用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制备方法和其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010543985.8 (22)申请日 2020.06.15 (71)申请人 江苏安泰生物技术有限公司 地址 225326 江苏省泰州市中国医药城四 期G60西南门四楼安泰生物 (72)发明人 闫小君罗进 (74)专利代理机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 代理人 尹玮 (51)Int.Cl. C07K 14/165(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 5/0784(2010.01) A61K 39/215(2006.。

2、01) A61K 35/17(2015.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 11/00(2006.01) (54)发明名称 一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药 物组合物及其制备方法和其应用 (57)摘要 本发明提供了SARS CoV2单表位T细胞抗原 肽、 由该抗原肽制备得到的多能T细胞表位肽， 以 及负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞， 可在体 内诱导MHCI途径的T细胞免疫， 重建机体免疫功 能， 激发自体CD8+CTL的抗病毒功能， 为冠状病毒 感染相关疾病的预防和/或治疗提供了更有效、 更安全的手段， 具有广阔的临床应用和推广前 景。 权利要求书1页 说明书7。

3、页 CN 111978376 A 2020.11.24 CN 111978376 A 1.一种单表位T细胞抗原肽， 其特征在于， 所述的单表位T细胞抗原肽选自FLLVTLAIL、 FLFLTWICL、 SMWSFNPET中的任意一种或其组合。 2.一种多能T细胞表位肽， 其特征在于， 所述多能T细胞表位肽具有式I所示的结构， 其中， X为碱性氨基酸， Z为单表位T细胞抗原肽， 优选为FLLVTLAIL、 FLFLTWICL、 SMWSFNPET中的任意一种或其组合。 3.根据权利要求2所述的多能T细胞表位肽， 其特征在于， 所述的多能T细胞表位肽的N 端由棕榈酰丝氨酸修饰。 4.根据权利要求3。

4、所述的多能T细胞表位肽， 其特征在于， 所述的棕榈酰丝氨酸以-AAA- 柔性连接的方式进行多能T细胞表位肽的修饰。 5.一种诱导产生负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 1)分离外周血或骨髓单核细胞； 2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)制得的单核细胞， 将其分化为成熟的DC细胞； 3)使用权利要求2-4任一项所述的多能T细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟的DC细胞， 即得。 6.根据权利要求5所述的方法获得的负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞。 7.一种药物组合物， 其特征在于， 其包含根据权利要求1所述的单表位T细胞抗原肽、 根 据权利要求2-4任。

5、一项所述的多能T细胞表位肽和/或根据权利要求6所述的DC细胞。 8.根据权利要求1所述的单表位T细胞抗原肽、 根据权利要求2-4任一项所述的多能T细 胞表位肽和/或根据权利要求6所述的DC细胞在制备用于预防和/或治疗肺炎的药物中的应 用。 9.根据权利要求7所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺炎的药物中的应用。 10.根据权利要求8或9所述的应用， 其特征在于， 所述肺炎为病毒性肺炎。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111978376 A 2 一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制 备方法和其应用 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体涉及一种用于预防和/或。

6、治疗冠状病毒感染的药 物组合物及其制备方法和其应用。 背景技术 0002 SARS CoV-2感染会导致2019冠状病毒病(COVID-19)， 病情严重情况下会导致感染 者的死亡。 目前尚未开发出针对SARS CoV-2感染有效的治疗药物。 若能开发出有效的SARS CoV-2药物， 必将对阻断病毒的传播、 控制疫情继续爆发挥关键性作用。 0003 截至目前， 已有多项SARS CoV-2疫苗项目进入临床试验阶段。 美国国家卫生研究 院下属的国家过敏症和传染病研究所与莫德纳公司合作研发的mRNA疫苗mRNA-1273于2020 年3月5日获FDA批准进入临床试验， 3月16日开始了 期临床试。

7、验。 由军事医学研究院生物工 程研究所与康希诺生物联合开发的重组新型冠状病毒疫苗(表达SARS CoV-2S抗原的重组 腺病毒载体)Ad5-nCoV于2020年3月 18日获得国家药品食品监督管理局(NMPA)的临床批 准。 由德国 BioNTech生物技术公司与美国辉瑞公司合作开发的mRNA疫苗BNT- 162于2020 年4月22日在德国首次获批进行I/II期临床试验。 临床进展较快的SARS CoV-2疫苗多为传 统的蛋白类疫苗或核酸类疫苗。 0004 靶向树突细胞(Target-Dendritic Cell， 简称T-DC)技术可诱导T细胞免疫， 重建 机体免疫功能并激发自体抗病毒或抗。

8、肿瘤功能， 达到预防和/或治疗相关疾病的目的， 并具 有靶向性好、 安全性高等特点。 该疗法已于2018年10月获得肝癌治疗性疫苗美国FDA孤儿药 资质。 Luo等(Vaccine， vol28， issue13， pp2497-2504,2010)公开了基于T-DC技术的乙肝疫 苗药物， 380例慢性肝炎患者经该疫苗药物治疗后,总有效率约为85， 临床治愈率约为 40。 0005 为满足COVID-19临床治疗的迫切需求， 本发明创新性地提出了基于T-DC治疗技术 开发的抗SARS CoV-2感染的药物组合物及其制备方法和其应用， 为COVID-19及其相关疾病 的预防和/或治疗提供了新的选。

9、择。 发明内容 0006 本发明的目的之一在于提供SARS CoV-2的单表位T细胞抗原肽， 所述的单表位T细 胞抗原肽选自FLLVTLAIL、 FLFLTWICL、 SMWSFNPET 的任一种或其组合。 0007 本发明的另一目的在于提供一种多能T细胞表位肽， 所述的多能 T细胞表位肽具 有式 所示结构： 说明书 1/7 页 3 CN 111978376 A 3 0008 0009 其中， X为碱性氨基酸， Z为单表位T细胞抗原肽。 0010 本发明的优选技术方案中， 所述的碱性氨基酸选自精氨酸(R)、 赖氨酸(K)、 组氨酸 (H)的任一种。 0011 本发明的优选技术方案中， 所述的单。

10、表位T细胞抗原肽选自 FLLVTLAIL、 FLFLTWICL、 SMWSFNPET的任一种或其组合。 0012 本发明的另一目的在于提供一种诱导产生负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞的 方法， 包括以下步骤： 0013 1)从外周血或骨髓中分离单核细胞， 使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14 +细胞； 0014 2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)分选的CD14+细胞， 将CD14+ 细胞分化为成熟的 DC细胞； 0015 3)使用多能T细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟DC细胞， 即得负载所述多能T细胞 表位肽的DC细胞。 0016 本发明的优选技术方案中， 采用白细胞分离法。

11、从外周血或骨髓分离所述单核细 胞。 0017 本发明的优选技术方案中， 将步骤2)的DC细胞进行分子标记染色， 以确认所述 CD14+细胞分化为成熟的DC细胞。 0018 本发明的优选技术方案中， 所述的方法包括以下步骤： 0019 1)采用白细胞分离法从外周血或骨髓中分离单核细胞， 使用CD14 磁珠从所述单 核细胞中分选出CD14+细胞； 0020 2)将步骤1)分选的CD14+细胞重悬于含有30ng/ml IL-4和60 ng/ml GM-CSF的 RPMI-1640培养基中， 将所述CD14+细胞分化为DC 细胞， 在培养过程中取样， 并对所述样品 进行分子标记CD86、 CD40、 。

12、CD80、 HLA-DR和MHC-I染色， 当所述分子标记均呈阳性时， 制得成 熟的DC细胞； 0021 3)使用多能T细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟的DC细胞， 即得负载所述多能T细 胞表位肽的DC细胞。 说明书 2/7 页 4 CN 111978376 A 4 0022 本发明的另一目的在于提供所述方法获得的负载所述多能T细胞表位肽的DC细 胞。 0023 本发明的另一目的在于提供一种药物组合物， 所述的药物组合物含有单表位T细 胞抗原肽和药学上可接受的载体。 0024 本发明的另一目的在于提供一种药物组合物， 所述的药物组合物含有多能T细胞 表位肽和药学上可接受的载体。 0025 本发。

13、明的另一目的在于提供一种药物组合物， 所述药物组合物包含所述负载所述 多能T细胞表位肽的DC细胞和药学上可接受的载体。 0026 本发明的另一目的在于提供所述的单表位T细胞抗原肽、 多能T 细胞表位肽、 或负 载所述多能T细胞表位肽的DC细胞用于制备预防和/或治疗肺部疾病、 肺部病变后功能修复 的药物中的应用。 0027 本发明的优选技术方案中， 所述肺部疾病为肺炎。 0028 本发明的优选技术方案中， 所述肺炎选自细菌、 病毒、 真菌、 非典型病原体感染、 理 化因素的任一种或其组合所引发的肺炎。 0029 本发明的优选技术方案中， 所述细菌选自肺炎球菌、 金黄色葡萄球菌的任一种或 其组合。。

14、 0030 本发明的优选技术方案中， 所述病毒选自流感病毒、 冠状病毒、 腺病毒、 巨细胞病 毒、 科萨奇病毒、 麻疹病毒、 副流感病毒的任一种或其组合。 0031 本发明的优选技术方案中， 所述流感病毒选自甲型流感病毒、 乙型流感病毒中的 任一种或其组合。 0032 本发明的优选技术方案中， 所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、 SARS- CoV-2、 MERS、 229E、 NL63、 OC43、 HKU1中的任一种或其组合。 0033 本发明的优选技术方案中， 所述真菌选自白念珠菌、 曲霉的任一种或其组合。 0034 本发明的优选技术方案中， 所述非典型病原体选自军团菌、 支原体的任。

15、一种或其 组合。 0035 本发明的优选技术方案中， 所述理化因素选自放射性、 胃酸吸入的任一种或其组 合。 0036 本发明的优选技术方案中， 所述预防和/或治疗SARS-CoV-2所引发的肺炎选自阻 断SARS-CoV-2对肺部的入侵、 抑制和/或杀灭SARS- CoV-2、 免疫调节、 改善肺炎症状中的任 一种或其组合。 0037 本发明的优选技术方案中， 所述免疫调节选自提高免疫力、 减少自身免疫对肺组 织的攻击的任一种或其组合。 0038 本发明的优选技术方案中， 所述改善肺炎症状选自改善肺炎引起的发热、 乏力、 干 咳、 鼻塞、 流涕、 单纯性感染、 轻症肺炎、 重症肺炎、 急性呼。

16、吸窘迫综合征、 脓毒症、 脓毒症休 克、 代谢性酸中毒、 凝血功能障碍中的任一种症状或其组合症状。 0039 本发明的另一目的在于提供包含所述单表位T细胞抗原肽、 多能 T细胞表位肽、 或 负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞的药物组合物用于制备预防和/或治疗肺部疾病、 肺部 病变后功能修复的药物中的应用。 0040 本发明的优选技术方案中， 所述肺部疾病为肺炎。 说明书 3/7 页 5 CN 111978376 A 5 0041 本发明的优选技术方案中， 所述肺炎选自细菌、 病毒、 真菌、 非典型病原体感染、 理 化因素的任一种或其组合所引发的肺炎。 0042 本发明的优选技术方案中， 所述细。

17、菌选自肺炎球菌、 金黄色葡萄球菌的任一种或 其组合。 0043 本发明的优选技术方案中， 所述病毒选自流感病毒、 冠状病毒、 腺病毒、 巨细胞病 毒、 科萨奇病毒、 麻疹病毒、 副流感病毒的任一种或其组合。 0044 本发明的优选技术方案中， 所述流感病毒选自甲型流感病毒、 乙型流感病毒中的 任一种或其组合。 0045 本发明的优选技术方案中， 所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、 SARS- CoV-2、 MERS、 229E、 NL63、 OC43、 HKU1中的任一种或其组合。 0046 本发明的优选技术方案中， 所述真菌选自白念珠菌、 曲霉的任一种或其组合。 0047 本发明的优选技。

18、术方案中， 所述非典型病原体选自军团菌、 支原体的任一种或其 组合。 0048 本发明的优选技术方案中， 所述理化因素选自放射性、 胃酸吸入的任一种或其组 合。 0049 本发明的优选技术方案中， 所述预防和/或治疗SARS-CoV-2所引发的肺炎选自阻 断SARS-CoV-2对肺部的入侵、 抑制和/或杀灭SARS- CoV-2、 免疫调节、 改善COVID-19症状中 的任一种或其组合。 0050 本发明的优选技术方案中， 所述免疫调节选自提高免疫力、 减少自身免疫对肺组 织的攻击的任一种或其组合。 0051 本发明的优选技术方案中， 所述改善COVID-19症状选自改善肺炎引起的发热、 乏。

19、 力、 干咳、 鼻塞、 流涕、 单纯性感染、 轻症肺炎、 重症肺炎、 急性呼吸窘迫综合征、 脓毒症、 脓毒 症休克、 代谢性酸中毒、 凝血功能障碍中的任一种症状或其组合症状。 0052 本发明的另一目的在于提供一种药物组合物， 其包含所述单表位 T细胞抗原肽、 多能T细胞表位肽、 负载所述多能T细胞表位肽的DC 细胞、 或包含所述T细胞抗原肽、 多能T 细胞表位肽、 负载所述多能 T细胞表位肽的DC细胞的药物组合物， 和其他类型的抗病毒或 抗菌药物。 0053 本发明的优选技术方案中， 所述的抗病毒药物或抗菌药物选自 -干扰素、 -干扰 素、 -干扰素、 干扰素 -1b、 干扰素- 2b、 白。

20、蛋白、 丙种球蛋白、 CR3022(大分子单抗药物)、 法匹拉韦、 瑞德西韦、 磷酸奥司他韦、 巴洛沙韦(Baloxavir)、 羟基氯喹、 羟基磷酸氯喹、 洛匹 那韦/利托那韦、 利巴韦林、 阿比多尔、 盐酸阿比多尔、 糖皮质激素、 藿香正气胶囊、 藿香正气 丸、 藿香正气水、 藿香正气口服液、 金花清感颗粒、 连花清瘟胶囊、 连花清瘟颗粒、 疏风解毒 胶囊、 疏风解毒颗粒、 防风通圣丸、 防风通圣颗粒、 阿莫西林、 阿奇霉素、 头孢氨苄、 头孢呋辛 酯、 头孢克肟、 头孢地尼中的任一种或其组合。 0054 本发明的优选技术方案中， 本发明所述的肺泡吸入组合物与其他药物联合用药 时， 采取顺。

21、序给药、 先后给药、 同时给药的任一种方式联合给药。 0055 除非另有说明， 本发明涉及液体与液体之间的百分比时， 所述的百分比为体积/体 积百分比； 本发明涉及液体与固体之间的百分比时， 所述百分比为体积/重量百分比； 本发 明涉及固体与液体之间的百分比时， 所述百分比为重量/体积百分比； 其余为重量/重量百 说明书 4/7 页 6 CN 111978376 A 6 分比。 0056 与现有技术相比， 本发明具有下述有益技术效果： 0057 1.建立了基于T细胞表位肽和DC细胞的个体化细胞疗法， 可在体内诱导MHC-I途径 的T细胞免疫， 重建机体免疫功能， 激发自体 CD8+CTL的抗病。

22、毒功能， 兼具传统疫苗的预防 功能及传统药物的治疗效果。 0058 2.采用了单表位多聚抗原肽(SEA-MAP)， 易被DC细胞识别， 特异性更强； 分枝状多 肽的设计可增加抗原肽的分子量和生物活性， 使连接的表位肽的朝向具有一致性， 在单位 空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性， 提高了CTL的作用数量和作 用效率， 且被DC细胞摄取后不会进入细胞核， 具有较好的安全性。 0059 3.采用自体外周血细胞转化的树突(DC)细胞经体外负载SEA- MAP T细胞表位肽， 进而培养成的靶向树突(DC)细胞作为治疗剂， 在体内产生免疫应答反应， 具有不易产生排 异反应的效果， 有效。

23、提高了治疗的靶向性及药物的安全有效性。 0060 4.将T-DC治疗技术有效地应用到了抗病毒， 尤其是抗冠状病毒感染领域， 为冠状 病毒感染相关疾病的预防和/或治疗提供了更有效、 更安全的手段， 具有广阔的临床应用和 推广前景。 具体实施方式 0061 以下对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发明， 并非用于限 定本发明的范围。 0062 实施例1抗原肽的制备 0063 应用软件CLC Protein Workbench 5.8版本和Signal P5.0软件、 SYFPE1TH1远程 预测数据库、 PREDEPP数据库对SARS CoV-2 Env 蛋白及细胞膜糖蛋白中的潜在。

24、T细胞单表 位进行筛选， 获得潜在HLA- A2限制性单表位T细胞抗原肽三条： FLLVTLAIL、 FLFLTWICL、 SMWSFNPET。 0064 所述单表位T细胞抗原肽及树状多能T细胞表位肽可通过常规固相合成法进行合 成。 也可将各表位肽的氨基酸序列交由多肽合成公司进行合成。 0065 实施例2负载多能T细胞表位肽的树突状细胞的制备 0066 负载多能T细胞表位肽的树突状细胞的制备方法， 包括下述步骤： 0067 将人外周血的PBMC用CD14+磁珠标记， 在磁场中分离出 CD14+PBMC； 将分选得到的 细胞在DC培养袋中加入IL-4(终浓度为 30ng/ml)， GM-CSF(。

25、终浓度为60ng/ml)于37、 5 CO2培养箱中共培养， 培养液为PRMI1640(含10胎牛血清， 0.1ml青-链霉素)， 每3天半量更 换1次培养液， 同时补加IL-4和GM-CSF， 诱导树突状细胞的生成。 培养10天后， 通过流式细胞 仪筛选出高表达HLA-I (77.31)， HLA-Dr(0.84)， CD80(90.32)， CD86(88.05)， 部分 表达CD40(35.21)的细胞， 作为目的DC细胞。 0068 将终浓度0.1mg/L多能T细胞表位肽与1*106个/L的目的DC细胞在37下共培养 24h， 收集活化的树突状细胞， 即得。 0069 实施例3负载多能。

26、T细胞表位肽的DC细胞对于T细胞的增殖效应 0070 采用WST-1试剂盒(ab155902， Abcam)检测包含多能T细胞表位肽的DC细胞对于T淋 巴细胞的增殖的刺激效应。 对照组及试验组分别为： 未转化抗原肽的DC细胞组、 空白T细胞 说明书 5/7 页 7 CN 111978376 A 7 组、 负载多能T细胞表位肽的DC细胞组， 及空白对照组。 0071 具体测定方法如下： 0072 取96孔细胞培养板， 每孔中加0.1ml含2105人外周血T淋巴细胞的RPMI1640(含 0.3w/wPHA)培养液,在375CO2培养2小时后， 负载多能T细胞表位肽的DC细胞组加入 0.1ml(含。

27、2104个细胞)的负载多能T细胞表位肽的DC细胞， 未转化抗原肽的DC细胞组加入 0.1ml(含2104个细胞)的未转化抗原肽的DC细胞， 空白 T细胞组加入0.1ml(含2104个细 胞)的人外周血T淋巴细胞， 空白对照组加入0.1ml RPMI1640培养液。 0073 在375CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养48小时， 每孔加入10 l WST-1溶 液， 继续在375CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。 置酶联检测仪上测定光密 度(OD)值， 检测波长430nm， 参考波长650nm。 0074 结果见表1。 0075 表1 0076 组别 OD值 空白对照组 0.30.2。

28、5 DC细胞组 0.40.23 空白T细胞组 0.30.49 表位肽1-DC细胞组 1.20.89 表位肽2-DC细胞组 2.30.12 表位肽3-DC细胞组 1.90.32 0077 结果显示， 负载多能T细胞表位肽的DC细胞能有效刺激T淋巴细胞的增殖， 与其他 组别有显著差异(p0.05)。 0078 实施例4 -IFN分泌 0079 采用ELISPOT法检测经负载多能T细胞表位肽的DC细胞刺激后的释放-IFN的T细 胞频数。 对照组及试验组分别为： 未转化的DC 细胞组、 T细胞组、 负载多能T细胞表位肽的DC 细胞组及空白对照。 0080 具体测定方法如下： 0081(1)将15 L 。

29、35乙醇(v/v， 溶剂为无菌)加入到 ELISPOT板(cat： MSIPS4510， Millipore)的各个孔中， 1分钟后采用150 L无菌PBS冲洗3次， 去除洗涤缓冲液； 0082 (2)每孔加入100 L IFN-捕获抗体(Cat.#ELI-016-H， Millipore， 10 g/mL， 溶 于无菌PBS中)， 4孵育过夜； 0083(3)去除抗体溶液， 用150 L无菌Milli-水冲洗各孔， 以除去未结合的抗体， 冲洗 3次； 0084 (4)于各孔中加入150ul无菌RPMI1640细胞培养液(含10胎牛血清)， 37下放置 2h； 0085 (5)吸除各孔中的细胞。

30、培养液， 加入含2105人外周血T淋巴细胞的RPMI1640(含 0.3w/wPHA)培养液100 L， 375CO2培养 2小时后， 负载多能T细胞表位肽的DC细胞组 加入100 l(含2 104个细胞)的负载多能T细胞表位肽的DC细胞， 未转化抗原肽的DC 细胞 组加入100 l(含2104个细胞)的未转化抗原肽的DC细胞， 空白T细胞组加入100 l(含2 104个细胞)的人外周血T淋巴细胞， 空白对照组加入100 l RPMI1640培养液， 37， 5CO2 说明书 6/7 页 8 CN 111978376 A 8 孵箱中孵育48h,孵育期间勿晃动ELISpot板； 0086(6)甩。

31、去板中液体， 每孔采用200 L PBS/0.0120充分洗涤6次； 0087 (7)每孔加入100 L在无菌PBS中以1:1000稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶偶联物 (Streptavdin-AP)， 室温孵育45分钟； 0088(8)甩去板中液体， 每孔采用200 L PBS/0.0120洗涤3次， 然后再用PBS 洗涤3次； 0089 (9)加入100 L/孔BCIP/NBT显色底物， 室温避光孵育30分钟； 0090 (10)甩除显色剂， 去离子水冲洗5次,洁净吸水纸上拍干， 4避光放置过夜后， 采 用ELISPOT分析仪对斑点进行计数。 0091 结果见表2。 0092 表2 0093 组别 斑点数 空白对照组 10.34 DC细胞组 30.46 空白T细胞组 20.87 表位肽1-DC细胞组 190.67 表位肽2-DC细胞组 160.84 表位肽3-DC细胞组 270.48 0094 结果显示， 负载多能T细胞表位肽的DC细胞能有效刺激T细胞的IFN-分泌(与其 他组别有显著差异(p0.05)， 从而有效激发自体CD8+CTL的抗病毒功能。 0095 以上所述仅为本发明较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原 则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 111978376 A 9 。