多维双通道的液相色谱-质谱联用装置.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010314288.5 (22)申请日 2020.04.17 (71)申请人 北京大学 地址 100191 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 黄超兰高帅鑫张楠 (51)Int.Cl. G01N 30/20(2006.01) (54)发明名称 多维双通道的液相色谱-质谱联用装置 (57)摘要 本发明涉及一种多维双通道的液相色谱质 谱联用装置， 其包括第一液相泵、 第二液相泵、 六 通阀、 初级分析柱、 第一次级分析柱、 第二次级分 析柱以及分析柱位置切换装置的液相色谱。

2、的组 件。 本发明的液相色谱质谱联用装置可防止多 维液相色谱中特定的流动相成分对质谱系统的 损害， 特别是在蛋白质组学的研究中具有良好的 效果。 权利要求书2页 说明书11页 附图5页 CN 111965292 A 2020.11.20 CN 111965292 A 1.一种多维双通道的液相色谱-质谱联用装置， 所述液相色谱的组件包括： 第一液相 泵、 第二液相泵、 六通阀、 初级分析柱、 第一次级分析柱、 第二次级分析柱以及分析柱位置转 换装置； 其中， 所述第一次级分析柱和所述第二次级分析柱相同； 其中， 所述组件的连接状态为选自状态A和状态B中的其中一者， 并且所述状态A和所述 状态B通。

3、过所述六通阀切换； 所述状态A由第一通路和第二通路组成， 其中所述第一通路依次包括所述第一液相泵、 所述初级分析柱、 所述六通阀、 以及所述第一次级分析柱， 并且所述第二通路依次包括所述 第二液相泵、 所述六通阀、 所述第二次级分析柱； 所述状态B由第三通路和第四通路组成， 其中所述第三通路依次包括所述第一液相泵、 所述初级分析柱、 所述六通阀、 以及所述第二次级分析柱， 所述第四通路依次包括所述第二 液相泵、 所述六通阀、 所述第一次级分析柱； 并且 其中， 所述分析柱位置转换装置用于切换第一次级分析柱的出口或第二次级分析柱的 出口与质谱的离子源入口的对准状态， 使得所述第一次级分析柱的出口。

4、对准质谱的离子源 入口而所述第二次级分析柱的出口不对准质谱的离子源入口， 或者使得所述第二次级分析 柱的出口对准质谱的离子源入口而所述第一次级分析柱的出口不对准质谱的离子源入口。 2.根据权利要求1所述的液相色谱-质谱联用装置， 其中， 所述离子源为电喷雾电离源。 3.根据权利要求1或2所述的液相色谱-质谱联用装置， 其中， 所述初级分析柱为阳离子 交换色谱(SCX)柱， 并且所述第一次级分析柱和第二分析柱都为反相色谱(RP)柱。 4.根据权利要求1或2所述的液相色谱-质谱联用装置， 所述六通阀通过手动或自动方 式使所述组件的连接状态在状态A或状态B之间切换； 并且所述分析柱位置转换装置通过手。

5、 动或自动方式切换第一次级分析柱的出口或第二次级分析柱的出口与质谱的离子源入口 的对准状态。 5.根据权利要求1或2所述的液相色谱-质谱联用装置， 其中所述第一次级分析柱与所 述六通阀之间设置有液接电压装置， 并且所述第二次级分析柱与所述六通阀之间设置有液 接电压装置； 并且， 所述液接电压装置为PEEK微型三通， 所述PEEK微型三通的第一端或第二 端分别连接六通阀和第一次级分析柱或第二次级分析柱， 并且所述PEEK微型三通的第三端 连接液接电压装置。 6.一种分析蛋白质组的方法， 其中所述方法采用根据权利要求1所述的液相色谱-质谱 联用装置进行， 并且所述方法包括如下步骤： (1)通过所述。

6、六通阀使根据权利要求1所述的液相色谱-质谱联用装置处于所述状态A， 并通过所述分析柱位置转换装置使所述第一次级分析柱不对准所述质谱的离子源入口而 使所述第二次级分析柱对准所述质谱的离子源入口； (2)通过所述液相色谱将预处理的蛋白质组样品进样； (3)通过所述第一液相泵并使用第一流动相使样品依次经过所述初级分析柱、 所述六 通阀， 并进入第一次级分析柱进行分离； (4)将所述六通阀由所述状态A切换至所述状态B， 通过所述第二液相泵并使用第二流 动相冲洗在所述第一次级分析柱中的样品； (5)通过所述分析柱位置转换装置使所述第一次级分析柱对准所述质谱的离子源入口 权利要求书 1/2 页 2 CN 。

7、111965292 A 2 并且所述第二次级分析柱不对准质谱的离子源入口， 使得所述第一分析柱中的蛋白质通过 所述质谱的离子源入口进入所述质谱进行质谱检测， 并且与此同时， 通过所述第一液相泵 并使用所述第一流动相使样品经过所述初级分析柱、 所述六通阀， 并进入所述第二次级分 析柱进行分离； (6)将所述六通阀由所述状态B切换至所述状态A， 通过所述第二液相泵并使用所述第 二流动相冲洗在所述第二次级分析柱中的样品； (7)通过所述分析柱位置转换装置使所述第二次级分析柱对准所述质谱的离子源入口 并且所述第一次级分析柱不对准所述质谱的离子源入口， 使得所述第二分析柱中的蛋白质 通过所述质谱的离子源。

8、入口进入质谱进行检测， 并且与此同时， 通过所述第一液相泵并使 用所述第一流动相使样品经过所述初级分析柱、 所述六通阀， 并进入所述第一次级分析柱 进行分离； (8)循环重复步骤(4)至步骤(7)， 直至所述蛋白质组的分析结束。 7.根据权利要求6所述的方法， 其中， 所述步骤(4)和所述步骤(6)所用的时间相同， 并 且所述步骤(5)和所述步骤(7)所用的时间相同； 并且 其中， 步骤(4)中使用第二流动相冲洗第一次级分析柱中的样品的时间需要达到使第 一流动相中的成分不影响步骤(5)中的质谱检测的程度； 并且， 步骤(6)中使用第二流动相 冲洗第二次级分析柱中的样品的时间需要达到使第一流动相。

9、中的成分不影响步骤(7)中的 质谱检测的程度。 8.根据权利要求6所述的方法， 其中， 在所述第一流动相中所述样品中的蛋白质与第一 次级分析柱中固定相的结合强于在所述第二流动相中样品中所述样品中的蛋白质与第一 次级分析柱中固定相的结合， 并且在所述第一流动相中所述样品中的蛋白质与第二次级分 析柱中固定相的结合强于在所述第二流动相中样品中所述样品中的蛋白质与第二次级分 析柱中固定相的结合。 9.根据权利要求6所述的方法， 其中， 所述第一流动相中含有乙酸铵， 并且所述第二流 动相中不含有乙酸铵。 10.根据权利要求1-5中任一项所述的液相色谱-质谱联用装置在蛋白质组学研究中的 用途， 其中， 所。

10、述蛋白质组学研究包括对蛋白质组进行定性或定量研究。 权利要求书 2/2 页 3 CN 111965292 A 3 多维双通道的液相色谱-质谱联用装置 技术领域 0001 本发明属于化学分析中的液相色谱-质谱联用(液质联用)的技术领域， 具体涉及 一种多维双通道的液质联用装置， 以及该装置的应用方法， 特别是在蛋白质组鉴定中的应 用。 背景技术 0002 蛋白质是生命体遗传信息的翻译产物和生物学功能的主要承担者， 催化和控制生 物体内大部分的过程。 传统的蛋白质研究主要集中于单一蛋白质的结构和功能方面， 并将 其结果匹配已有的基因序列信息， 进而阐释机体的生理或病理现象。 然而， 由于生命活动的。

11、 复杂性， 大多数的生理或病理过程往往需要多个生物分子(特别是蛋白质分子)的参与， 针 对与单个蛋白质进行研究往往并不能反映生理或病理过程中涉及的多个蛋白质之间的种 类及相互作用关系。 因此， 随着技术的发展， 以特定生物体系的整体蛋白质组为研究对象的 蛋白质组学开始出现并在近年迅速发展。 蛋白质组学(proteomics)是对生命体内的全套蛋 白质进行规模化系统分析的新兴学科， 其研究范围不仅包括蛋白质的规模化定性和定量， 还包括蛋白质的翻译后修饰、 相互作用、 结构和功能研究。 0003 在蛋白质组学的研究中， 质谱(mass spectrum， MS)是一个重要的工具。 相比其他 的蛋白。

12、质组的研究工具(如2D PAGE)， 质谱具有足够的分析灵敏度及分析广度以匹配蛋白 质组研究中信息的复杂度。 在大规模的自下而上(bottom-up)的蛋白质组学中， 由蛋白酶消 化产生的肽混合物的高度复杂性要求在质谱仪分析之前需要有效的分离方法， 因此通常采 用两种正交分离方法， 例如已开发出的多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology， MudPIT)(Washburn， M.P.等， Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional p。

13、rotein identification technology.Nat Biotechnol， 19(3)， 242-7， 2001)。 这项革命性的技术已将蛋白质组学中样品制备过程的模 式从2D凝胶发展为直接以溶液形式消化， 并使得蛋白质组学的操作从低通量线下(off- line)模式变为高通量线上(on-line)模式。 0004 质谱技术是蛋白质组学研究工具的核心部分， 随着仪器内部组件的精密程度越来 越高， 质谱仪变得越先进， 但MudPIT的兼容性越差， 部分原因在于， 在经典的MudPIT肽洗脱 过程中， 肽会通过盐梯度从强阳离子交换(SCX)部分移至反相(RP)部分， 然后从R。

14、P洗脱到质 谱仪中。 随着洗脱盐浓度从1增加到100， 该过程将重复数个周期(Washburn， M.P.等， 同 上)。 尽管蛋白质组学分析中广泛使用了与质谱兼容的挥发性盐(例如乙酸铵)， 但在现代质 谱仪器中， 超高灵敏度的特性极大程度上降低了对盐的耐受性， 即使是挥发性盐亦如此。 质 谱仪器中引入高浓度会迅速污染离子光学器件， 从而大大降低灵敏度和性能。 此外， 以阳离 子形式的NH4+离子还会增加肽离子的多分散性， 从而降低质谱图的质量。 因此， 在将样品注 入质谱仪之前， 必须进行脱盐步骤。 两种代表性方法是通过C18捕集柱(trapping column) 脱盐以及使用pH梯度而非。

15、盐梯度来分离SCX柱中的肽。 然而， 这两种代表性方法都存在固有 的缺陷： 通过C18捕集柱脱盐的方法一般通过在SCX的下游加入一部分C18作为双相捕集柱， 说明书 1/11 页 4 CN 111965292 A 4 其需要断开液相的流路使得其中的盐组成被完全冲洗入废液后才能继续使用有机流动相 梯度洗脱保留在分析柱中的肽； 而对于pH梯度的方法， 尽管其可以使用传统的MudPIT设置， 但在SCX柱中需要使用pH梯度而非盐梯度， 或者需要加入新的环-捕集柱以完成MudPIT的 酸-盐-pH梯度， 这样的正交性并不能令人满意或者死体积过高而导致大量样品丢失， 且这 些方法过于复杂， 故未得到广泛。

16、使用。 为了实现对蛋白质组学的深入研究， 同时又不污染质 谱仪， 人们最近又试图进行线下操作， 然而， 线下模式不仅效率低下， 而且会造成大量样品 损失。 0005 因此， 如何优化经典的MudPIT方法使其保持高通量的分析能力同时避免将任何盐 类物质引入质谱系统， 成为本领域的技术人员期待解决的技术问题。 发明内容 0006 为了解决上述技术问题， 发明人提供了本发明的技术方案。 0007 本发明的第一方面涉及一种多维双通道的液相色谱-质谱联用装置， 所述液相色 谱的组件包括： 第一液相泵、 第二液相泵、 六通阀、 初级分析柱、 第一次级分析柱、 第二次级 分析柱以及分析柱位置切换装置； 其。

17、中， 所述第一次级分析柱和所述第二次级分析柱相同； 其中， 所述组件的连接状态选自状态A和状态B中的其中一种， 并且所述状态A和所述状态B 通过所述六通阀切换； 所述状态A由第一通路和第二通路组成， 其中所述第一通路依次包括 所述第一液相泵、 所述初级分析柱、 所述六通阀、 以及所述第一次级分析柱， 并且所述第二 通路依次包括所述第二液相泵、 所述六通阀、 所述第二次级分析柱； 所述状态B由第三通路 和第四通路组成， 其中所述第三通路依次包括所述第一液相泵、 所述初级分析柱、 所述六通 阀、 以及所述第二次级分析柱， 所述第四通路依次包括所述第二液相泵、 所述六通阀、 所述 第一次级分析柱； 。

18、其中所述分析柱位置转换装置用于切换第一次级分析柱的出口或第二次 级分析柱的出口与质谱的离子源入口的对准状态， 使得第一次级分析柱的出口对准质谱的 离子源入口而第二次级分析柱的出口不对准质谱的离子源入口， 或者使得第二次级分析柱 的出口对准质谱的离子源入口而第一次级分析柱的出口不对准质谱的离子源入口。 0008 在本发明中， 术语 “多维双通道” 指具有初级分析柱以及两个并行通道(Parallel Channels， PC)的次级分析柱的液相色谱结构， 例如， 将该此类多维双通道的液相色谱-质谱 联用装置用于MudPIT方案时 ， 可以称为 “PC-MudPIT” (Parallel Chann。

19、els- multidimensional protein identification technology， 双通道的多维蛋白质鉴定技 术)。 与之相对的， 现有技术中的MudPIT在本文中也可以替换性地被称为 “经典MudPIT” 或 “传统MudPIT” 。 0009 在本发明中， 术语 “液相色谱-质谱联用” 在本文中可以与 “液质联用” 、 LC-MS、 LC/ MS等术语互换使用， 表示以液相色谱作为分离系统、 质谱为检测系统的化学物质的分析系 统。 在本发明中， 本发明的多维双通道的液质联用装置中所包含的质谱可以为1级质谱， 也 可以是多级串联质谱， 例如2级串联质谱LC-MS。

20、/MS。 本发明的质谱除了进样系统之外， 其他 部分可采用本领域技术人员已知的类型。 例如， 本发明的质谱的离子源的类型包括但不限 于电子电离、 化学离子、 场电离、 快原子轰击(FAB)、 基质辅助激光解析电离源(MALDI)、 通过 (ESI)、 大气压化学电离源(APCI)， 优选是电喷雾电离源(ESI)或大气压化学电离源(APCI)， 更优选是电喷雾电离(ESI)； 本发明的质谱的质量分析器包括但不限于单聚焦质量分析器、 说明书 2/11 页 5 CN 111965292 A 5 双聚焦质量分析器、 四级杆质量分析器、 离子阱质量分析器、 傅里叶变换离子回旋共振(FT- ICR)或者飞。

21、行时间质量分析器(TOF)， 在质谱选用多级串联质谱的形式时， 其中所用的质量 分析器可以是相同的， 例如采用三重四级杆质量分析器， 其中所用的质量分析器也可以是 上述质量分析器中任意二种或二种以上的组合， 例如由四极杆质谱和飞行时间质谱组成的 串联型质谱仪。 0010 本发明涉及的 “多维双通道的液相色谱-质谱联用装置” 是多维液质联用技术的一 种。 多维液质联用技术在液相色谱的部分可采用两种或两种以上不同维度(即， 不同分离原 理)的分析柱(在本文中与 “色谱分析柱” 可替换地使用)。 优选地， 本发明在液相色谱部分采 用两种不同维度的分析柱， 即初级分析柱和次级分析柱， 其中所述次级分析。

22、柱具有两个分 析柱， 分比为第一次级分析柱和第二次级分析柱。 在一个实施例中， 第一次级分析柱和第二 次级分析柱是相同的。 在另一个实施例中， 第一次级分析柱和第二次级分析柱是不同的。 在 一个实施例中， 所述初级分析柱是阳离子交换色谱(strong cation exchange， SCX)柱。 在 另一个实施例中， 所述次级分析柱是反相色谱(reverse chromatography， RP)柱。 在一个优 选的实施例中， 所述初级分析柱是SCX柱， 所述次级分析柱中的第一次级分析柱和第二次级 分析柱都为RP柱。 0011 本发明涉及的 “液相泵” 或 “第一液相泵” 或 “第二液相泵”。

23、 可使用本领域技术人员 已知晓的液相泵的类型， 包括但不限于恒流泵或恒压泵， 或者从其他角度划分的往复泵、 累 积型往复泵、 注射泵、 气动放大泵。 在本发明中， 所述第一液相泵和第二液相泵是相同的或 不同的。 在一个实施方式中， 可以通过对已知液相泵进行改造来获得本发明的第一液相泵 或第二液相泵， 例如增加压力、 或者通过使用气泵进行线下上样的方式进行改造。 0012 本发明中所涉及的 “六通阀” 可使用本领域技术人员已知晓的在液相色谱技术领 域所使用的六通阀。 所述六通阀具有6个用于连接其他液相组件(例如液相泵或分析柱)的 接口， 并且可以切换与其连接的组件之间的连接状态， 在本发明中也可。

24、以将该六通阀的功 能可替换性地描述为 “用于转换流路” 。 六通阀在多维液相色谱技术中的连接方式以及切换 液相组件的连接状态的技术已被本领域中的技术人员所知(例如可参见CN110346478A、 CN101169391A)。 在本发明的一个实施方案中， 本发明所述的六通阀可以通过毛细管与其他 组件(例如液相泵、 初级分析柱、 或者次级分析柱)相连接， 优选地， 所述毛细管是50 m365 m的毛细管。 0013 通过本发明所设置的六通阀， 本发明的多维双通道的液质联用装置可在如下所述 的两种连接状态(即， 状态A和状态B)之间进行切换， 并且本发明的多维双通道的液质联用 装置在一个时间点只能处。

25、于如下所述的状态A和状态B中的一种， 即不能同时存在状态A和 状态B。 其中， 如上所述， 状态A由第一通路和第二通路组成， 其中所述第一通路依次包括第 一液相泵、 初级分析柱、 六通阀、 以及第一次级分析柱， 并且所述第二通路依次包括第二液 相泵、 六通阀、 第二次级分析柱； 状态B由第三通路和第四通路组成， 其中所述第三通路依次 包括第一液相泵、 初级分析柱、 六通阀、 以及第二次级分析柱， 并且所述第四通路依次包括 第二液相泵、 六通阀、 第一次级分析柱。 在本发明的语境中， 在涉及本发明的液质联用装置 时，“依次” 的含义是指以上述通路中的任意一种的液相泵为出发点， 按照液相色谱中流动。

26、 相流动的方向， 从上游至下游经过的组件的顺序是固定的， 而非是可以随便组合的， 例如按 照如上所述的第一通路中各个液相组件的连接从上游至下游的顺序必须是按照 “第一液相 说明书 3/11 页 6 CN 111965292 A 6 泵初级分析柱六通阀第一次级分析柱” 的顺序而不能是其他相反或不同的顺序， 并 且按照如上所述的第二通路中各个液相组件的连接从上游至下游的顺序必须是按照 “第二 液相泵六通阀第二次级分析柱” 的顺序而不能是其他不同的顺序； 同样的， 按照如上所 述的第三通路中各个液相组件的连接从上游至下游的顺序必须是按照 “第一液相泵初级 分析柱六通阀第二次级分析柱” 的顺序而不能是。

27、其他相反或不同的顺序， 并且按照如 上所述的第四通路中各个液相组件的连接从上游至下游的顺序必须是按照 “第二液相泵 六通阀第一次级分析柱” 的顺序而不能是其他不同的顺序。 在本发明的一个实施方式中， 六通阀的切换是手动的。 在本发明的另一个实施方式中， 六通阀的切换是自动的， 例如通过 以计算机控制的方式自动进行。 0014 根据本发明的原理， 本发明中的液相色谱部分将样品进行分离后进一步将样品转 移至质谱进行分析。 因此， 在本发明的多维双通道的液质联用装置中， 所述第一次级分析柱 和第二次级分析柱中的一者对准质谱的离子源入口， 换言之， 在同一时间点， 第一次级分析 柱和第二次级分析柱中有。

28、且只有一者对准质谱离子源入口而另一者不对准质谱离子源入 口。 所述第一次级分析柱或第二次级分析柱与质谱离子源的入口的对齐通过分析柱位置转 换装置进行切换， 该分析柱位置转换装置可以以手动的或自动方式进行切换， 例如通过计 算机程序进行切换。 0015 在本发明的多维双通道的液质联用装置中， 所述第一次级分析柱与所述六通阀之 间设置有液接电压装置， 并且所述第二次级分析柱与所述六通阀之间设置有液接电压装 置。 优选地， 所述液接电压装置为PEEK微型三通， 其第一端或第二端分别连接六通阀和第一 次级分析柱或六通阀和第二次级分析柱， 并且第三端连接液接电压装置。 0016 本发明的第二方面涉及一种。

29、分析蛋白质组的方法， 其中所述方法采用根据本发明 第一方面所述的多维双通道的液相色谱-质谱联用装置， 并且包括如下步骤： 0017 (1)通过六通阀使所述多维双通道的液相色谱-质谱联用装置处于所述状态A， 并 通过分析柱位置转换装置使第一次级分析柱不对准质谱的离子源入口并且所述第二次级 分析柱对准质谱的离子源入口； 0018 (2)通过液相色谱将预处理的蛋白质组样品进样； 0019 (3)通过第一液相泵并使用第一流动相使样品经过初级分析柱、 六通阀、 进入第一 次级分析柱进行分离； 0020 (4)将六通阀将状态A切换至状态B， 通过第二液相泵并使用第二流动相冲洗在第 一次级分析柱中的样品； 。

30、0021 (5)通过分析柱位置转换装置使所述第一次级分析柱对准质谱的离子源入口并且 所述第二次级分析柱不对准质谱的离子源入口， 使得第一分析柱中的蛋白质通过所述质谱 的离子源入口进入质谱进行质谱检测， 并且与此同时， 通过第一液相泵并使用第一流动相 使样品经过初级分析柱、 六通阀、 进入第二次级分析柱进行分离； 0022 (6)将六通阀将状态B切换至状态A， 通过第二液相泵并使用第二流动相冲洗在第 二次级分析柱中的样品； 0023 (7)通过分析柱位置转换装置使所述第二次级分析柱对准质谱的离子源入口并且 所述第一次级分析柱不对准质谱的离子源入口， 使得第二分析柱中的蛋白质通过所述质谱 的离子源。

31、入口进入质谱进行检测， 并且与此同时， 通过第一液相泵并使用第一流动相使样 说明书 4/11 页 7 CN 111965292 A 7 品经过初级分析柱、 六通阀、 进入第一次级分析柱进行分离； 0024 (8)循环重复步骤(4)至步骤(7)， 直至所述蛋白质组的分析结束。 0025 在本发明的一个实施方式中， 为了达到步骤(8)中循环重复的目的， 其中步骤(4) 和步骤(6)所用的时间相同， 并且所述步骤(5)和步骤(7)所用的时间相同。 0026 在本发明的一个实施方式中， 在第一流动相中样品中的蛋白质与第一次级分析柱 或第二次级分析柱中固定相的结合强于在第二流动相中样品中的蛋白质与第一次。

32、级分析 柱或第二次级分析柱中固定相的结合。 0027 在本发明的一个实施方式中， 所述样品为包含两种或两种以上蛋白质的样品。 例 如， 本发明所述的样品既可以是来自人体、 动物、 植物、 微生物等天然形成的蛋白质组， 也可 以是人工制造的蛋白质组。 0028 在本发明的一个实施方式中， 步骤(4)中使用第二流动相冲洗第一次级分析柱中 的样品的时间需要达到使第一流动相中的成分不影响步骤(5)中的质谱检测的程度； 同样 地， 步骤(6)中使用第二流动相冲洗第二次级分析柱中的样品的时间需要达到使第一流动 相中的成分不影响步骤(7)中的质谱检测的程度； 所述的时间可由本领域技术人员适当地 确定， 例如。

33、通过检测步骤(4)或(6)中用于冲洗的第二流动相中是否还含有第一流动相中可 能影响质谱检测的成分的含量来确定。 0029 在本发明的一个实施方式中， 所述六通阀或所述分析柱位置转换装置是手动控制 的或自动控制的， 例如通过计算机程序控制的。 0030 在本发明的一个实施方式中， 所述第一流动相或所述第二流动相是梯度的或非梯 度的。 0031 在本发明的一个实施方式中， 所述第一流动相中含有乙酸铵， 并且所述第二流动 相中不含有乙酸铵。 0032 本发明的第三方面涉及如上所述的液相色谱-质谱联用装置在蛋白质组学研究中 的用途， 其中， 所述蛋白质组学研究包括对蛋白质组进行定性或定量研究。 003。

34、3 通过应用本发明的技术， 可以高水平的保留经典MuDPIT高通量的分析能力， 保留 了线上模式高效率的特点， 且减少了样品损失； 同时通过双通道的设置避免了液相色谱过 程中流动相的盐进行质谱仪器， 降低了质谱被污染的风险， 延长了质谱仪器的使用寿命。 附图说明 0034 需要说明的是， 构成本说明书一部分的说明书附图仅用来结合具体实施方式提供 对本发明的进一步理解， 然而， 并不旨在限定本发明的保护范围。 其中： 0035 图1显示了经典MudPIT的示意性结构。 0036 图2A显示了根据本发明的一个实施方式的PC-MudPIT的示意性结构。 0037 图2B显示了根据本发明的一个实施方式。

35、的PC-MudPIT的示意性结构的一个工作状 态。 0038 图2C显示了根据本发明的一个实施方式的PC-MudPIT的示意性结构的另一个工作 状态。 0039 图3显示了在蛋白质组水平(图3A)和肽段水平(图3B)上经典MudPIT和PC-MudPIT 的分析效果的对比。 其中， MudPIT指代经典模式下的MudPIT实验； PC-MudPIT指代双通路模 说明书 5/11 页 8 CN 111965292 A 8 式下的MudPIT实验。 在经典模式下三次重复实验共鉴定到7479个蛋白质组， 平均每次实验 鉴定到6153个， 双通路模式下三次重复实验共鉴定到6203个蛋白质组， 平均每次。

36、实验鉴定 到5136个。 在经典模式下三次重复实验共鉴定到38354个肽段数， 双通路模式下三次重复实 验共鉴定到25570个肽段数。 0040 图4显示了PC-MudPIT和MudPIT实验中分别鉴定到的蛋白质组的序列覆盖率。 在双 通路模式(PC-MudPIT)下， 三次重复实验蛋白质序列覆盖率中值平均在10左右， 在经典模 式(MudPIT)下该值平均在12左右。 0041 图5显示了经典模式(MudPIT)的三次重复实验蛋白的重复率(A)及肽段的重复率 (B)。 0042 图6显示了双通路模式(PC-MudPIT)的三次重复实验蛋白的重复率(A)及肽段的重 复率(B)。 0043 图7。

37、显示了分别在经典MudPIT和PC-MudPIT模式下SCX分级梯度中鉴定到的总的肽 段数目。 0044 图8显示了经典MudPIT中SCX分级梯度中鉴定到的肽段的等电点性质。 0045 图9显示了PC-MudPIT中SCX分级梯度中鉴定到的肽段的等电点性质。 具体实施方式 0046 实施例1-样品的前期制备 0047 1.细胞培养： 液氮中取出冻存的A549细胞， 37水浴振荡解冻， 离心除去上清， 加 入1ml新鲜培养基吹打混匀， 移入培养瓶中， 补充9ml新鲜培养基混匀， 放入37的培养箱， 培养48小时至细胞长满底层瓶壁。 0048 2.细胞裂解： 细胞长满底层瓶壁后， 将细胞从培养箱。

38、中取出， 倒去培养液后， 用PBS 清洗两次， 每瓶细胞加入2mL的蛋白胰酶酶解2分钟， 收集细胞裂解液至15mL离心管中， 离心 去除上清， 用PBS清洗三次。 0049 3.提取蛋白： 在RIPA裂解液中加入1蛋白酶抑制剂(v v)， 每106个细胞加入1ml RIPA裂解液， 冰上摇床裂解30分钟， 每隔10分钟用移液枪吹打。 14000rpm离心30分钟， 取上 清液， BCA法测蛋白浓度， 剩余上清液移入1.5mL Eppendorf管中， 加入1/3 TCA沉淀蛋白 (TCA 上清液， v/v)， 放置4， 4小时后取出， 14000rpm离心30分钟， 留沉淀去除上清。 每管每 。

39、次加入500mL的-20的冰丙酮吹打混悬， 14000rpm离心30分钟， 重复三次。 放置于真空浓缩 仪中干燥， 除去残留的丙酮。 0050 4.蛋白的还原、 烷基化及酶解： 取出干燥的沉淀， 加入8M的尿素溶液(溶剂配置： 24g尿素+100 LTris-HCl缓冲液(500mM， pH8.5)+220 L双蒸水)， 超声加速溶解。 待沉淀完全 溶解后， 加入TCEP， 使其在溶液中的终浓度达到5mM， 放置于加热振动干浴器， 650rpm， 室温 振动20分钟。 加入碘乙酰胺， 使其在溶液中的终浓度达到10mM， 避光， 置于加热振动干浴器， 650rpm， 室温振动20分钟。 用100。

40、mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)稀释， 使溶液中尿素的浓度稀 释为2M， 按照1 50(胰酶 蛋白底物， w/w)比例加入胰酶酶解， 置于加热振动干浴器， 650rpm， 37振动反应16-20小时。 最后加入一定体积的100纯度的FA， 使其在溶液中的浓度达到 5， 酸化溶液， 终止酶解反应。 0051 5.样品的脱盐： 选用Monospin C18脱盐小柱脱盐。 依照其说明书操作， 将含有样品 说明书 6/11 页 9 CN 111965292 A 9 的洗脱液放置真空浓缩仪中干燥， 粉末状保存。 0052 实施例2-色谱柱的制备和上样 0053 1.含tip尖端的毛细管制备：。

41、 取大约55cm长度的石英毛细管， 用酒精灯的外焰烧去 毛细管中间部分的聚酰亚胺外层， 用擦拭纸蘸取甲醇将烧灼部分擦干净， 放置于镭射微吸 管拉针器中制备成含有tip尖端的毛细管待用。 0054 2 .含Kasil堵头的毛细管制备： 选用15cm-20cm长， 250m内径的未脱活 (undeactivated)类型的石英毛细管， 将硅酸钾溶液和甲酸铵溶液按照3 1(v/v) 混合均匀， 现用现配， 利用毛细现象使混合液进入石英毛细管一端， 之后100烘箱放置4小 时， 使进入毛细管中的混合液形成多孔多聚物。 使用前将堵头用陶瓷切片切至0.5-1mm长 度， 用于后续SCX柱的填料。 0055。

42、 3.色谱柱的填料填充： 选用相应的固相填料(Aqua 5 m C18； Aqua 3 m C18； 5 mSCX)装于1.5mL Eppendorf管中， 加入适量体积的甲醇， 涡旋使其混合均匀， 将该1.5mL Eppendorf管置于气泵中， 封闭气泵， 将需要填料的毛细管置于气泵相应的位置， 拧紧后， 开 启气泵连接氮气罐的阀门， 用大约100bar的气压将混合有填料的甲醇压入制备好的毛细管 中。 分析柱的填料是Aqua 5 m C18， 填料长度为15cm； SCX柱部分的填料粒径5 m， 填料长度 为5cm。 毛细管填好填料后， 用A相以大于100bar的压力平衡柱子， 压紧填料。。

43、 此外， 使用前分 析柱需用一定体积的乙腈活化， SCX柱需用一定体积的500mM乙酸铵活化。 0056 4.样品上样： 上样前， 需用一定体积的A相平衡SCX柱。 用含有0.1(v v)甲酸的水 复溶样品， 按照和填充色谱柱填料相同的方式将实施例1中的样品上至SCX柱上。 之后用至 少5个柱体积的A相平衡SCX柱。 0057 实施例3-LC-MS/MS分析 0058 3.1经典MudPIT的装置设置及其液相设置分别如下所述。 0059 (1)经典MudPIT的装置设置： 经典MudPIT的装置如图1所示： PEEK微型三通一端连 接液相色谱泵， 另一端连接SCX色谱柱， 垂直流路的一端连接质。

44、谱的液接电压装置。 液接电 压装置是通过金属电极在色谱柱的初始端在流动相施加电压， 使分析物带电的设备。 SCX柱 之后通过PEEK微型两通和分析柱相连。 0060 (2)经典MudPIT的液相设置： 在此实验中使用的液相是Thermo EASY-nLCTM1200液 相装置， 其通过将不同浓度的乙酸铵放置在样品盘相应的位置， 通过上样的方式吸取一定 体积不同浓度的乙酸铵， 实现SCX的分级分离， 将结合在SCX上的肽段洗脱至后面连接的C18 分析柱上。 乙酸铵上样的参数设置如下： Sample pickup， 6 L； sample loading， 15 L。 此外 梯度开始前分析柱平衡4。

45、 L。 由于样品是复杂的细胞裂解液， 所以采用的是SCX10个分级的 洗脱过程， 洗脱的乙酸铵的浓度依次为50mM、 100mM、 150mM、 200mM、 250mM、 300mM、 350mM、 400mM、 450mM、 500mM。 梯度设置如下： 梯度开始于3B相； 经100分钟， 从3B相升到35B 相； 经10分钟， 从35B相到50B相； 经5分钟， 从50B相到100B相； 100B相持续5分钟 洗脱分析柱中残留的肽段， 流速设置300nl/分钟。 0061 3.2 PC-MudPIT的装置设置及液相设置分别如下所述。 0062 (1)PC-MudPIT的装置设置： 相对于。

46、现有的MudPIT， 改进的PC-MudPIT(Parallel Channels-MudPIT)的装置如图2A所示： SCX柱的一端连接液相泵， 另一端连接六通阀的一个 入口； 同时另设另一台液相泵(例如在本实施例中为RP液相泵)连接至六通阀的另一个入 说明书 7/11 页 10 CN 111965292 A 10 口。 该六通阀的两个出口各自通过PEEK微型三通连接一个RP分析柱(因此在该实施例中共 有两个PEEK微型三通和两个RP分析柱)， 每个PEEK微型三通的一端连接六通阀， 另一端连接 RP色谱柱， 垂直流路的一端连接质谱的液接电压装置。 所述的两个RP分析柱各自可以在对 准或或不。

47、对准质谱(MS)的离子源入口的两个状态中进行切换， 但不会同时对准质谱入口。 通过使用具有该结构的PC-MudPIT， 在进行RP分析前， 可将由SCX洗脱用的乙酸铵从通路中 除去， 使得RP洗脱肽段进入质谱时， 乙酸铵不随着肽段进入质谱分析器中。 0063 如图2B和图2C所示， PC-MudPIT的工作模式如下： (1)如图2B所示， 此步骤中RP分析 柱1通过六通阀和SCX分析柱及SCX液相泵连接且不对准质谱的离子源入口， 而RP分析柱2通 过六通阀和RP液相泵连接且对准质谱的离子源入口； 在该装置的工作开始后， 在肽段由乙 酸铵从SCX柱上洗脱至RP分析柱1(C18分析柱1)上后， 用。

48、一定体积的A相冲洗结合有洗脱蛋 白的分析柱1； 由于乙酸铵和C18填料不结合， 因此， 随着A相的流动可将乙酸铵从分析柱上 洗脱下来； (2)如图2C所示， 在乙酸铵从RP分析柱1上的冲洗工作完成之后， 将RP分析柱1的 位置切换至对准质谱离子源的入口的位置并RP分析柱2的位置切换至不对准该质谱离子源 的入口的位置； 与此同时， 通过切换六通阀的状态， 使得RP分析柱1和RP液相装置(液相泵) 的通路相连接， 并使得RP分析柱2与SCX柱及SCX液相泵相连接； 通过六通阀的状态改变以及 RP分析柱1&2的位置切换， 可通过该装置用乙腈的梯度洗脱将结合在RP分析柱1上的肽段洗 脱进入质谱， 并且。

49、使得SCX上结合的肽段由下一个浓度梯度的乙酸铵洗脱至不对准质谱的 RP分析柱2(C18分析柱2)上并用A相冲洗去除分析柱2上的乙酸铵。 (3)待RP分析柱1的RP梯 度洗脱以及RP分析柱2上的乙酸铵的冲洗去除完成后， 再次交换两个分析柱的位置并切换 六通阀状态， 使得PC-MudPIT返回至步骤(1)的状态(即图2B所示的状态)继续进行工作， 并 在RP分析柱1上的冲洗工作完成之后重复步骤(2)； 如此往复循环直至分析工作结束。 在上 述过程中， 分析柱位置及六通阀状态的切换通过计算机程序进行控制。 0064 在上述装置中， SCX液相装置流路和SCX柱连接后用50 m365 m毛细管接入六通。

50、 阀， RP液相装置流路用50 m365 m毛细管接入六通阀， 之后从六通阀同样用50 m365 m 毛细管经PEEK微型三通和两根分析柱相连。 六通阀的状态和分析柱的位置一一对应， 只有 分析柱在接入RP液相装置流路的状态下， 分析柱的位置才处于对准质谱离子源位置。 0065 (2)PC-MudPIT的液相设置： 对比经典的MudPIT， 由于该模式下需要同时运行至少 三个流动相流路， 所以需要两台nano-LC两通路液相装置： RP液相装置用于分析柱RP梯度的 洗脱， 使用的是Thermo UltiMateTM 3000 Series； SCX液相装置用于SCX柱的洗脱及后续乙 酸铵的冲洗。