甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物及其制备方法.pdf

本发明公开了一种甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物及其制备方法。本发明以甲氨蝶呤、单甲氧基聚乙二醇、二环己基亚胺和N二甲基对氨基吡啶为原料，通过微波催化作用，制备了一种甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物。本发明的制备方法具有高效、快速、简便和反应产率高的特点。本发明的甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物为具有如下结构通式的化合物。

1.  甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物，其特征在于，为具有如下结构通式的化合物：

或

其中：PEG代表分子量为2000～20000的聚乙二醇，其结构片段如下：
n为45～450。

2.  根据权利要求1所述的甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物，其特征在于，聚乙二醇的分子量为2000或5000。

3.  制备权利要求1所述的甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物的方法，其特征在于包括如下步骤：
将单甲氧基聚乙二醇与甲氨蝶呤在催化剂存在下，于微波催化下反应10～60分钟，然后采用常规的方法从反应产物中收集黄色固体。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所说的聚乙二醇的分子量为2000～20000。

5.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所说的催化剂为二环己基碳二亚胺和对-N，N-二甲基氨基吡啶。

6.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应原料的摩尔比为：
甲氨蝶呤∶单甲氧基聚乙二醇∶二环己基碳二亚胺∶对-N，N-二甲基氨基吡啶＝1.0∶1.3～1.7∶1.5～2.5∶1.5～2.5。

7.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应温度为0～100℃。

8.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，微波功率为400～1000W，微波的频率为915～2450MHz。

9.  根据权利要求3～8任一项所述的方法，其特征在于，从反应产物中收集甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物的方法包括如下步骤：
将反应后的混合物干燥、冷却后，加入无水二氯甲烷，过滤，滤液浓缩后加入无水乙醚进行沉淀，抽滤，洗涤，干燥，得黄色固体；
然后加二氯甲烷溶解，先后用10％HOAc/THF和0.1N盐酸溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤得黄色固体，真空干燥，得最终产品聚乙二醇-甲氨蝶呤衍生物。

甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种水溶性的甲氨蝶呤衍生物及其制备方法，特别涉及一种聚乙二醇修饰的甲氨蝶呤衍生物。
背景技术
甲氨蝶呤是是临床上最常用的抗肿瘤药之一，适用于急性白血病、乳腺癌、绒毛膜上皮癌及恶性葡萄胎、头颈部肿瘤、骨肿瘤、白血病脑膜脊髓浸润、肺癌、生殖系统肿瘤、肝癌、顽固性普通牛皮癣、自体免疫病。甲氨蝶呤作为一种叶酸还原酶抑制剂，主要抑制二氢叶酸还原酶而使二氢叶酸不能被还原成具有生理活性的四氢叶酸，从而阻止嘌呤环和胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成，抑DNA、RNA生成。本品主要作用于细胞周期的S期，属细胞周期特异性药物，对G1/S期的细胞也有延缓作用，对G1期细胞的作用较弱。
甲氨蝶呤的主要毒副作用有胃肠道反应、肝功能损害、肾功能损害、骨髓抑制、脱发、肺纤维化等，且治疗剂量与中毒剂量相近。
为了提高甲氨蝶呤的药效并减小其毒副作用，将甲氨蝶呤与载体分子偶联使之变成甲氨蝶呤衍生物是目前最有效的办法。修饰甲氨蝶呤所用的载体分子一般为高分子化合物，如：吡喃复聚物、乙烯醚与马来酸酐的共聚物、凝胶、抗体、血清蛋白等，但大多需要先在甲氨蝶呤或高分子上接上一条手臂，操作繁琐，分离纯化困难，收率较低。曾有报道使用含-OH，-SH或-NH₂的聚乙二醇作修饰剂用于甲氨蝶呤的修饰，如美国专利US6709679公开的方法，但仍需先将甲氨蝶呤连上顺丁烯二酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺手臂进行活化。在以上的修饰方法中，由于修饰后的分子在进入生物体内后有两个或多个可断裂的酯键或酰胺键，水解后会释放出不具备药理活性甚至有毒副作用的小分子化合物，从而影响到修饰效果。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物为具有如下结构通式的化合物：

或

其中：PEG代表分子量为2 000～20 000的聚乙二醇，其结构片段如下：

n为45～450。
优选分子量为2000或5000的聚乙二醇。
本发明的甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物的制备方法包括如下步骤：
将聚乙二醇与甲氨蝶呤在催化剂存在下，于微波催化下反应10～60分钟，然后采用常规的方法从反应产物中收集黄色固体，即本发明的甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物，产率为86％以上。
所说的聚乙二醇的分子量为2 000～20 000；
所说的催化剂为二环己基碳二亚胺和对-N，N-二甲基氨基吡啶；
反应原料的摩尔比为：
甲氨蝶呤∶单甲氧基聚乙二醇∶二环己基碳∶对-N，N-二甲基氨基吡啶＝1.0∶1.3～1.7∶1.5～2.5∶1.5～2.5
反应温度为0～100℃；
微波功率为400～1000W；
微波的频率为915～2450MHz；
按照本发明优选的技术方案，从反应产物中收集甲氨蝶呤的聚乙二醇衍生物的方法包括如下步骤：
将反应后的混合物干燥、冷却后，加入无水二氯甲烷，过滤，滤液浓缩后加入无水乙醚进行沉淀，抽滤，洗涤，干燥，得黄色固体；
然后加二氯甲烷溶解，先后用10％HOAc/THF和0.1N盐酸溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤得黄色固体，真空干燥，得最终产品聚乙二醇-甲氨蝶呤衍生物。
本发明以聚乙二醇为修饰剂，主要理由有两点，一是因为聚乙二醇是无毒的、与生物相适的、蛋白质排斥的、无感染的和非抗原性的药物良好载体；二是它有着良好的水溶性及与其它有机物的良好可溶性，有利于进行化学反应修饰或改性。作为药物修饰剂的聚乙二醇，对其分子量都有一定的要求，分子量一般在2 000～20 000之间，如果选用的聚乙二醇分子量过大，则它的水溶性粘度较大，不利于输液和使用；如果分子量太小，则又加大了毒性，不能使用。而且，作为化学合成的聚合物，PEG的分子量分布指数直接影响后药物的相对分子量分布，从而影响最终产品的均一性。为保证PEG修饰最终产品的同源性，要求PEG修饰剂中存在的PEG二醇(diol)保持在较低的水平，否则将影响目的修饰药物的纯度，而且副产物不易分离，给纯化工作带来困难。本发明以单甲氧基聚乙二醇(mPEG)2000～20 000作修饰剂，使甲氨蝶呤与mPEG之间以酯键的方式相连，使之变成可溶性的甲氨蝶呤衍生物。
本发明利用微波催化作用，实现了甲氨蝶呤的羧基与聚乙二醇羟基之间的酯化反应。常规的酯化反应不仅需使用有毒的有机溶剂、操作繁杂，而且反应时间长，效率低，特别是对于溶解性较差的甲氨蝶呤，它与聚乙二醇的酯化反应使用常规方法难度很大。微波催化是一种新型的有机合成手段，其催化机制在于微波的能级恰好与极性分子的转动能级相匹配，这就使得微波能可以被极性分子迅速吸收，从而与平动能发生自由交换，使反应活化能降低，进而使反应活性大为提高。一些传统的药物合成方法有的反应复杂、难度大、费时费力，有的反应进行得很慢甚至难以发生，选用微波催化方法则可大大优化反应条件，加快反应速度，提高反应选择性和反应收率，使过去难以发生或速度很慢的反应得以高速完成，同时还能大大简化后处理过程。目前，微波催化在水解、酯化、氧化、亲核取代、加成、缩合等许多有机合成反应中已有大量的应用。采用微波催化技术，通过控制反应条件，可使许多有机反应地速度提高约200倍以上，一些反应甚至可比传统方法快1000倍以上。如酯化反应，在微波炉内进行比传统的回流方法，速率一般可提高1.3～180倍。但是文献中有关高分子化合物(如：聚乙二醇)的酯化反应尚没有报道。本发明采用了微波催化方法，高效、快速、简便地实现了聚乙二醇对甲氨蝶呤的酯化反应，制得了可溶性的甲氨蝶呤的前药。
本发明的聚乙二醇修饰的甲氨蝶呤，具有良好的水溶性，并可通过人体内酶的调控作用，达到良好的缓释目的，药效期长，疗效高。
具体实施方式
                         实施例1
在25毫升三角瓶中，加入2.50g(0.5mmol)mPEG 5000、0.34g(0.75mmol)甲氨蝶呤、0.21g(1.0mmol)二环己基碳二亚胺和0.12g(1.0mmol)对-N，N-二甲基氨基吡啶，充分摇动使反应物混合均匀，然后置于惠而浦微波炉中，频率为2450MHz，在510W的功率下加热60min，使酯化反应完全。将反应后的混合物置于真空干燥箱中干燥、冷却后，加入40ml无水二氯甲烷，充分摇动，过滤，滤液蒸去部分二氯甲烷后，加入80ml无水乙醚，析出黄色沉淀。将上述样品置于4～10℃的冰箱中冷却，抽滤，干燥，得黄色固体，重2.78g。
在上述粗品中，加入40ml二氯甲烷溶解后，加入20ml 10％AcOH/THF分解过量的二环己基碳二亚胺，10min后用20ml 0.1N盐酸溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤得黄色固体，真空干燥，得最终产品聚乙二醇-甲氨蝶呤衍生物2.34g，熔点60～61℃，产率86％。其有关的结构数据如下：IR(KBr压片)ν2887，1735，1468，1343，1280，1112cm-1；UV(EtOH)λ262(最大吸收)，303nm。
                          实施例2
在25毫升三角瓶中，加入1.00g(0.5mmol)mPEG 2000、0.34g(0.75mmol)甲氨蝶呤、0.21g(1.0mmol)二环己基碳二亚胺和0.12g(1.0mmol)对-N，N-二甲基氨基吡啶，充分摇动使反应物混合均匀，然后置于惠而浦微波炉中，频率为2450MHz，在510W的功率下加热30min，使酯化反应完全。将反应后的混合物置于真空干燥箱中干燥、冷却后，加入40ml无水二氯甲烷，充分摇动，过滤，滤液蒸去部分二氯甲烷后，加入80ml无水乙醚，析出黄色沉淀。将上述样品置于4～10℃的冰箱中冷却，抽滤，干燥，得黄色固体，重1.31g。
在上述粗品中，加入40ml二氯甲烷使之溶解，再加入20ml 10％AcOH/THF分解过量的二环己基碳二亚胺，10min后用20ml 0.1N盐酸溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，除去干燥剂，滤液浓缩后用异丙醇重结晶，过滤得黄色固体，真空干燥，得最终产品聚乙二醇-甲氨蝶呤衍生物1.01g，熔点52～53℃，产率82％。IR(KBr压片)ν2886，1734，1468，1341，1280，1113cm-1；UV(EtOH)λ262(最大吸收)，302nm。