸脱羧酶表达盒导入土曲霉， 获得重组土曲霉菌株。 0015 本发明还提供了上述产衣康酸的重组土曲霉菌株在制备衣康酸中的应用。 0016 在本发明的一个实施例中， 所述应用是指将所述重组土曲霉菌株培养于液体发酵 培养基经发酵生。

12、产衣康酸。 0017 在本发明的一个实施例中， 所述发酵培养基每升配方为： 140gL-1葡萄糖， 2gL- 1NH4NO3， 0.2gL-1(NH4)2HPO4， 20mgL-1FeSO4， 0.4gL-1MgSO4， 40mgL-1ZnSO4， 40mgL-1CuSO4， 余量为 水， PH为3.5。 0018 有益效果 0019 申请人发现顺乌头酸能够自发转化成反式乌头酸， 因此在土曲霉中也会有反式乌 头酸的存在， 据此提出在土曲霉中引入玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶， 在顺乌头酸脱 羧合成衣康酸的基础上再增加一条衣康酸合成途径， 从而强化衣康酸的合成。 0020 本发明所具有的优点： 。

13、本发明提供的基因工程改造土曲霉以提高衣康酸发酵产量 的方法， 相较于传统的物理、 化学等诱变方式， 本发明方法目的明确， 可操作性强， 便于筛 选。 本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株， 其中产量最高的菌株在摇 瓶水平上比出发菌株提高了约50， 具有很强的应用价值。 附图说明 0021 图1为本发明中提到的土曲霉改造产衣康酸代谢途径图； 0022 图2为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒构建在pUC57-Kan载体上； 0023 图3为本发明实施例提供的吡啶硫胺素抗性筛选标记的载体； 0024 图4为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒与吡啶硫胺素抗性筛选标 记表。

14、达盒构建在pEasy-Blunt载体上； 0025 图5为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒和潮霉素抗性元件进行共 转化的示意图； 0026 图6为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达盒和吡啶硫胺素抗性元件进 行共转化的示意图； 0027 图7为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达元件和潮霉素抗性元件构建 成一个表达盒进行土曲霉转化的示意图； 0028 图8为本发明实施例提供的将反式乌头酸脱羧酶表达元件和吡啶硫胺素抗性元件 构建成一个表达盒进行土曲霉转化的示意图； 0029 图9为本发明实施例提供的HPLC分析菌株发酵液中衣康酸的纯度及含量； 0030 图10为本发明实施例提供。

15、的反式乌头酸脱羧酶表达盒与潮霉素B抗性基因hph共 转化获得的重组土曲霉菌株摇瓶发酵产衣康酸能力的比较图； 0031 图11为本发明实施例提供的反式乌头酸脱羧酶基因表达盒与ptrA构建成一个表 说明书 2/9 页 4 CN 111944706 A 4 达盒转化获得的重组土曲霉菌株摇瓶发酵产衣康酸能力的比较图。 具体实施方式 0032 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明， 但本发明不受实施例的限制。 0033 以下实施例中所用材料、 试剂、 仪器和方法， 未经特殊说明， 均为本领域中的常规 材料、 试剂、 仪器和方法， 均可通过商业渠道获得。 0034 本发明中质粒提取采用OMEGA公司Pl。

16、asmidMini KitI试剂盒(D6943-02),DNA片段 回收采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-02) ,凝胶回收采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。 0035 土曲霉CICC40205购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。 0036 土曲霉NRRL1960购买自美国农业菌种保藏中心(ARS Culture Collection)。 0037 土曲霉DSM23081购买自德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulture。

17、n)。 0038 土曲霉TN484， 记载在Yahiro,K.,Takahama,T.,Park,Y.S.,Okabe,M.,Breeding of Aspergillus-Terreus Mutant Tn-484 for Itaconic Acid Production with High- Yield,Journal of Fermentation andBioengineering,1995,79(5):506-508。 0039 土曲霉TN484-M1， 记载在Dwiarti,L.,Yamane,K.,Yamatani,H.,Kahar,P.,Okabe, M.,Purificati。

18、on and characterization of cis-aconitic acid decarboxylase from Aspergillus terreus TN484-M1,J Biosci Bioeng,2002,94(1):29-33。 0040 质粒pSGF957,由Seoul National university得到， 质粒记载在Kim,J.G.,Choi, Y.D.,Chang ,Y.J.,Kim,S.U.,Genetic transformation of Monascus purpureus DSM1379， Biotechnology Letters,2003,2。

19、5,15091514。 0041 IPM液体培养基： 60g L-1葡萄糖， 2g L-1 NH4NO3， 20mg L-1(NH4)2HPO4， 20mg L-1 FeSO4， 0.4g L-1 MgSO4， 4.4mg L-1 ZnSO4， 0.5g/L玉米浆， 余量为水， pH 2.5-5.5。 0042 再生筛选培养基平板PDA-SH： 3.9g L-1马铃薯右旋糖琼脂培养基(DifcoTM Potato Dextrose Agar,BD,LOT:1165825)， 和1.2M山梨醇， 余量为水， 灭菌后冷却至约55时加入 潮霉素B(Solarbio， CatalogNo.： M419。

20、099)至终浓度为100 g/mL， 制备平板。 0043 再生筛选培养基平板CD-SPt： 10g L-1葡萄糖， 3g L-1 NaNO3， 2g L-1 KCl， 1g L-1 KH2PO4， 0.5g L-1 MgSO4， 20mg L-1 FeSO4， 1.5g L-1琼脂， 和1.2M山梨醇， 余量为水， 灭菌后冷 却至约55时加入吡啶硫胺素(Sigma， CatalogNo.： P0256)至终浓度为100 g/L， 制备平板。 0044 筛选培养基平板PDA-H： 3.9g L-1马铃薯右旋糖琼脂培养基(DifcoTM Potato Dextrose Agar,BD,LOT:1。

21、165825)， 余量为水， 灭菌后冷却至约55时加入潮霉素B (Solarbio， CatalogNo.： M419099)至终浓度为100 g/mL， 制备平板。 0045 筛选培养基平板CD-Pt： 10g L-1葡萄糖， 3g L-1 NaNO3， 2g L-1 KCl， 1g L-1 KH2PO4， 0.5g L-1 MgSO4， 20mg L-1 FeSO4， 1.5g L-1琼脂， 余量为水， 灭菌后冷却至约55时加入吡啶 硫胺素(Sigma， CatalogNo.： P0256)至终浓度为100 g/L， 制备平板。 0046 土曲霉产孢培养基： 10gL-1葡萄糖， 2gL-。

22、1 NaNO3， 0.2gL-1 KH2PO4， 5gL-1MgSO4， 0.02mg L-1FeSO4， 0.5gL-1NaCl， 0.04gL-1ZnSO4， 0.04gL-1CuSO4， 0.5麸皮， 1.5琼脂粉， 余 量为水， 115灭菌25min， 制备平板。 说明书 3/9 页 5 CN 111944706 A 5 0047 土曲霉发酵培养基： 140g L-1葡萄糖， 2g L-1NH4NO3， 0.2g L-1(NH4)2HPO4， 20mg L- 1FeSO4， 0.4g L-1MgSO4， 40mg L-1ZnSO4， 40mg L-1CuSO4， 余量为水， 用硫酸调节。

23、pH2.5-5.5。 0048 本发明以土曲霉(Aspergillus terreus)为出发菌株， 通过基因工程改造在出发 菌株基因组中插入反式乌头酸脱羧酶基因表达盒得到重组土曲霉菌株， 实现衣康酸产量的 提高， 其中出发菌株为目前已知的产衣康酸的土曲霉， 如土曲霉CICC40205、 土曲霉 NRRL1960、 土曲霉DSM23081、 土曲霉TN484、 土曲霉TN484-M1或其他能够生产衣康酸的基因 工程菌或者野生菌株等， 下面以土曲霉CICC40205为例， 具体描述本发明所述重组土曲霉菌 株的构建方法。 0049 实施例1.构建表达反式乌头酸脱羧酶重组土曲霉菌株 0050 1.土。

24、曲霉反式乌头酸脱羧酶表达盒的构建： 本发明所述的反式乌头酸脱羧酶tad1 基因为玉蜀黍黑粉菌的反式乌头酸脱羧酶基因tad1， 编码的反式乌头酸脱羧酶的氨基酸序 列如SEQ ID NO.1所示。 0051 人工合成反式乌头酸脱羧酶tad1基因， 并针对土曲霉表达进行密码子优化， 优化 后的序列如SEQ ID No.2所示， 将其连接构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdAt 和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC后， 克隆在pUC57-Kan载体上， 构建获得质粒pmWM22 (图2)。 0052 以PgpdAt-743(5 -ttacactctgggaggatccaggtact-3 )和。

25、TtrpC-R(5 - gtcgtgccagtcgactctaga-3 )为引物对， 以质粒pcWM22为模板进行PCR扩增PgpdAt-tad1- TtrpC片段， 产物纯化回收后得到反式乌头酸脱羧酶表达盒PgpdAt-tad1-TtrpC， 核苷酸序 列如SEQ ID No.3所示。 0053 2.反式乌头酸脱羧酶表达盒与潮霉素B抗性hph基因表达盒共转化土曲霉原生质 体， 获得重组土曲霉菌株， 具体方法如下： 0054 1)土曲霉原生质体的制备 0055 将土曲霉CICC40205的孢子悬液接种至50mL液体培养基IPM中， 孢子浓度约为107 个/mL， 在200rmp、 37培养12。

26、-18h。 用无菌单层100目尼龙布过滤收集长出的菌丝， 并用灭 菌的0.6M MgSO4溶液冲洗三次， 压干后置于无菌的50ml三角瓶中； 按称取1g菌丝， 加入10mL 酶解液， 在30、 120rpm处理1-2h。 酶解液成分为： 1纤维素酶(Sigma， CatalogNo.： C1184)、 1裂解酶(Sigma， Catalog NO.： L1412)、 1蜗牛酶(上海生工， Catalog No.： SB0870)、 0.6M MgSO4， 经由0.22 m的无菌过滤器过滤除菌。 0056 将上述酶解后的混合液用300目尼龙布过滤， 收集滤液。 4离心收集原生质体， 用 预冷1.。

27、0M山梨醇溶液洗涤一次， 再用预冷的STC(1.0M山梨醇， 50mM TrisHCl-pH8.0， 50mM CaCl2)洗涤一次， 最后把原生质体重悬于150 l预冷的STC， 并用STC将原生质体浓度调整为 5107个/mL， 得到原生质体悬液。 0057 2)潮霉素B筛选标记基因hph表达盒的构建 0058 以 h p h - F ( 5- t t c g g g a t c g c a a g c g t a a a g - 3) 和 h p h - R ( 5- caattatctttgcgaacccagg-3 )为引物对， 以质粒pSGF957为模板进行PCR扩增PtrpC-hp。

28、h- TtrpC片段， PtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶基因启动子， hph为潮霉素磷酸转移酶基因， TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子； 扩增产物纯化回收后， 得到潮霉素B抗性hph基因表 达盒PtrpC-hph-TtrpC。 说明书 4/9 页 6 CN 111944706 A 6 0059 3)反式乌头酸脱羧酶表达盒与抗性基因hph共转化土曲霉原生质体(图5)： 0060 在上述原生质体悬液中加入约5 g(体积不超过10 L)的反式乌头酸脱羧酶基因 tad1表达盒DNA和1 g潮霉素B抗性hph基因表达盒DNA， 再加入50 L PSTC(40PEG4000， 50Mm Tris-H。

29、Cl pH8.0， 50mM CaCl2)， 轻轻混匀， 冰浴30min。 加入1.5mL PSTC， 混匀后室温 放置20min； 然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板PDA-SH， 在30、 黑暗条件 下培养3-4天。 0061 从平板上将转化子转接至筛选平板PDA-H上(称取4g马铃薯右旋糖琼脂培养基溶 解于100ml蒸馏水中， 灭菌， 冷却至约55时加入潮霉素至终浓度为100 g/mL， 制备平板)， 在30培养3-5天， 得到转化子。 0062 上述含有PgpdAt-tad1-TtrpC表达盒的重组土曲霉菌株的制备过程中， 也可以将 反式乌头酸脱羧酶表达盒与潮霉素B抗性hph。

30、基因表达盒连接为一个表达盒， 然后转化原生 质体(图7)不影响阳性转化子的筛选以及基因型的鉴定。 0063 4)反式乌头酸脱羧酶表达盒与抗性基因hph共转化重组土曲霉菌株基因型的验 证： 0064 挑取上述获得的重组土曲霉转化子接种于PDA-H平板上培养孢子， 然后分别将孢 子接种于IPM液体培养基中进行培养， 收集菌丝提取基因组， 以PgpdAt-F743(5 - ttacactctgggaggatccaggtact-3 )和TtrpC-R(5 -gtcgtgccagtcgactctaga-3 )为引物对 进 行 P C R ， 扩 增 插 入 基 因 组 中 的 P g p d A t -。

31、 t a d 1 - T t r p 元 件 ； 以 h p h - F (5- ttcgggatcgcaagcgtaaag-3 )和hph-R(5 -caattatctttgcgaacccagg-3 )为引物对， 扩增插 入重组菌中的PtrpC-hph-TtrpC片段， 用0.8的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物， 验证转化子 中PgpdAt-tad1-TtrpC元件的整合情况。 电泳结果显示挑选的转化子中都能扩增到PtrpC- hph-TtrpC条带。 部分转化子中可以扩增到PgpdAt-tad1-Ttrp， 以出发菌株CICC40205基因 组DNA模板作为阴性对照， 没有扩增到DNA片段。。

32、 因此， 证明这些转化子中都成功整合了 PgpdAt-tad1-Ttrp表达盒。 0065 将转化子转接到PDA-H平板上进行传代培养， 传代3次。 然后再分别收集孢子用生 理盐水进行适当的梯度稀释， 取100 L涂布于PDA-H平板上， 使其长出独立的单菌落， 即为单 孢分离。 再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离， 共进行4次单孢分离传代培养。 单孢分离 后的重组菌株再次进行基因型鉴定进行验证。 挑取部分验证正确的重组菌株进行摇瓶发酵 筛选。 0066 实施例2.以ptrA作为筛选标记构建表达反式乌头酸脱羧酶重组土曲霉菌株 0067 重复实施例1， 与实施例1的不同在于， 本实施例中所述重组。

33、土曲霉菌株中使用的 筛选标记基因为吡啶硫胺素筛选标记ptrA基因， 具体方法描述如下： 0068 1.土曲霉反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒的构建， 参照实施例1。 0069 2.用吡啶硫胺素抗性基因ptrA作为筛选标记构建表达tad1土曲霉菌株 0070 1)反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒与ptrA共转化土曲霉 0071 以ptrA-F(5 -gggcaattgattacgggatc-3 )和ptrA-R(5 -atggggtgacgatgagccgc- 3 )为引物对， 以质粒pPTR II(Takara)为模板进行PCR扩增吡啶硫胺素抗性基因ptrA， 经纯 化回收后得到ptrA片。

34、段。 将该表达盒克隆至Peasy-Blunt载体(TransGen Biotech)上， 得到 质粒pmWM24(图3)。 说明书 5/9 页 7 CN 111944706 A 7 0072 参照实施例1中的制备方法制备土曲霉CICC40205原生质体。 在原生质体悬液中加 入约5 g(体积不超过10 L)的反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达盒DNA和1 g筛选标记ptrA片 段， (图6所示共转化)再加入50 L PSTC(40PEG4000， 50Mm Tris-HCl pH8.0， 50mM CaCl2)， 轻轻混匀， 冰浴30min。 加入1.5mLPSTC， 混匀后室温放置20min；。

35、 然后与上层琼脂混 合后倾注于再生筛选培养基平板CD-SPt， 在30、 黑暗条件下培养34天。 从平板上将转化 子转接至筛选平板CD-Pt上， 在30培养3-5天， 得到转化子。 0073 挑取制备的重组土曲霉转化子接种于CD-Pt平板上培养孢子， 然后分别将孢子接 种于IPM液体培养基中进行培养 ， 收集菌丝提取基因组 ， 以 PgpdAt-F743 (5- ttacactctgggaggatccaggtact-3 )和TtrpC-R(5 -gtcgtgccagtcgactctaga-3 )为引物对 进行PCR， 扩增插入基因组中的tad1表达元件PgpdAt-tad1-TtrpC， 用0。

36、.8的琼脂糖凝胶电 泳分析PCR产物， 验证转化子中PgpdAt-tad1-TtrpC元件的整合情况。 电泳结果显示部分转 化子中能扩增到PgpdAt-tad1-TtrpC条带。 0074 2)反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达元件与筛选标记基因ptrA串联整合至土曲霉 基因组 0075 反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达元件与筛选标记基因ptrA串联的DNA元件构建方 法如下： 将pmWM24质粒采用限制性内切酶XhoI和NotI酶切， 回收酶切后的片段作为载体骨 架； 将pWM22质粒采用限制性内切酶XhoI、 NotI和DraI酶切， 回收2.9kb的tad1表达盒 PgpdAt-tad1-。

37、TtrpC； 将以上回收的两个片段使用T4DNA ligase相连， 得到质粒pWM23(图 4)。 以PgpdAt-743(5 -ttacactctgggaggatccaggtact-3 ) 和ptrA-R(5 - atggggtgacgatgagccgc-3 )为引物对， 以质粒pmWM23为模板进行PCR扩增， 产物纯化回收后 得到反式乌头酸脱羧酶基因tad1表达元件和吡啶硫胺素筛选标记基因ptrA融合在一起的 表达盒PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette(图8)。 0076 或者： 参照实施例1中的制备方法制备土曲霉CICC40205原生质体。 在原生质体悬 液。

38、中加入约5 g PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette表达盒DNA， 再加入50 LPSTC(40 PEG4000， 50Mm Tris-HCl pH8.0， 50mM CaCl2)， 轻轻混匀， 冰浴30min。 加入1.5mL PSTC， 混 匀后室温放置20min； 然后与上层琼脂混合后倾注于再生筛选培养基平板CD-SPt， 在30、 黑暗条件下培养34天。 从平板上将转化子转接至筛选平板CD-Pt上， 在30培养3-5天， 得 到转化子。 0077 挑取制备的重组土曲霉转化子接种于CD-Pt平板上培养孢子， 然后分别将孢子接 种于IPM液体培养基中进行培养 ， 。

39、收集菌丝提取基因组 ， 以 PgpdAt-F743 (5- ttacactctgggaggatccaggtact-3 )和ptrA-R(5 -atggggtgacgatgagccgc-3 )为引物对进 行PCR， 扩增插入基因组中的PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrAcassette元件， 用0.8的琼脂糖凝 胶电泳分析PCR产物， 验证转化子中PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette元件的整合情况。 电泳结果显示部分转化子中能扩增到PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette条带。 以出发菌 株CICC40205基因组DNA模板作为阴性对照， 。

40、没有扩增到DNA片段。 因此， 证明这些转化子中 都成功整合了PgpdAt-tad1-TtrpC-ptrA cassette表达盒。 0078 3.阳性转化子的验证及分离纯化 0079 将基因型验证正确的阳性转化子转接到CD-Pt平板上进行传代培养， 传代3次。 然 后再分别收集孢子用生理盐水进行适当的梯度稀释， 取100 L涂布于CD-Pt平板上， 使其长 说明书 6/9 页 8 CN 111944706 A 8 出独立的单菌落， 即为单孢分离。 再从单菌落上取孢子再次进行单孢分离， 共进行4次单孢 分离传代培养。 单孢分离后的重组菌株再次进行基因型鉴定进行验证。 挑取部分验证正确 的重组菌。

41、株进行摇瓶发酵筛选。 0080 实施例3.重组土曲霉发酵产衣康酸 0081 1.重组土曲霉菌株产衣康酸的摇瓶筛选 0082 将实施例1和实施例2所得重组菌株传代后稳定的重组土曲霉菌株分别接种至土 曲霉产孢培养基， 32培养6天获得成熟的孢子。 再分别将各个培养至成熟的孢子接种至衣 康酸发酵培养基中(500ml三角瓶中装有55ml衣康酸发酵培养基)， 每株菌做三瓶平行， 37 ， 220rpm发酵72h。 过滤除去发酵液中的菌丝， 发酵上清液进行适度稀释后进行高效液相 色谱分析(High Performance Liquid Chromatography， HPLC)。 0083 2.发酵液中衣。

42、康酸的含量及纯度分析 0084 选取重组菌株和出发菌株CICC40205的发酵上清液稀释后进行高效液相色谱分 析， 以不同浓度的衣康酸的标准品作为标准曲线， 分析比较发酵液中衣康酸的含量及纯度。 色谱条件如下： 色谱柱:AminexHPX-87H Organic Acid Analysis Column,300mm7.8mm (Bio-rad,Cat No.1250140)； 流动相： 5mmol/L硫酸； 流速： 0.5mL/min； 柱温： 30； 检测温 度： 30； 紫外检测器(210nm)。 结果如图9所示， 保留时间在15.581min的峰为衣康酸， 分析 结果表明， 在摇瓶发酵水。

43、平上重组菌株发酵液中的衣康酸纯度与出发菌株CICC40205相比 没有显著变化， 都在99以上。 以hph作为筛选标记的重组菌株发酵液中的衣康酸产量与出 发菌株CICC40205相比有显著提高， 提高约1050(图10)。 以ptrA作为筛选标记的重组 菌株发酵液中的衣康酸产量与出发菌株CICC40205相比也有显著提高， 最高可以提高40 (图11)。 本发明所涉及的氨基酸或核苷酸序列： 0085 SEQ ID NO.1： 0086 MAPALNANPTTKRDELSAPSASHKLGMSSMASRAAGGGLKLTGLPDLSDSAGTLSDIFGTPQMREIWSD QNRVACYLEI。

44、EAALAIVQADLGIIPKNAAHEIVEHCRVQEIDWALYKQKTELIGYPVLGIVQQLVANCKDGLGEYCH WGATTQDITDTATVMQIRQSLTLVKQRLDSIVSSLEHLAEQHRNVPMAARSNLKQAVPITFGFKMARFLATFRRHQQ RLVELEKRVYTLEFGGAAGNLSSLGDQGIATHDALAKMLDLAPAEIAWHTEHDRFAEVGTFLGLLTGTLAKLATDIK LMSQTEVGEVGEPFISNRGSSSTMPQKNNPISCVYIHACAANVRQGAAALLDAMQSDHERGTGPWEIIWVQLPLMM。

45、N WTSAALNNADFVLRGLQVFPDAMQHNLDLSKGLIVSEAVMMGLGNTLGRQYAHDAVYECCRTAFVQDRPLLDVLLEN HEIASKLDRTELEKLCDPANYLGQCSQWIDRVLSRPSSA 0087 (a)序列特征： 0088 长度： 493Aa 0089 类型： 蛋白序列 0090 (b)分子类型： 氨基酸 0091 (c)假设： 否 0092 (d)反义： 否 0093 (e)最初来源： 玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis) 0094 (f)特异性名称： 反式乌头酸脱羧酶Tad1 0095 SEQ ID NO.2： 反式乌头酸脱羧。

46、酶tad1基因 0096 atggcacctgcacttaacgcaaaccctacaacaaagagagacgaacttagcgcacctagcgcaagcca 说明书 7/9 页 9 CN 111944706 A 9 taaacttggaatgagcagcatggcaagccgcgcagcaggaggaggacttaaacttacaggacttcctgatcttagc gatagcgcaggaacacttagcgatatctttggaacacctcagatgcgcgaaatctggagcgatcagaaccgcgtgg catgctatcttgaaatcgaagcagcacttgcaatc。

47、gtgcaggcagatcttggaatcatccctaagaatgcggcaca tgaaatcgtggaacattgccgcgtgcaggaaatcgattgggcactttataaacagaaaacagaacttatcggatat cctgtgcttggaatcgtgcagcagcttgtggcaaactgcaaagatggacttggagaatattgccattggggagcca ccacacaggatatcacagatacagcaacagtgatgcagatccgccagagccttacacttgtgaaacagcgccttga tagcatcgtgagcagccttgaacatct。

48、tgcagaacagcatcgcaacgtgcctatggcagcacgcagcaaccttaaa caggcagtgcctatcacatttggatttaagatggcccgctttcttgcaacatttcgccgccatcagcagcgccttg tggagctcgagaagcgggtttatacacttgaatttggaggagcagcaggaaaccttagcagccttggagatcaggg aatcgcaacacatgatgcacttgcaaagatgttagatcttgcacctgcagaaatcgcatggcatacagaacatgat cgctttgcagaagtgggaa。

49、catttcttggacttcttacaggaacacttgcaaagctggcgacagatatcaaactta tgagccagacagaggtcggagaggtaggtgagccctttataagtaaccgcggaagcagcagcacaatgcctcagaa gaataatcctatcagctgcgtgtatatccatgcatgcgcagcaaacgtgcgccagggagcagcagcacttcttgac gccatgcaatcagaccatgaacgcggaacaggaccttgggaaatcatctgggtgcagcttcctcttatgatgaact ggacaagcgca。

50、gcacttaacaacgcagatttcgtattgcgcggacttcaggtgtttcctgacgcgatgcaacacaa tcttgatcttagcaaaggacttatcgtgagcgaagcagtgatgatgggacttggaaacacacttggacgccagtat gcacatgatgcagtgtatgaatgctgccgcacagcatttgtgcaggatcgccctcttcttgatgtgcttcttgaga atcacgaaatcgcaagcaaacttgatcgcacagagctggagaagctatgtgatcctgcaaactatcttggacagtg cag。