硫代螺环内酯在细胞内次氯酸检测中的应用
技术领域
本发明涉及一种荧光检测方法，尤其是涉及一种将硫代螺环内酯作为荧光探针应用于检测细胞内产生的活性氧物种次氯酸(HClO)的方法。
背景技术
活性氧是生物体产生的一系列化学性质活泼、氧化能力强的含氧物质的总称。活性氧不仅包括一些自由基，如羟自由基(·OH)、超氧阴离子(O2-·)、过氧自由基(ROO·)等，也包括一些非自由基，如过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)和次氯酸(HOCl)等。
生物体自发产生的适量活性氧在信号转换、神经传递、免疫系统控制以及重要生理活性物质的合成与代谢等多种生命活动中，均发挥重要的积极作用。然而，当机体在外来不良环境因素的胁迫下产生过量活性氧，或机体自身的抗氧化剂大量减少时，产生及积蓄的过量活性氧则会诱导一系列有害的细胞及组织损伤，导致机体产生各种疾病。目前，许多研究结果表明，人类许多重要疾病，如癌症、冠状动脉硬化等，均与活性氧的参与密切相关。
由于活性氧在生物学过程中扮演的重要角色，因此迫切需要有效的检测手段进行更深入的观察和了解它们的作用机制。但是，生物体系中存在活性氧含量低、反应活性高、寿命短等不足，给活性氧检测带来了极大的困难。
将荧光探针与显微成像技术相结合的荧光探针技术，是人们探测微观生命系统的有力武器，具有高灵敏性及易于数据采集的特点，尤其是具有提供目标生物分子瞬时和空间信息的突出优势，而成为实时、在体检测生物体内活性物质的有力工具。寻求优良性能的荧光探针用于建立可靠的细胞内活性氧的荧光检测方法，成为目前的研究热点。迄今，人们应用不同的荧光探针，对不同的活性氧物种实现了检测，如荧光探针二(2，4-二硝基苯磺酸酯基)二氟荧光素检测细胞中超氧阴离子自由基O2-·(参见文献：Maeda，H.et al，J.Am.Chem.Soc.2005，127，68)、荧光探针二硼酸酯基荧光素检测细胞中H2O2(文献：Chang，M.C.et al，J.Am.Chem.Soc.2004，126，15392.)等。
次氯酸(HClO)由生物体内髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)催化H2O2氧化Cl-反应产生，是重要的活性氧之一，在诸多的生理、病理过程中扮演重要角色。然而，较之于其他的活性氧物种，人们对其生物学过程中的具体行为了解较少，其中的重要原因之一是有效HClO探针的匮乏(Dan Yang，et al，Org.Lett.，2008，10，2171.)。近几年来，已报道了HClO的荧光探针数种，如DCFH、DHR(参见文献：A.Bizyukin，et al，Bull.Exp.Biol.Med.1995，119，347.)、APF(文献：T.Nagano，J.Biol.Chem.2003，278，3170.)、MitoAR(文献：T.Nagano.J.Am.Chem.Soc.2007，129，10324.)等，但以上探针除了能够检测HClO，对其他的活性氧物种亦有不同程度的荧光响应。由于每种活性氧都有其各自独特的生理或病理作用，因此对专一性强的HClO荧光探针的需求显得尤为迫切。已报道的另外一些HClO探针中，有的需在pH12的苛刻的操作条件(文献：H.M.Ma，Chem.Eur.J.2008，14，4719.)，或水溶性差(文献：W.Tan，et al，Chem.Eur.J.2009，15，2305.)，无法真正应用于生物体系中。目前，能够真正应用于细胞中HClO检测的荧光探针极少，需在繁琐苛刻的条件下多步骤高成本制备而得(文献：T.Nagano，J.Am.Chem.Soc.2007，129，7313.；文献：J.Tae，Org.Lett.2009，11，(4)，859.；文献：R.Weissleder，P.Libby，Chem.Biol.2007，14，1221.)。
三苯甲烷类螺环化合物具有独特的“闭-开”环结构变化从而引起其光学信号发生从无到强的急剧变化的性质，成为人们构建““off-on”光开关型荧光探针理想的分子框架(V.Dujols，F.Ford and A.W.Czarnik，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，7386；J.Y.Kwon，J.Y.Jang，Y.J.Lee，W.Nam and J.Y.Yoon，J.Am.Chem.Soc.，2005，127，10107)。本申请人将硫原子巧妙地替代罗丹明B内酯中与螺碳原子共价相连的氧原子，合成的硫代罗丹明B螺环内酯成功地实现了对水中汞离子的高灵敏检测(Chem.Commun.，2008，1859-1861)，合成路线异常简单，产率高。
发明内容
本发明的目的在于针对已报道的细胞内次氯酸(HClO)荧光探针存在的不足与缺陷，提供一种高灵敏、高选择性的用于检测细胞中次氯酸的荧光探针。
本发明的另一目的在于提供硫代螺环内酯在细胞内次氯酸检测中的应用。
所述用于检测细胞中次氯酸的荧光探针的结构为一类含有呫吨(Xanthene)环母体结构的三苯甲烷类荧光探针，其结构式为：
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其中，R为羟基，或二乙基胺基，或乙基胺基；S为硫原子。
本发明所述检测细胞中HClO的荧光探针的结构为一类含有呫吨(Xanthene)环母体结构的三苯甲烷类化合物。
所述含有呫吨(Xanthene)环母体结构的三苯甲烷类化合物是指罗丹明(Rhodamine)类化合物或荧光素(Fluorescein)类化合物。
所述罗丹明(Rhodamine)类化合物是指罗丹明B(Rhodamine B)衍生物或罗丹明6G(Rhodamine 6G)衍生物。
所述荧光素(Fluorescein)类化合物是指荧光素(Fluorescein)衍生物或萘荧光素(Naphthofluorescein)衍生物。
所述罗丹明B(Rhodamine B)衍生物或罗丹明6G(Rhodamine 6G)衍生物是指硫代罗丹明B螺环内酯(Thiospirolactone Rhodamine B)、二硫代罗丹明B螺环内酯(DithiospirolactoneRhodamine B)或硫代罗丹明6G螺环内酯(Thiospirolactone Rhodamine 6G)等。
所述荧光素(Fluorescein)衍生物或萘荧光素(Naphthofluorescein)衍生物是指硫代荧光素螺环内酯(Thiospirolactone Fluorescein)或硫代萘荧光素螺环内酯(ThiospirolactoneNaphthofluorescein)等。
以上硫代螺环内酯荧光探针均以相应螺环内酯为原料，按本申请人已报道的合成路线(Chem.Commun.，2008，1859-1861)一步法合成而得(备注：二硫代罗丹明B内酯合成所用硫化试剂“劳氏试剂”两倍于罗丹明B内酯摩尔当量数，其余步骤与其他探针合成相似)。
本发明所述硫代螺环内酯同时对次氯酸亦具有高灵敏的荧光响应特性，将其应用于细胞中次氯酸检测的荧光探针，选择性高。探针本身光稳定性强、无光照自氧化、对目标物响应迅速、与目标物结合的产物抗光漂白能力强，细胞渗透性好，无细胞毒性。检测目标物次氯酸灵敏度高，专一性强，细胞中其他活性氧均不干扰检测。是性能优异的细胞用荧光探针。
本发明所提出的检测次氯酸的方法依赖于以下两个化学反应机制：
1)次氯酸作为活性氧中最强的氧化剂，易于进攻加成含硫基团，生成含-S-Cl基团之化合物中间体。(参见文献：1、P.V.Antwerpen，K.Z.Boudjeltia，J.Ne`ve.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.2005，337，82；2、L.K.Folkes，L.P.Candeias，P.Wardman.Arch.Biochem.Biophy.323(1)120-126，1995)。
2)次氯酸特异性地与探针分子中与螺碳原子共价相连的硫原子发生加成反应，生成含-S-Cl基团之化合物中间体，从而立即触发开环反应的“扳机”。含-S-Cl基团之中间体继而水解生成相应的含羧基的荧光团。由于探针硫代螺环内酯的闭环形式不存在共轭电子结构而表现为无色、无荧光，而一旦发生开环反应即“释放”出刚性的、大共轭结构的发色团(荧光团)，实现吸收及荧光从“无”到“有”的表观信号的急剧变化。反应过程如下所示：
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由上式可见，本发明的起效基团为硫代螺环内酯，呫吨(Xanthene)环母体结构上的不同取得基团R最终仅构成探针的不同吸收及荧光波长，不影响探针分子与HClO的作用。
本发明提供了一种基于新颖的螺环“开-闭”环光学信号传感机制而设计的一类对HClO具有特性光学响应的探针分子。不同于文献报道的是，该类荧光探针与HClO发生特异性作用后，能够同时产生三种光学性质(即颜色、分光、荧光)从“无”至“有”的转变，大大拓展了其潜在的使用范围。其性能在以下实施例和附图中给予详细说明。
附图说明
图1为pH7.4，硫代罗丹明B螺环内酯浓度为1.0×10-5mol/L条件下，不同浓度HClO存在时的吸收光谱变化(由下而上HClO浓度依次为：0，5.0，6.0，8.0，9.0μmol/L)。在图1中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度。
图2为pH7.4，硫代罗丹明B内酯浓度为1.0×10-5mol/L条件下，不同浓度HClO存在时的荧光发射光谱变化(由下而上HClO浓度依次为：0，2.0，4.0，7.0，9.0μmol/L)。在图2中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；激发波长为525nm，激发、发射单色器的狭缝均为5nm。
图3为pH7.4，硫代罗丹明B内酯浓度为1.0×10-5mol/L条件下不同种类的活性氧分别单独存在下的荧光发射光谱。在图3中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度。
图4为pH7.4，浓度为1.0×10-5mol/L的硫代罗丹明B内酯本身(曲线1)以及浓度为4.0μmol/LHClO存在下(曲线2)。在图4中，横坐标为时间(s)，纵坐标为相对荧光强度。
图5为pH7.4，浓度为1.0×10-5mol/L的硫代罗丹明B内酯在不同浓度的HClO存在下的相对荧光强度工作曲线图。在图5中，横坐标为次氯酸浓度(μmol/L)，纵坐标为相对荧光强度。
图6为本发明所提供的次氯酸探针分别在不同浓度存在下细胞存活百分比(活细胞数/总细胞数×100％，均为3个复孔平均值)。在图6中，横坐标为探针浓度(μmol/L)，纵坐标为细胞存活数(％)；■曲线1，●曲线2，▲曲线3，▼曲线4，◆曲线5，曲线1～5分别对应硫代罗丹明B螺环内酯、二硫代罗丹明B螺环内酯、硫代罗丹明6G螺环内酯、硫代荧光素螺环内酯、硫代萘荧光素螺环内酯；
图7为硫代罗丹明B螺环内酯荧光探针对人嗜中性粒细胞中HClO荧光成像图。图7A：MPO抑制前；图7B：MPO抑制后。在图7中，标尺为10μm。
图8为人嗜中性粒细胞中HClO荧光成像图。图8A：硫代罗丹明B螺环内酯；图8B：二硫代罗丹明B螺环内酯；图8C：硫代罗丹明6G螺环内酯；图8D硫代荧光素螺环内酯；图8E硫代萘荧光素螺环内酯。
具体实施方式
本发明所述用于检测细胞内次氯酸的荧光探针的化学性能说明如下。
一、在体外水溶液中荧光探针的化学性能测试：
(一)测试液的配制步骤：
在10mL的刻度试管中，依次加入5.0mL浓度为0.2mol/L的pH 7.40磷酸缓冲液，一定量的标准HClO溶液(事先以分光光度法准确标定(参见文献：Dazda M.and Margerum D.W.Inorg.Chem.1994，33，118.)，以3次蒸馏水稀释至刻度。摇匀。加入0.1mL的浓度为1.0×10-3mol/L的硫代罗丹明B螺环内酯的二甲亚砜溶液，摇匀，立即进行相关测定。
如上操作，不加入HClO或其他活性氧之溶液，为空白试液的配制。
(二)水溶液中的荧光探针光谱特性及性能。以下结合图例说明。
由图1显示，硫代罗丹明B内酯本身在可见波长区几乎无吸收(无色)，在HClO存在下，体系的吸光度显著增强，在561nm处有一最大吸收波长。吸光度随着HClO浓度的增大而增强。该现象表明，探针硫代罗丹明B内酯对HClO具有灵敏而迅速的显色效应。
由图2显示，硫代罗丹明B内酯本身几乎无荧光，在HClO存在下，体系的相对荧光强度显著增强，在579nm处有一最大荧光发射波长。相对荧光强度随着HClO浓度的增大而增强。该现象表明，探针硫代罗丹明B内酯对HClO具有灵敏而迅速的荧光信号响应。
图3为pH7.4，硫代罗丹明B内酯浓度为1.0×10-5mol/L条件下不同种类的活性氧分别单独存在下的荧光发射光谱。激发波长为525nm，激发、发射单色器的狭缝均为5nm。曲线1为HClO浓度为4.0μmol/L存在时的荧光发射光谱；曲线2为硫代罗丹明B内酯(空白)的荧光发射光谱；曲线3为其他活性氧物种分别单独存在时的荧光发射光谱，这里所指的其他活性氧物种分别是：过氧化氢(H2O2)，单态氧(1O2)，一氧化氮(NO)，超氧阴离子自由基(O2·-)，超氧亚硝基阴离子(ONOO-)，羟基自由基(·OH)，它们的浓度分别均为40.0μmol/L。
由图3显示，硫代罗丹明B内酯本身几乎无荧光，HClO存在下体系的相对荧光强度显著增强。相比之下，浓度为HClO的10倍当量的其他常见活性氧分别单独存在时，均几乎不引起明显的荧光信号。该现象表明，探针对目标物HClO具有高度的荧光特异性识别。
图4为pH7.4，浓度为1.0×10-5mol/L的硫代罗丹明B内酯本身(曲线1)以及浓度为4.0μmol/LHClO存在下(曲线2)，以波长为525nm的激发光在反应开始至600s时间范围内持续照射的相对荧光强度。
由图4显示：①由曲线1可见，探针本身在持续光照下保持无荧光；②由曲线2可见，探针与HClO的作用几乎在瞬间发生，并在约60s内即达到荧光信号的最大值；③由曲线2可见，探针与HClO作用之产物在持续光照下荧光强度保持不变。
以上现象表明，本发明提供的荧光探针具备如下优越的化学性能：①光稳定性强、无光照自氧化；②对目标物响应迅速；③目标物结合的产物抗光漂白现象能力强。
图5为pH7.4，浓度为1.0×10-5mol/L的硫代罗丹明B内酯在不同浓度的HClO存在下的相对荧光强度工作曲线图。激发波长为525nm，发射波长579nm，激发、发射单色器狭缝均为5nm。
由图5显示，HClO在0.5～7.0μmol/L的浓度范围内，探针的荧光强度与HClO浓度呈现良好的线性关系。
二，细胞实验
(一)探针的细胞毒性实验
浓度为4×105个/mL的Hela细胞液180uL加至96孔板后，加不同母液浓度的探针溶液20uL(1％DMSO，99％PBS)使探针终浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0，50.0μmol/L，同时以PBS作空白试验。每个浓度及空白均复孔3个。CO2培养箱中37℃孵育4h。取出，台盼蓝染色。40倍显微镜下计算镜下细胞数。
图6为本发明所提供的HClO探针分别在不同浓度存在下细胞存活百分比(活细胞数/空白实验活细胞数×100％，均为3个复孔平均值)。图6中的曲线1～5分别对应硫代罗丹明B内酯、二硫代罗丹明B内酯、硫代罗丹明6G内酯、硫代荧光素内酯、硫代萘荧光素内酯。
由图6显示，本发明所提供的探针在浓度0.5～50μmol/L范围内细胞存活率均大于95％，表明本发明提供的探针无细胞毒性。
(二)荧光探针检测细胞内HClO的性能测试
1.细胞的预处理步骤
健康志愿者抗凝鲜血数ml，以中性粒细胞分离液梯度密度法分离得中性粒细胞。以pH7.4的PBS溶液调整细胞浓度4×105个/mL。
2.探针对细胞中HClO检测的特异性实验
实验步骤：细胞培养皿两组(各3个)分别加入1份体积的上述细胞液后，第一组的3个培养皿分别加入0.5份体积pH7.4的PBS溶液；第二组的3个培养皿分别加入0.5份体积的浓度为80μmol/L的对氨基苯甲酰肼溶液(髓过氧化物酶的抑制剂，配制方法：对氨基苯甲酰肼固体1.2mg溶解于100mlpH7.4的PBS溶液中，得对氨基苯甲酰肼浓度为80μmol/L的溶液)。摇匀，CO2培养箱中37℃孵育60～90min。取出后，各皿分别加入0.5份体积的4.0×10-5mol/L的硫代罗丹明B内酯(1％DMSO，99％PBS)，摇匀。CO2培养箱中37℃孵育30～45min。共聚焦荧光成像，荧光激发波长均为：515nm。结果如图7A，7B。
如前所述，细胞中HClO仅由髓过氧化物酶(MPO)催化细胞中过氧化氢(H2O2)氧化氯离子(Cl-)产生。MPO在血液中噬中性粒细胞中大量表达，因而本实验以人血噬中性粒细胞为细胞模型。
由图7A可见，中性粒细胞在探针存在下产生明亮的荧光，而无核的红细胞不表达MPO(参见文献：“临床血液学与检验(第四版)，许文荣等编著”)，呈现无荧光。该结果表明探针不仅对HClO具有灵敏的荧光响应，而且具有优异的选择性。同时，也表明了探针具有良好的细胞渗透性。
由图7B可见，当噬中性粒细胞与MPO特异性的抑制剂对氨基苯甲酰肼(参见文献：R.Weissleder，P.Libby，Chem.Biol.2007，14，1221)共存时，细胞呈现弱荧光。该现象进一步确证了探针对细胞内HClO检测的高度专一性。
3.本发明所提供探针对细胞中HClO荧光成像实验
实验步骤：各细胞培养皿分别加入1份体积的上述细胞液后，再分别加入1份体积的2.0×10-5mol/L的硫代罗丹明B螺环内酯、二硫代罗丹明B螺环内酯、硫代罗丹明6G螺环内酯、硫代荧光素螺环内酯、硫代萘荧光素螺环内酯探针溶液(1％DMSO，99％PBS)，摇匀，CO2培养箱中37℃孵育30～50min。共聚焦荧光成像。结果如图8A～8E，图8A～8E分别对应硫代罗丹明B内酯、二硫代罗丹明B内酯、硫代罗丹明6G内酯、硫代荧光素内酯、硫代萘荧光素内酯荧光成像图；荧光激发波长分别为：515nm，515nm，515nm，488nm，635nm.