Arthrobacter sp AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010736309.2 (22)申请日 2020.07.28 (71)申请人 江苏海洋大学 地址 222000 江苏省连云港市海州区苍梧 路59号 (72)发明人 杭加豪刘姝卢静杨光 张春光黄志发刘耀东 其他发明人请求不公开姓名 (74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 代理人 严志平 (51)Int.Cl. C12N 9/80(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/70(2006.01) (54)发明名称 一种A。

2、rthrobacter sp. AW19M34-1几丁质 脱乙酰酶突变体 (57)摘要 本 发 明 公 开 了 一 种A r t h r o b a c t e r sp.AW19M341几丁质脱乙酰酶突变体， 其特征在 于： 将海洋细菌Arthrobacter sp.AW19M341几 丁质脱乙酰酶氨基酸序列进行了如下突变： 172 位赖氨酸K突变为谷氨酸E， 200位谷氨酸E突变为 酪氨酸Y， 201位丝氨酸S突变为色氨酸W， 其中 Arthrobacter sp.AW19M341几丁质脱乙酰基酶 基因密码子优化序列如附录1所示， 其中海洋细 菌Arthrobacter sp.AW19M3。

3、41几丁质脱乙酰酶 氨基酸序列GenBank收录号为AW19M341； 本发明 通过定点突变改造几丁质脱乙酰酶基因， 使所编 码的几丁质脱乙酰酶催化活性增加， 酶的其它催 化特性基本不变， 突变酶催化晶体几丁质脱乙酰 活性是野生型酶的2.57倍， 本发明提供的几丁质 脱乙酰酶相较于野生型酶， 适用于适工业化生 产， 具有更高的经济价值和社会价值， 值得推广。 权利要求书2页 说明书4页 序列表2页 CN 111979218 A 2020.11.24 CN 111979218 A 1.一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体， 其特征在于： 将海洋细 菌Art。

4、hrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列进行了如下突变： 172位赖氨 酸K突变为谷氨酸E， 200位谷氨酸E突变为酪氨酸Y， 201位丝氨酸S突变为色氨酸W， 所述 Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列如附录1所示， 所述 海洋细菌Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列GenBank收录号为 AW19M34-1。 2.根据权利要求1所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体， 其特征在于： 编码Arthrobacter sp. AW19。

5、M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的基因。 3.携带权利要求2所述基因的质粒和细胞， 其中质粒pET21a(+)， 用于克隆的感受态细 胞： E. coli DH5 ； 用于表达的感受态细胞： E.coli BL21 （DE3） 。 4.一种如权利要求1所述的Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制 备方法， 其特征在于： 通过设计引物对编码几丁质脱乙酰酶的基因进行定点突变后表达， 具 体包括如下步骤： （1） 以质粒pET-21a为模板设计引物进行突变； （2） 将突变后的质粒转化进入E. coli DH5 进行扩增； （3） 以E. coli BL21 （D。

6、E3） 表达含突变基因的重组质粒， 得到活性增强的几丁质脱乙酰 酶突变体； （4） 将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21 （DE3） （pET21a- mut4） 活化培养后发酵培养， 获取发酵菌； （5） 破碎发酵菌体， 离心收集上清液， 制备获得Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱 乙酰酶的粗酶液； （6） 按照His60 Ni Gravity Column Purification Kit （Takara, Code No. 635658） 说明书进一步纯化。 5.根据权利要求4所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34。

7、-1几丁质脱乙酰酶突变体的 制备方法， 其特征在于： 所述定点突变的引物如下： ES200YW primer F： ACATTCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAG ES200YW primer R： TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAGAATG K172E primer F： GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAG K172E primer R： CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。 6.根据权利要求4所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34。

8、-1几丁质脱乙酰酶突变体的 制备方法， 其特征在于： 所述发酵培养具体操作为： 将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因 的重组菌E.coli BL21 （DE3） （pET21a-mut4） 活化培养后接种到含有100 g/mL氨苄青霉素的 发酵培养基中， 接种量为1%， 于37200 r/min培养至OD600为0.6， 加入终浓度0.5mM IPTG， 30诱导发酵12h， 发酵结束后在4、 12000 r/min条件下冷冻离心5min收集菌体， 收集的 菌体按照1g菌体用10mL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)重悬， 并以超声波细胞粉碎仪破碎菌 体， 在4、 12000r/m。

9、in条件下冷冻离心5 min， 收集上清液作为粗酶液。 7.根据权利要求6所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的 制备方法， 其特征在于： 所述超声波细胞粉碎仪共超声5min， 每超声5s暂停5s。 8.根据权利要求6所述的一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的 权利要求书 1/2 页 2 CN 111979218 A 2 制备方法， 其特征在于： 所述氨苄青霉素的发酵培养基组成包括胰蛋白胨10g/L， 酵母提取 物5g/L， NaCl 10g/L， 培养基pH7.0。 权利要求书 2/2 页 3 CN 11。

10、1979218 A 3 一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 公开了海洋细菌一种Arthrobacter sp . AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体。 背景技术 0002 几丁质(Chitin)， 又称甲壳素， 由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)通过 -(1, 4)键连 接而成， 主要存在于节肢动物外骨骼、 软体动物内骨骼、 真菌和硅藻细胞壁中， 是自然界中 含量第二丰富的多糖， 几丁质虽含量丰富， 但不溶于水和一般有机溶剂， 严重限制开发应 用。 壳聚糖(Chitosan)是几丁质脱去55%以上。

11、乙酰基的产物， 也称脱乙酰甲壳素， 壳聚糖分 子链上的游离氨基使其溶解性能优于几丁质， 随着壳聚糖脱乙酰度增高， 其分子链上的游 离氨基增多， 溶解性能也越好； 此外壳聚糖还具有抗菌、 抗癌、 降低胆固醇、 降血压等生物活 性， 广泛应用于医药、 食品、 化工、 环保、 农业和化妆品等领域。 我国是世界最大的壳聚糖生 产国和出口国， 年产量超过3.5万吨， 其中90%用于出口。 目前， 壳聚糖的生产全部采用化学 浓碱法， 将几丁质浸于浓碱中进行高温反应， 其生产的壳聚糖主链中N-乙酰氨基葡糖和氨 基葡糖分布不均匀， 存在溶解性差， 平均分子质量和脱乙酰度不稳定等缺点， 同时化学浓碱 法不仅耗时。

12、长、 耗能高， 还会排放大量浓碱废液， 对环境造成严重污染。 几丁质脱乙酰酶 (Chitin deacetylase， CDA) 是一种可以催化几丁质脱去乙酰基的碳水化合物酶， 可被用 于壳聚糖的生物酶法生产， 生物酶法制备的壳聚糖具有脱乙酰程度一致、 脱乙酰度高、 分子 质量分布范围窄等优点， 更为关键的是， 生物酶法反应条件温和、 耗能低， 生产过程绿色环 保， 无有害废弃物， 是节能、 环境友好型的技术， 可实现壳聚糖的绿色生产。 0003 目前只几丁质脱乙酰酶可以催化晶体几丁质脱去乙酰基在工业应用中的成本较 高， 生物酶法制备壳聚糖难以扩大规模。 本发明公开了来自海洋细菌Arthrob。

13、acter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶， 可催化晶体几丁质脱乙酰基的几丁质脱乙酰酶。ArCE4的基因 序列已经测定(GenBank Accession No. LT630322.1)， 三级结构和催化脱乙酰机制也已经 明确， 由于ArCE4源于原核微生物， 易于在大肠杆菌中可溶性表达， 因此本发明将其分子改 造， 获得了一种高效催化晶体几丁质脱乙酰活性增加的突变酶。 发明内容 0004 本发明将海洋细菌Arthrobactersp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶进行了突变， 相 较于突变前， 突变体酶的比活力是野生型酶2.57倍， 大大提高了几丁质脱乙酰酶催化效率， 更加适合。

14、工业化生产需求， 其具体方案如下： 一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体， 其特征在于： 将海洋细菌 Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列进行了如下突变： 172位赖氨酸K 突变为谷氨酸E， 200位谷氨酸E突变为酪氨酸Y， 201位丝氨酸S突变为色氨酸W， 所述 Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列如附录1所示， 所述 海洋细菌Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶氨基酸序列GenBank收录号为 说明书 1/4 页 4 CN 11197。

15、9218 A 4 AW19M34-1。 0005 进一步的， 编码Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的基因。 0006 进一步的， 携带Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的基因的质 粒为pET21a(+)， 用于克隆的受态细胞： E. coli DH5； 用于表达的感受态细胞： E.coli BL21 （DE3） 。 0007 一种Arthrobacter sp.AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体的制备方法， 其特征在 于： 通过设计引物对编码几丁质脱乙酰酶的基因进行定点突变后表达， 具体包括如下步骤： （1） 以。

16、质粒pET-21a为模板设计引物进行突变； （2） 将突变后的质粒转化进入E. coli DH5 进行扩增； （3） 以E. coli BL21 （DE3） 表达含突变基因的重组质粒， 得到活性增强的几丁质脱乙酰 酶突变体； （4） 将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21 （DE3） （pET21a- mut4） 活化培养后发酵培养， 获取发酵菌； （5） 破碎发酵菌体， 离心收集上清液， 制备获得Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱 乙酰酶的粗酶液。 0008 进一步的， 所述定点突变的引物如下： ES200YW primer F： ACAT。

17、TCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAG ES200YW primer R： TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAGAATG K172E primer F： GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAG K172E primer R： CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。 0009 进一步的， 所述发酵培养具体操作为： 将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的 重组菌E.coli BL21 （DE3） （pET21a-mut4） 活化培养后接种到含有100 g/mL氨苄青霉。

18、素的发 酵培养基中， 接种量为1%， 于37200 r/min培养至OD600为0.6， 加入终浓度0.5mM IPTG， 30 诱导发酵12h， 发酵结束后在4、 12000 r/min条件下冷冻离心5min收集菌体， 收集的菌 体按照1g菌体用10mL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)重悬， 并以超声波细胞粉碎仪破碎菌体， 在4、 12000r/min条件下冷冻离心5 min， 收集上清液作为粗酶液。 0010 进一步的， 所述超声波细胞粉碎仪共超声5min， 每超声5s暂停5s。 0011 进一步的， 所述氨苄青霉素的发酵培养基组成包括胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物 5g。

19、/L， NaCl 10g/L， 培养基pH7.0。 0012 与现有技术相比， 本发明具有的有益效果如下： 本发明通过定点突变改造几丁质脱乙酰酶基因， 使所编码的几丁质脱乙酰酶催化活性 增加， 酶的其它催化特性基本不变， 突变酶催化晶体几丁质脱乙酰活性是野生型酶的2.57 倍， 本发明提供的几丁质脱乙酰酶相较于野生型酶， 适用于适工业化生产， 具有更高的经济 价值和社会价值， 值得推广。 具体实施方式 0013 本发明为了解决提高催化活性的几丁质脱乙酰酶的技术问题， 公开了一种 Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体， 该突变体是以GenBank收录号为 LT。

20、630322.1所示的Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶 （ArCE4） 为基础， 172位赖 说明书 2/4 页 5 CN 111979218 A 5 氨酸K突变为谷氨酸E， 200位谷氨酸E突变为酪氨酸Y， 201位丝氨酸S突变为色氨酸W， 所述 Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列如附录1所示。 0014 本发明还提供了确定突变氨基酸的方法： 通过BLAST对比ArCE4序列和其他对晶体 几丁质具有催化活性的几丁质脱乙酰酶序列， 找到不同的氨基酸位点， 下载ArCE4的三级结 构 （PDB ID： 5LFZ。

21、） ， 并通过Pymol软件进行分析， 172位赖氨酸K接近催化中心， 200位谷氨酸 E、 201位丝氨酸S接近底物结合区域， 突变后提高晶体几丁质催化脱乙酰活性。 0015 本发明提供构建所述几丁质脱乙酰酶突变体的方法： 通过设计引物对编码几丁质 脱乙酰酶的基因进行定点突变后表达， 其中构建方法根据ArCE4的DNA序列进行生物合成， 构建表达质粒pET21a-ArCE4， 以含有几丁质脱乙酰酶质粒为模板， 设计引物进行突变并将 突变后的质粒转化进入E. coli DH5 进行扩增， 然后以E. coli BL21 （DE3） 表达含突变基 因的重组质粒， 得到活性提高的突变体， 所述用于。

22、定点突变的引物如下所示： ES200YW primer F： ACATTCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAG ES200YW primer R： TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAGAATG K172E primer F： GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAG K172E primer R： CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。 0016 本发明公开了基因工程菌发酵生产所述几丁质脱乙酰酶突变体的方法， 具体是将 含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.c。

23、oliBL21 （DE3） （pET21a-mut4） 活化培养 后接种到含有100 g/mL氨苄青霉素的发酵培养基中， 接种量为1%， 于37200 r/min培养至 OD600为0.6， 加入终浓度0.5mM IPTG， 30诱导发酵12h； 其中所用培养基组成成分包括胰蛋 白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， NaCl 10g/L， 培养基pH7.0。 0017 实施例： 一、 突变表达质粒的构建及重组大肠杆菌的获得： 根据野生型酶基因设计引物， 并引入酶切位点， 所用引物如下： P1:5 -GGAATTCCATatgcaccaccaccaccaccacCAACCGGAACCGGTGG。

24、CGAC-3 (引入酶切位点 Nde I)； P2:5 -CCGCTCGAGTTACGGGTTGGTCTTGAAACGGTG-3 (引入Xho I酶切位点)， 以合成 的DNA序列为模板进行PCR扩增， PCR扩增反应体系为： Premix Taq (12.5 L)， P1(0.5 L)， P2(0.5 L)， 模板(0.5 L)， ddH2O (11 L)； PCR程序： 94预变性5min， 然后94 45 s， 60 30 s， 72 60 s， 循环35次； 72 延伸7 min； 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测后 测序。 将上述PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、 纯化。

25、， 与pET21a双酶切后16 过夜连 接； 转化E. coli DH5 ， 将重组菌株涂布于含有100 g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基内， 37 倒置培养过夜， 随机挑选若干个菌落于含有100g/mL氨苄青霉素的液体LB培养基内， 37 摇瓶培养过夜， 提取重组质粒pET21a-ArCE4， 测序验证后转化E. coli BL21(DE3)。 0018 通过BLAST对比ArCE4序列和其他对晶体几丁质具有催化活性的几丁质脱乙酰酶 序列， 找到不同的氨基酸位点， 下载ArCE4的三级结构(PDB ID： 5LFZ)， 并通过Pymol软件进 行分析， 发现172位赖氨酸K接近催化中心， 。

26、200位谷氨酸E、 201位丝氨酸S接近底物结合区 域。 0019 以含有几丁质脱乙酰酶质粒pET21a-ArCE4为模板， 设计引物进行突变并将突变后 的质粒转化进入E. coli DH5 进行扩增， 然后以E. coli BL21 （DE3） 表达含突变基因的重 组质粒， 得到活性提高的突变体， 其中所述用于定点突变的引物是： 说明书 3/4 页 6 CN 111979218 A 6 ES200YW primer F: ACATTCACTATTGGAGCGTGAAGGCGGTTCCGCAG ES200YW primer R: TTCACGCTCCAATAGTGAATGTCGTGCATCAG。

27、AATG K172E primer F： GTTGACACGCTGGATTGGGAGCACCACGACCCACAAAAG K172E primer R： CTTTTGTGGGTCGTGGTGCTCCCAATCCAGCGTGTCAAC。 0020 配制下列组成的PCR反应液： 0.25L Pyrobest DNA Polymerase(5 U/ L)， 5L 10 Pyrobest Buffer II， 4L dNTP Mixture(各2.5 mM)， 上游引物和下游引物 （20 M） 各1 L， 模板0.011ng， ddH2O补充至50L； PCR反应体系： 94变性5 min， 然后94。

28、 变性30 s， 55 退火30 s， 72 延伸5 min, 共30个循环， 最后72 延伸10 min反应结束。 扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测后测序。 将上述PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳、 纯化， 并和表达载体pET21a双酶切后， 1%的琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段， 按基因片段与载体的 摩尔比为3混合后16 过夜连接。 转化E. coli DH5 ， 将重组菌株涂布于含有100 g/mL氨 苄青霉素的固体LB培养基内， 37 倒置培养过夜， 随机挑选若干个菌落于含有100g/mL氨 苄青霉素的液体LB培养基内， 37 摇瓶培养过夜， 提取重组质粒pET21a-mu。

29、t4， 测序验证后 转化E. coli BL21(DE3)。 0021 二、 突变表达载体的转化： 制备培养基， 培养基组成成分包括胰蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， NaCl 10g/L， 培养 基pH7 .0。 将含有编码突变几丁质脱乙酰酶的基因的重组菌E.coli BL21 （DE3） （pET21a- mut4） 活化培养后， 接种到含有100 g/mL氨苄青霉素的发酵培养基中， 接种量为1%， 于37 200r/min条件下培养至OD600为0.6， 加入终浓度0.5mM IPTG， 以30诱导发酵12h， 发酵结束 后以4 、 12000r/min冷冻离心5min， 收集菌。

30、体。 将收集的菌体按照1 g菌体用10mL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)重悬， 以超声波细胞粉碎仪破碎菌体(200W， 超5 s， 停5 s， 共超声5 min)， 4 、 12000 r/min冷冻离心5 min， 收集上清液作为粗酶液； 制备获取的粗酶液， 按照 His60 Ni Gravity Column Purification Kit （Takara, Code No. 635658） 说明书一步纯 化重组酶。 本发明通过定点突变改造几丁质脱乙酰酶基因， 使所编码的几丁质脱乙酰酶催 化活性增加， 突变酶催化晶体几丁质脱乙酰活性是野生型酶的2.57倍。 酶的其它催化。

31、特性 基本不变， 本发明提供的几丁质脱乙酰酶更加适合工业化生产需求， 满足社会生产的要求。 0022 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到变化或替换， 都应涵 盖在本发明的保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。 说明书 4/4 页 7 CN 111979218 A 7 序列表 江苏海洋大学 一种Arthrobacter sp. AW19M34-1几丁质脱乙酰酶突变体 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 246 PRT Arthrobac。

32、ter sp. 1 Met Ser Met Ser Ser Arg Val Thr Pro Arg Leu Ser Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Cys Ala Ser Gln Pro Ser Glu Pro Gln 20 25 30 Pro Glu Pro Val Ala Thr Pro Pro Ala Val Asp Cys Ala Thr Thr Lys 35 40 45 Cys Val Ala Leu Thr Phe Asp Asp Gly Pro Gly Glu Tyr Thr Asn Arg 50 55 。

33、60 Leu Leu Asp Glu Leu Ser Glu Gln His Thr Pro Ala Thr Phe Phe Val 65 70 75 80 Leu Gly Lys Asn Val Lys Lys Tyr Pro Lys Thr Leu Lys Arg Met Val 85 90 95 Asp Glu Gly His Gln Ile Gly Ser His Thr Phe Asp His Lys Asp Ile 100 105 110 Thr Lys Leu Thr Ala Glu Gly Ile Glu His Glu Val Gln Trp Thr Asp 115 120 。

34、125 Glu Ala Ile Glu Gln Ala Ala Gly Val Lys Pro Gln Ile Leu Arg Pro 130 135 140 Pro Tyr Gly Ala His Gly Ala Val Tyr Asp Arg Leu Ile Pro Tyr Pro 145 150 155 160 Leu Val Leu Trp Asp Val Asp Thr Leu Asp Trp Glu His His Asp Pro 165 170 175 Gln Lys Thr Val Arg Ile Ala Leu Glu Glu Ala Lys Pro Gly Ser Ile 。

35、180 185 190 Ile Leu Met His Asp Ile His Tyr Trp Ser Val Lys Ala Val Pro Gln 195 200 205 Leu Val Ser Lys Leu His Asp Ala Gly Tyr Thr Leu Val Thr Val Asp 210 215 220 序列表 1/2 页 8 CN 111979218 A 8 Gln Leu Phe Ala Gly Thr Asp Phe Lys Pro Ala Lys Ala Tyr Asp His 225 230 235 240 Arg Phe Lys Thr Asn Pro 245 序列表 2/2 页 9 CN 111979218 A 9 。