《用于治疗病毒性疾病的方法和组合物.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用于治疗病毒性疾病的方法和组合物.pdf（82页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104066432A43申请公布日20140924CN104066432A21申请号201280066275422申请日2012120661/567,49120111206USA61K31/51720060171申请人小利兰斯坦福大学董事会地址美国加利福尼亚州72发明人希里特埃伊纳夫里娜巴鲁什本托夫格里戈里内沃阿莫茨齐瓦夫74专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人彭鲲鹏郑斌54发明名称用于治疗病毒性疾病的方法和组合物57摘要本发明提供了用于通过使用阻止独特的病毒结构蛋白基序与来自网格蛋白衔接蛋白家族的宿主蛋白质结合并随后阻止病毒复制的抑制剂来治疗病毒感染和同。
2、时感染的方法。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014070786PCT国际申请的申请数据PCT/US2012/0681672012120687PCT国际申请的公布数据WO2013/086133EN2013061351INTCL权利要求书1页说明书39页序列表3页附图38页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书39页序列表3页附图38页10申请公布号CN104066432ACN104066432A1/1页21治疗HCVHIV同时感染的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的抑制所述HCV和HIV病毒与宿主网格蛋白衔接蛋白AP复合物亚基结合的药剂。2权。
3、利要求1所述的方法，其中所述亚基选自网格蛋白AP1、AP2、AP3和AP4复合物亚基。3权利要求2所述的方法，其中所述亚基选自AP2M1、AP1M1、AP3M1和AP4M1。4权利要求1所述的方法，其中所述药剂抑制AAK1或GAK。5权利要求1所述的方法，其中所述药剂选自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC412。6抑制慢病毒亚科病毒、HIV、HCV/HIV同时感染、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的感染的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用有效量的抑制来自所述病毒的包含YXX或二亮氨酸基序的结构蛋白与宿主网格蛋白衔接蛋白AP复合。
4、物亚基结合的药剂。7权利要求6所述的方法，其中所述亚基选自网格蛋白AP1、AP2、AP3和AP4复合物亚基。8权利要求7所述的方法，其中所述亚基选自AP2M1、AP1M1、AP3M1和AP4M1。9权利要求6所述的方法，其中所述药剂抑制AAK1或GAK。10权利要求6所述的方法，其中所述药剂选自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC412。11筛选抗病毒剂的方法，其包括使网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒或其蛋白质与候选药剂和宿主网格蛋白衔接蛋白AP复合物亚基接触，并且。
5、确定所述候选药剂对所述网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒与所述蛋白质结合的影响。12筛选抗病毒剂的方法，其包括使网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV病毒以外的网格蛋白AP结合病毒与候选药剂和表达宿主网格蛋白衔接蛋白AP复合物亚基的细胞接触，并且确定所述候选药剂对病毒装配或出芽的影响。13权利要求11所述的方法，其中所述候选药剂抑制AAK1或GAK的活。
6、性。14抑制宿主细胞中黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的病毒或除HCV以外的病毒的装配或出芽的方法，其包括使所述宿主细胞与阻止包含YXX或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与宿主网格蛋白衔接蛋白AP复合物亚基结合的药剂接触，从而抑制所述装配或出芽。15权利要求14所述的方法，其中所述药剂阻断所述结构蛋白与所述宿主蛋白质的结合。16权利要求14所述的方法，其中所述药剂与所述结构蛋白竞争与所述宿主蛋白质结合。17权利要求14所述的方法，其中所述药剂与所述宿主蛋白质竞争与所述结构蛋白结合。权利要求书CN104066432A1/39页3用于治疗病毒性疾病的方法和组合物0001相关申请的交叉引用0002本申请要。
7、求于2011年12月6日提交的美国临时申请序列号61/567,491的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。0003关于联邦资助研究的声明0004本发明得到国立卫生研究院NATIONALINSTITUTESOFHEALTH授予的合同AI079406的政府支持。政府对本发明享有某些权利。技术领域0005本发明涉及病毒学。更具体地，本发明涉及通过抑制宿主细胞网格蛋白衔接蛋白CLATHRINADAPTORPROTEIN与病毒YXX或二亮氨酸基序DILEUCINEMOTIF之间的相互作用或者其调节来治疗病毒性疾病。背景技术0006人感染慢病毒亚科LENTIVIRIDAE病毒如HIV和黄病毒科FLAV。
8、IVIRIDAE病毒如HCV对全球健康的造成了巨大挑战。尽管强效抗HIV药物处于临床开发中并且对于基于干扰素之方案的响应率因包含蛋白酶抑制剂PI而改善，但是抗性、药物药物相互作用和累积的毒性延续了造成的挑战。因此，依然需要更有效的抗病毒策略以对抗HCV大流行。此外，为了治疗因抗性病毒而无法进行高活性抗逆转录病毒治疗HIGHLYACTIVEANTIRETROVIRALTHERAPY，HAART的患者，需要在补救方案中包含新的抗病毒策略。0007发明概述0008简单地说，本公开内容的实施方案包括治疗具有病毒感染的宿主的化合物、组合物、药物组合物和方法。在一个实施方案中，根据本公开内容易感染的病毒包。
9、括包含至少一种包含YXX基序或二亮氨酸基序的蛋白质的病毒，其在本文中被称为“网格蛋白AP结合病毒”，黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染COINFECTION如HCV/HIV同时感染、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒，治疗宿主中此类病毒的复制的方法，抑制包含YXX或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与宿主网格蛋白AP1AP4复合物亚基如AP2M1、AP1M1、AP3M1或AP4M1结合的方法，治疗宿主中与病毒性肝炎有关的肝纤维化的方法等。0009治疗具有来自网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HC。
10、V、HIV、同时感染如HCV/HIV同时感染、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒等的病毒感染的宿主的一个示例性方法可包括向所述宿主施用治疗有效量的抑制剂以降低所述宿主中的病毒载量。在一个实施方案中，所述抑制剂选自竞争性抑制包含YXX或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与选自网格蛋白AP1至AP4的亚基的宿主蛋白质之间结合的药剂；以及抑制宿主蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自网格蛋白AP1至AP4的亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。治疗宿主中的网格蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同说明书CN10406。
11、6432A2/39页4时感染如HCV/HIV同时感染、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒等的病毒感染的一个示例性方法可包括向具有此类病毒感染的宿主施用抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自竞争性抑制包含YXX或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1的宿主蛋白质之间结合的药剂，以及抑制宿主蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。在一些实施方案中，这些抑制剂抑制GAK环G相关激酶或AAK1衔接子相关激酶1，包括例如厄洛替尼ERLOTINIB、舒尼替尼SUN。
12、ITINIB或PKC412的化合物。因此，有两类抑制剂1结合的竞争性抑制剂；和2抑制宿主蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节宿主蛋白质如AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的活性的激酶。0010抑制YXX或二亮氨酸基序与宿主多肽等结合的一个示例性方法包括向具有病毒感染的宿主施用抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自竞争性抑制包含YXX或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1或网格蛋白AP复合物的其他亚基之间结合的药剂；以及抑制蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。0011用于治疗网格蛋白AP结合病毒、黄病。
13、毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染如HCV/HIV同时感染、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒等的病毒感染的宿主的一种示例性药物组合物可包含抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自竞争性抑制包含YXX或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质之间结合的药剂，以及抑制蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。0012一种示例性组合物包含抑制剂等。在一个实施方案中，所述抑制剂选自竞争性抑制包含YX。
14、X或二亮氨酸基序的病毒蛋白质与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质之间结合的药剂，以及抑制蛋白激酶活性的药剂，所述蛋白激酶为调节选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质的活性的激酶。0013在一个方面，本发明提供了通过施用有效量的抑制HCV和HIV与选自AP2M1和网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白结合的药剂来治疗HCVHIV同时感染的方法。在一个实施方案中，所述抑制剂抑制AAK1或GAK。在另一个实施方案中，所述药剂选自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC412。在另一个实施方案中，所述药剂阻止包含YXX或二亮氨酸基序的慢病毒亚科病毒或黄病毒科病毒结构蛋。
15、白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质结合。在又一个实施方案中，所述药剂抑制AAK。0014在另一个方面，本发明提供了通过向需要的患者施用有效量的抑制包含YXX或二亮氨酸基序的病毒的结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质结合的药剂来抑制除HCV以外的至少第一病毒、黄病毒科的另一种成员或慢病毒亚科的成员或其组合的感染的方法。在一个实施方案中，所述药剂抑制AAK1或GAK。在另一个实施方案中，所述药剂选自厄洛替尼、舒尼替尼和PKC412。0015在另一个方面，本发明提供了通过使本文所述易感性病毒或病毒蛋白质与候选药剂和选自AP2M1和/或网。
16、格蛋白AP复合物的其他亚基的蛋白质接触并确定所述候选药说明书CN104066432A3/39页5剂对病毒与宿主蛋白质结合的影响来筛选抗病毒药剂的方法。0016在另一个方面，本发明提供了通过使本文所述易感性病毒与候选药剂和表达选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的蛋白质的细胞接触并确定所述候选药剂对病毒装配或出芽的影响来筛选抗病毒药剂的方法。在一个实施方案中，所述候选药剂抑制AAK1或GAK的活性。0017在另一个方面，本发明提供了通过使宿主细胞与阻止包含YXX或二亮氨酸基序的病毒结构蛋白与选自AP2M1和/或网格蛋白AP复合物的其他亚基的宿主蛋白质结合的药剂接触来抑制宿主细胞中网格。
17、蛋白AP结合病毒、黄病毒科病毒、慢病毒亚科病毒、HCV、HIV、同时感染如HCV/HIV同时感染、除HCV以外的黄病毒科病毒、除黄病毒科病毒以外的网格蛋白AP结合病毒或除HCV以外的网格蛋白AP结合病毒的装配或出芽的方法。在一个实施方案中，所述药剂阻断病毒结构蛋白与宿主蛋白质结合。在另一个实施方案中，所述药剂与病毒结构蛋白竞争与宿主蛋白质结合。在另一个实施方案中，所述药剂与宿主蛋白质竞争与病毒结构蛋白结合。在又一个实施方案中，所述方法包括筛选非黄病毒科病毒的AAK1和GAK抑制剂。0018附图简述0019以下附图形成本发明说明书的一部分，其被包含以进一步证明本发明的某些方面。参照一个或更多个这。
18、些附图并结合对本文给出的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明0020图1示出了具有结合AP2M1的YXX基序的病毒核心。A核心的示意图。指示了被识别的基序的位置。BC来自典型人B和病毒C蛋白质的YXX基序的共有序列。D所有HCV隔离种、在本研究中使用的克隆和设计的核心突变体的共有序列。E来自微流体芯片的荧光图像和示意图。左AP2M1V5HIS通过其与抗HIS抗体的相互作用固定在装置表面并用抗V5FITC抗体标记。中将T7标记的核心或NS3与表面结合AP2M1一起孵育并用抗T7CY3抗体标记。通过MITOMI机械地捕获相互作用。在清洗后显示出表示结合病毒蛋白质的CY3信号。右CY3和FIT。
19、C信号重叠，表示结合病毒猎物PREY与人诱饵BAIT的比例。F核心T7和NS3T7与表面结合AP2M1的体外结合曲线。Y轴表示结合病毒蛋白质与表面结合AP2M1的比值。0021图2示出了在细胞中并且在HCV感染的背景下的病毒核心结合AP2M1。APCA形式的示意图。A和B表示猎物蛋白质和诱饵蛋白质，GLUC1/2是GAUSSIA萤光素酶的片段。B利用图下方指示的质粒的组合共转染细胞，图例中具有这些指示。Y轴表示相对于核心AP2M1信号的发光。右侧带状条表示与宿主货物蛋白CARGOPROTEINTFR结合的AP2M1。C在游离AP2M1、核心或NESI的存在下的核心AP2M1结合。Y轴表示相对于。
20、在空白PUC19存在下核心AP2M1结合的发光比值在利用GLUC1AP2M1和GLUC2核心感染的细胞中检测的平均发光信号除以在利用GLUC1AP2M1和空白GLUC2载体感染的对照孔中以及利用GLUC2核心和空白GLUC1载体转染的那些中测量的平均发光。DHCV感染细胞的膜中的免疫沉淀IP。左图使用抗AP2M1抗体或IGG用于IP。利用抗磷酸AP2M1、抗AP2M1、抗核心和抗肌动蛋白抗体对膜进行免疫印迹。CALA表示花萼海绵诱癌素ACALYCULINA。右图使用抗核心抗体或IGG用于IP。利用抗核心、抗AP2M1和抗肌动蛋白抗体进行免疫印迹。E利用J6/JFHHCVRNA电穿孔后3天HUH。
21、75细胞中AP2M1和核心的代表性共聚说明书CN104066432A4/39页6焦IF显微图像。数据表示来自三个独立的一式三份实验的平均值SD误差条E中N20。P005，P001，P0001。0022图3示出了介导AP2M1结合和病毒装配的核心YXX基序，在功能上可与其他YXX信号互换。A通过PCA的野生型WT和核心突变体与AP2M1结合。Y轴表示相对于WT核心AP2M1结合的发光比值在利用GLUC1AP2M1和多种形式的GLUC2核心转染的细胞中检测的平均发光信号除以在利用GLUC1AP2M1和空白GLUC2载体转染的对照细胞以及利用各自GLUC2核心和空白GLUC1载体转染的那些中测量的平。
22、均发光。B在利用具有相应突变的J6/JFHP7RLUC2A电穿孔后第6小时白色和72小时黑色通过海肾萤光素酶测定的HCVRNA复制。E1E2是装配缺陷对照。GNN是复制缺陷聚合酶突变体。C在利用来自于电穿孔细胞的上清液感染的未经处理的NAIVEHUH75细胞中通过萤光素酶测定的细胞外感染性。D在利用来自于电穿孔细胞的澄清细胞裂解物感染的未经处理的HUH75细胞中通过萤光素酶测定的细胞内感染性。E通过有限稀释测定测量的细胞内和细胞外感染性滴度。TCID50是50组织培养物感染剂量。F在电穿孔后第72小时通过QRTPCR测量的释放到培养物上清液中的病毒RNA。G相对于WT对照，在电穿孔后第72小时。
23、通过ELISA确定的释放到培养物上清液中的HCV核心蛋白。H在具有相应突变的病毒感染的细胞制备的裂解物中通过WESTERN分析的核心蛋白的水平。示出了来自三个独立的一式三份实验的结果的平均值和SD误差条。水平虚线表示萤光素酶活性的背景水平。RLU是相对光单位。P005，P001，P0001。0023图4示出了AP2M1消耗对HCV装配的抑制。A在具有靶向AP2M1基因和非靶向NT序列的SHRNA慢病毒构建体的稳定克隆中通过定量WESTERN分析的AP2M1蛋白水平。示出了代表性的膜和来自三个独立测量值的组合数据。Y轴表示相对于NT对照的AP2M1与肌动蛋白的比值。B相对于NT对照，在所选稳定克。
24、隆中通过QRTPCR的AP2M1/S18RNA比值。C利用J6/JFHP7RLUC2A对所指示的克隆电穿孔。在电穿孔后第9小时白色和第72小时黑色通过萤光素酶测定的这些克隆中HCVRNA的复制。D在利用来自于多个稳定细胞克隆的上清液接种的未经处理的细胞中通过萤光素酶测定测量的细胞外感染性。E在利用来自于电穿孔细胞的澄清细胞裂解物感染的未经处理的HUH75细胞中通过萤光素酶测定的细胞内感染性。F通过有限稀释测定测量的细胞内和细胞外感染性。TCID50是50组织培养感染剂量。G在电穿孔后第72小时通过QRTPCR测量的释放到培养物上清液中的病毒RNA。H在电穿孔后第72小时通过ELISA确定的释放。
25、到培养物上清液中的HCV核心。I在同时利用表达SHAP2M1和抗性WTAP2M1CDNAAP2M1WT的SHRNA的慢性病毒转导的细胞中相对于NT对照的感染性病毒产生上图和通过WESTERN印迹分析的AP2M1蛋白的水平下图。示出了来自至少三个独立实验的结果的平均值和SD误差条。RLU是相对光单位。P005，P001，P0001。0024图5表明破坏核心AP2M1结合消除了向LD招募AP2M1并改变了核心的亚细胞定位及其与E2的共定位。HUH75细胞中核心和AP2M1的亚细胞定位和核心E2共定位的定量共聚焦免疫荧光IF分析。A未经处理的HUH75细胞中内源AP2M1蓝色和LD标记BODIPY绿。
26、色的代表性融合图像。BD对核心红色、LD标记BODIPY绿色和AP2M1蓝色染色的利用J6/JFHHCV感染的HUH75细胞的融合图像。E通过AD的定量共定位分析的未经处理的白色或被感染黑色细胞中所示信号的共说明书CN104066432A5/39页7定位百分比。F四通道融合图像。插图中的黄色箭头指示核心和AP2M1向LD的共定位。GJ表示利用仅表达AP2M1MCHERRYG或AP2M1MCHERRY和WT核心H或核心Y136A突变体I的质粒转染的HUH75细胞中AP2M1红色和脂质标记LIPIDTOX蓝色的代表性融合图像和定量共定位分析。图H和I中示出的细胞中核心表达绿色在各自下方的图中展示。。
27、KP核心红色和KBODIPY绿色的代表性融合图像和定量共定位分析，表明与WT核心左图相比，在利用具有Y136A核心突变体右图的J6/JFHHCVRNA电穿孔的HUH75细胞中核心向LD的定位提高。L对照NT细胞左图或者利用J6/JFHHCVRNA电穿孔的AP2M1消耗右图的HUH75中的BODIPY绿色，表明在AP2M1消耗的细胞中核心大量定位在LD。MTGN46绿色，表明与WT核心左图相比，在利用具有Y136A核心突变右图的J6/JFHRNA电穿孔的HUH75细胞中核心向TGN的定位降低。N对照NT细胞左图或者利用J6/JFHHCVRNA电穿孔的AP2M1消耗右图的HUH75中的TGN46绿。
28、色，表明在AP2M1消耗的细胞中核心在TGN的定位降低。OE2绿色，表明与WT核心左图相比，在利用具有Y136A核心突变右图的J6/JFHRNA电穿孔的HUH75细胞中核心和E2的共定位降低。P对照NT细胞左图或者利用J6/JFHHCVRNA电穿孔的AP2M1消耗右图的HUH75中的E2绿色，表明在AP2M1消耗的细胞中核心和E2的共定位降低。示出了60放大的代表性图。图表示使用MANDERS系数的Z叠置的定量共定位分析。值指示表示为共定位百分比与红色强度重合的绿色强度的分数，或者在图GI的情况下，与红色强度重合的蓝色强度的分数平均M2值SD误差条；N10至15。P005，P001，P0001。
29、。0025图6表明AAK1和GAK调节核心AP2M1结合并参与HCV装配。AAP2M1与具有YXX信号的宿主货物蛋白结合的调节机制。B通过PCA黑色和微流体白色，核心与野生型和T156AAP2M1突变体的结合。CE利用编码WT和T156AAP2M1突变体的质粒转染HUH75并在转染后第48小时利用J6/JFHP7RLUC2A电穿孔。C相对于WTAP2M1对照，在转染后第48小时通过基于阿尔玛蓝ALAMARBLUE测定的细胞存活力。D在利用J6/JFHP7RLUC2A电穿孔后第6小时黑色和第72小时白色通过萤光素酶测定的过表达WT或T156AAP2M1突变体的细胞中HCVRNA的复制。E相对于W。
30、T对照，分别为在利用来自于所示细胞的上清液或细胞裂解物感染的未经处理的HUH75细胞中通过萤光素酶测定的细胞外黑色和细胞内白色感染性。FG利用相应SIRNA转染HUH75细胞。F相对于NT序列，通过QRTPCR的这些细胞中AAK1左或GAK右与S18RNA的比值。G定量WESTERN分析。数值表示相对于NT对照AAK1上或GAK下与肌动蛋白的比值。H在通过SIRNA消耗AAK1或GAK的HUH75细胞中通过PCA的核心AP2M1结合。Y轴表示相对于NT对照的发光比值在利用GLUC1AP2M1和GLUC2核心转染的细胞中检测的平均发光信号除以利用G1UC1AP2M1和空白GLUC2载体转染的NT。
31、细胞以及利用GLUC2核心和空白GLUC1载体转染的那些中测量的平均发光。IK利用J6/JFHP7RLUC2A对AAK1或GAK消耗的细胞电穿孔。I相对于NT对照，消耗的细胞中通过基于阿尔玛蓝测定的细胞存活力。J在电穿孔后第6小时黑色和第72小时白色通过萤光素酶测定的这些细胞中的HCVRNA复制。K相对于NT对照，分别为在利用来自于所示细胞的上清液或细胞裂解物感染的未经处理的HUH75细胞中通过萤光说明书CN104066432A6/39页8素酶测定的细胞外黑色和细胞内白色感染性。L通过PCA的核心与AAK1和GAK结合。Y轴表示相对于核心AP2M1结合的发光比值。数据表示来自至少两个一式三份实。
32、验的平均值和SD误差条。RLU是相对光单位。P005，P001，P0001。0026图7核心AP2M1结合和HCV装配的药理学抑制。AAP2M1调节剂和所发现的抑制剂。B抑制剂与AAK1或GAK结合的KDKARAMAN等，NATBIOTECHNOL26127132，2008。这些化合物影响核心AP2M1结合的IC50，以及其影响细胞外感染性、细胞内感染性和利用细胞培养物生长HCVHCVCC的病毒感染的EC50。C通过PCA测量的化合物对核心AP2M1结合的抑制。DG利用厄洛替尼、舒尼替尼或PKC412每日处理用J6/JFHP7RLUC2A电穿孔的HUH75细胞，处理3天。在第72小时收集上清液。
33、和细胞裂解物并用于接种未经处理的HUH75细胞。相对于未处理的对照，抑制剂对于细胞外D和细胞内E感染性的影响的剂量响应曲线。分别通过萤光素酶测定和基于阿尔玛蓝的测定，这些化合物不影响HCVRNA复制F或细胞存活力GGNN是复制缺陷的聚合酶突变体。H在利用J6/JFHP7RLUC2A电穿孔并在花萼海绵诱癌素ACALA的存在下利用化合物处理后，通过收集的细胞裂解物的WESTERN分析的抑制剂对于AP2M1磷酸化的影响。示出了利用抗磷酸AP2M1PAP2M1和抗肌动蛋白抗体印迹的典型膜以及来自3个实验的定量分析。Y轴表示相对于未处理的对照的PAP2M1/肌动蛋白比值。I在每天处理的72小时之后，相对。
34、于未处理的对照，HCVCC感染的细胞中抑制剂对病毒感染性黑色和细胞存活力灰色的影响。数据表示来自至少3个一式三份的实验的平均值和SD误差条。RLU是相对光单位。P005，P001，P0001。0027图8通过汇集的SIRNA暂时消耗AP2M1抑制HCV装配。A相对于NT对照，转染后48小时在利用靶向AP2M1的四种SIRNA的汇集物ONTARGETPLUSSMARTPOOL，DHARMACON或者非靶向NT序列的汇集物转染的HUH75细胞中通过QRTPCR测量的AP2M1/S18RNA比值。B利用相应汇集的SIRNA转染后48小时细胞中通过定量WESTERN分析的AP2M1蛋白水平。数值表示相。
35、对于NT对照AP2M1与肌动蛋白的比值。C相对于NT对照，在SIRNA转染48小时后通过阿尔玛蓝测定的细胞生存力。D在利用所示汇集的SIRNA转染48小时后利用J6/JFHP7RLUC2A对细胞进行电穿孔。在电穿孔后第6小时黑色和第72小时白色通过萤光素酶测定的这些细胞中的HCVRNA复制。E分别为通过萤光素酶测定在利用源于具有所指示SIRNA的电穿孔细胞的上清液或澄清细胞裂解物感染的未经处理的HUH75细胞中测量的细胞外黑色和细胞内白色感染性。F通过有限稀释测定测量的感染性病毒产生。G在用来自于被SIRNA暂时消耗AP2M1的HUH75细胞的上清液或澄清裂解物感染和用培养物生长J6/JFH病。
36、毒滴度12105TCID50/ML感染的未经处理的HUH75细胞中通过焦点形成测定FOCUSFORMATIONASSAY测量的细胞外黑色和细胞内白色感染性。结果相对于NT对照。示出了来自至少两个独立实验的平均值SD误差条。RLU是相对光单位。TCID50是50组织培养物感染剂量。0028图9示出AAK1和GAK的消耗或药理学上的抑制消除了TZMB1细胞中的HIV1复制表达CD4和CCR5并且还包含完整的萤光素酶和大肠杆菌半乳糖苷酶的报道基因的CXCR4阳性HELA细胞，所述二者报道基因都处于HIV长末端重复序列TAT基因的控制之下。A相对于NT对照，AAK1或GAK消耗的细胞中HIV的复制。B。
37、相对于未处理说明书CN104066432A7/39页9的对照，AAK1和GAK抑制剂对于HIV复制的抗病毒作用。0029图10示出了基于微流体的蛋白质蛋白质结合测定。在该方案中示出了三个独立单元小室微流体装置中几百个中的。0030A隔室和微机械阀。在控制通道和流动通道交叉处产生阀。在两个通道之间的交叉点的所得薄膜可通过液压驱动偏转。使用多路复用阀系统使得能够利用大量弹性体微阀在这些装置中执行复杂的流体操作。0031B实验方案。表示表面结合生物素化抗组氨酸抗体B1和B2中所示。表示表面结合FITC标记的诱饵人蛋白质B3中所示。表示CY3标记的猎物病毒蛋白质B4和B5中所示。1使微流体装置与载玻片。
38、结合并对其进行了表面图案化，导致在每个单元小室中覆盖有生物素化的抗组氨酸抗体的圆形区域见C。2使用体外转录/翻译TNT混合物从芯片表达V5HIS标记的诱饵人蛋白质并且将其装载在装置中。3这些蛋白质与表面抗HIS抗体结合。4通过相同的哺乳动物体外TNT混合物在微粒体膜的存在下从芯片表达T7标记的病毒蛋白质并与FITC标记的抗V5和CY3标记的抗T7抗体一起装载到装置中。5关闭“夹心阀”以允许孵育病毒蛋白质和人蛋白质以及利用各自荧光抗体对其进行标记。6然后通过“按钮膜”的驱动执行MITOMI，其有助于捕获表面结合复合物同时排出任何的溶液相分子。打开“夹心阀”，然后通过简单清洗以除去未捕获的未结合物。
39、质。7通过阵列扫描仪扫描所述装置。检测捕获的病毒蛋白质和表面结合人蛋白质。通过测量CY3的中值信号与FITC的中值信号来计算每一数据点结合的病毒蛋白质与表达的人蛋白质的比值用表示，图B7中所示。0032C表面图案化。1通过穿过全部流动通道的生物素化BSA溶液的流动来衍生化可接近的表面区域。2装载亲和素溶液3激活“按钮”膜。4利用生物素化溶液钝化除了被按钮掩盖的60M的圆形区域外的所有可接近的表面区域。5打开“按钮”膜。6装载生物素化抗HIS抗体的溶液其允许特异性功能化之前掩盖的圆形区域。7体外表达的人蛋白质与覆盖离散圆形区域的生物素化抗体结合。在每一个所述步骤之后均通过PBS清洗。0033图1。
40、1通过QRTPCR测定表明核心的YXX突变不影响HCVRNA复制。相对于WT对照，在利用具有相应的核心YXX突变的J6/JFHP7RLUC2A电穿孔72小时后，HUH75细胞中通过QRTPCR的HCVRNA复制。E1E2是装配缺陷对照。GNN是复制缺陷聚合酶突变体。示出了来自两个独立的一式三份实验的结果的平均值和SD误差条。0034图12通过QRTPCR测定表明AP2M1消耗对于HCVRNA复制没有影响。相对于NT对照，在利用J6/JFHP7RLUC2A进行电穿孔72小时后，具有相应SHRNA的HUH75细胞中通过QRTPCR的HCVRNA复制。示出了来自两个独立的一式三份实验的结果的平均值和。
41、SD误差条。0035图13表明通过汇集的SIRNA暂时消耗AP2M1抑制HCV装配。A相对于NT对照，在利用靶向AP2M1的四种SIRNA的汇集物ONTARGETPLUSSMARTPOOL或者非靶向NT序列的汇集物转染的HUH75细胞中于转染后48小时通过QRTPCR测量的AP2M1/S18RNA比值。B利用相应的汇集的SIRNA转染后48小时在细胞中通过定量WESTERN分析的AP2M1蛋白水平。数值代表相对于NT对照AP2M1比肌动蛋白的蛋白质比值。C相对于NT对照，说明书CN104066432A8/39页10在SIRNA转染48小时后通过阿尔玛蓝分析的细胞存活力。D利用所示汇集的SIRN。
42、A转染48小时后利用J6/JFHP7RLUC2A对细胞进行电穿孔。电穿孔后第6小时黑色和72小时白色通过萤光素酶测定的这些细胞中HCVRNA的复制。E分别为通过萤光素酶测定在未经处理的HUH75细胞中测量细胞外黑色和细胞内白色感染性，所述细胞被用来自于具有所示SIRNA的电穿孔细胞的上清液或澄清细胞裂解物感染。F通过有限稀释测定测量的感染性病毒产生。G通过焦点形成测定在用来自于被SIRNA暂时消耗AP2M1的HUH75细胞的上清液或澄清细胞裂解液感染和用培养物生长的J6/JFH病毒滴度12105TCID50/ML感染的未经处理的HUH75细胞中测量的细胞外黑色和细胞内白色感染性。结果相对于NT。
43、对照。示出了来自至少两个独立实验的平均值SD误差条。RLU是相对光单位。TCID50是50组织培养感染剂量。0036图14示出Y136A核心突变似乎不影响核心在HCV感染的细胞中ER膜上的定位。A利用培养物生长HCV感染的HUH75细胞中核心在ER膜上的定位的定量共聚焦免疫荧光IF分析。A和B表示核心红色和ER标记物钙网蛋白绿色的融合图像，表明了在利用WT病毒A或具有Y136A核心突变的病毒B感染的HUH75细胞中核心在ER膜上的可比较的部分定位。示出了60放大的典型图。C使用MANDERS系数的Z叠置ZSTACK的共定位分析更高的值代表更多共定位。值指示表示为共定位百分比与红色强度相符的绿色。
44、强度的分数的平均M2值SD误差条；N10至15。0037发明详述0038在极为详细地描述本公开内容之前，应理解的是，本公开内容不限于所描述的具体实施方案，当然，本发明的实施方案本身可以改变。还应理解的是，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本公开内容的范围仅由所附权利要求限制。0039如本领域技术人员在阅读本公开内容的基础上将理解的，本文描述和举例说明的每一个独立的实施方案具有离散的部分和特征，这些部分和特征可容易地分开或与任意其他数个实施方案的特征组合，而不脱离本公开内容的范围和精神。可以以所描述事件的次序或逻辑上合理的任何其他次序来实施任何所描述方法。0040在。
45、详细描述本公开内容的实施方案之前，应理解的是，除非另外说明，否则本公开内容不限于特定的材料、试剂、反应材料、制造过程等，因为其可以改变。还要理解，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，而不是旨在限制。在本公开内容中还可能的是，可以以逻辑上可能的不同顺序来执行步骤。如在本说明书和所述权利要求中使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则无数量词修饰形式的名词包括复数的指示物。因此，例如，提及“化合物”包括多种化合物。在本说明书和所附权利要求书中将提及若干术语，其应定义为具有以下含义，除非明显是相反含义。0041定义0042在所公开的主题的描述和权利要求中，将根据下文给出的定义来使用以下术语。00。
46、43“黄病毒科病毒”是指黄病毒科的任意病毒，包括感染人和非人动物的那些病毒。编码这些病毒的多核苷酸和多肽序列是本领域中公知的，并且可在NCBI的GENBANK数据库中找到，例如GENBANK登记号NC_004102、AB031663、D11355、D11168、AJ238800、NC_001809、NC_001437、NC_004355、NC_004119、NC_003996、NC_003690、NC_003687、NC_003675、说明书CN104066432A109/39页11NC_003676、NC_003218、NC_001563、NC_000943、NC_003679、NC0036。
47、78、NC_003677、NC_002657、NC_002032和NC_001461，其数据库条目的内容通过引用整体并入本文。0044本文使用的术语“治疗TREATMENT、TREATING和TREAT”定义为利用药剂对疾病、紊乱或病症所进行的旨在减轻或缓减所述疾病、紊乱或病症和/或其症状的药理学和/或生理学作用的动作。本文使用的“治疗”涵盖对宿主例如，哺乳动物，通常为人或兽医感兴趣的非人动物中疾病的任何治疗，包括A降低被确定为易感疾病但是尚未被诊断为受所述疾病感染的对象中出现所述疾病的风险，B阻止疾病的发生，和C减轻疾病即，导致疾病消退和/或减轻一种或更多种疾病症状。“治疗”还旨涵盖甚至在不。
48、存在疾病或病症的情况下递送抑制剂以提供药理学作用。例如，“治疗”涵盖递送在对象中提供提高的或期望的作用例如，降低病原体载量、减轻疾病症状等的疾病或病原体抑制剂。0045本文使用的术语“预防性治疗”是指完全地或部分地预防疾病或其症状，和/或可以是在部分地或完全地治愈疾病和/或疾病引起的不利影响方面的治疗。0046本文使用的术语“宿主”、“对象”、“患者”或“生物体”包括人和哺乳动物例如，小鼠、大鼠、猪、猫、狗和马。可以施用本发明化合物的典型宿主将是哺乳动物，特别是灵长类动物，尤其是人。对于兽医应用，很多种对象将是合适的，例如家畜，如牛、绵羊、山羊、牛、猪等；家禽，如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及驯化的。
49、动物，特别是宠物，例如狗和猫。对于诊断或研究应用，很多种哺乳动物可能是合适的对象，包括啮齿类动物例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、灵长类动物和猪，例如近交系猪等。术语“活宿主”是指活着的上述宿主或其他生物体。术语“活宿主”是指整个宿主或生物体而不仅仅是来自活宿主离体的一部分例如，肝或其他器官。0047术语“分离的化合物”是指与和其一起存在于自然界中的其他化合物基本分离或相对于所述其他化合物富集的化合物。分离的化合按重量计通常为至少约80、至少90纯、至少98纯或至少约99纯。本公开内容旨在包括非对映体，以及其外消旋的或拆分的对映体纯形式及其可药用盐。0048本文使用的术语“单位剂型”是指适于作为单一剂量用于人和/或动物对象的物理离散单位，每一个单位包含与可药用稀释剂、载体或载剂联合的以足以产生预期效果的量计算的预定量的化合物例如，本文中描述的抗病毒化合物。单位剂型的规格取决于所使用的特定化合物、施用的途径和频率、待实现的效果、以及与宿主中每一种化合物相关的药物效应动力学。0049“可药用赋形剂”、“可药用稀释剂”、“可药用载体”或“可药用辅料”是指可用。