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本发明公开了一种毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的新工艺，主要包括发酵液的预处理工艺，发酵液预浓缩工艺，干燥工艺，菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺以及浸提液的浓缩工艺等，利普司他汀的总回收率(发酵液中利普司他汀总含量为基准)达到80以上。。
CN201010229409.2
2010.07.19
CN101885713A
2010.11.17
终止
无权
未缴年费专利权终止IPC(主分类):C07D 305/12申请日:20100719授权公告日:20111130终止日期:20130719|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07D 305/12申请日:20100719|||公开
C07D305/12
大邦(湖南)生物制药有限公司
彭滢; 张虓
410205 湖南省长沙国家高新技术产业开发区麓景路8号
本发明公开了一种毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的新工艺，主要包括发酵液的预处理工艺，发酵液预浓缩工艺，干燥工艺，菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺以及浸提液的浓缩工艺等，利普司他汀的总回收率(发酵液中利普司他汀总含量为基准)达到80％以上。
1.一种毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的新工艺，其特征在于包括发酵液的预处理工艺，发酵液预浓缩工艺，干燥工艺，菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺，浸提液的浓缩工艺，浓缩浸提液的萃取工艺，萃取液浓缩工艺，所说的发酵液预处理工艺包括在发酵终了时立刻对发酵液酸化处理。2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所说的对发酵液酸化处理是用酸化剂调节发酵液的pH＝1-6。3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于所说的酸化剂是硫酸或者有机酸，浓度在5％-45％。4.根据权利要求1或2所述的工艺，发酵液浓缩采用分离机进行预浓缩，所用的分离机采用喷嘴式，将10-20％发酵液通过分离机浓缩到15-35％。5.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于所说的干燥工艺是指采用离心喷雾干燥的方式，将预浓缩的发酵液快速干燥，以获取含有高效价的利普司他汀的菌渣。喷雾干燥条件：进风温度100-200℃，出风温度40-100℃；物料温度30-70℃；离心雾化器转速6000-12000rpm；菌渣水分含量2-12％；6.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于所说的菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺，是指喷雾干燥的菌渣采用溶剂在常温下实现浸提，经过离心达到固液分离；所说的提取溶媒是低级醇类，(如甲醇、乙醇、丙醇，丁醇和异丁醇等等)，丙酮，非极性溶剂类，(如石油醚，戊烷，己烷，环己烷、庚烷和乙酸乙酯等等)等中的一种；所说的离心采用卧螺沉降离心机(防爆)。7.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于所说的浸提液浓缩工艺是指将浸提液在20-50℃，真空条件下，利用薄膜浓缩器得到浓缩浸提液。8.根据权利要求1或2所述的工艺，将浓缩浸提液用极性溶剂类/非极性溶剂类用溶剂反相萃取分离，达到相的转移；得到萃取液。萃取工艺条件：温度5-40℃；两相体积比从1∶1到5∶1(溶剂/萃取剂)；所说的极性溶媒是低级醇类，(如甲醇、乙醇、丙醇，丁醇和异丁醇等等)，和丙酮等等中的一种，萃取溶剂是非极性溶剂类，(如石油醚，戊烷，己烷，环己烷、庚烷和乙酸乙酯等等)等中的一种。9.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于萃取液浓缩工艺是指将萃取液在20-50℃，真空条件下，利用薄膜浓缩器浓缩，实现浓缩以及溶剂的回收。
一种毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的新工艺 技术领域本发明涉及一种从发酵液中提取胞内产物的方法，特别是涉及从毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的方法。背景技术利普司他汀是毒三素链霉菌的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收。其四氢衍生物奥利司他已经被罗氏公司成功的开发为减肥药-赛尼可，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用而上市的治疗肥胖症的药物。目前传统的发酵液处理方式其主要缺点：固液两相分离困难。毒三素链霉菌发酵液粘性大，含有一定量的油性物质；同时PMV含量高达60-70％，不得不采用板框压滤技术进行过滤。由于直接压滤很容易堵塞滤布，因此在发酵液中加入大量的助滤剂，不仅造成固渣体积大，而且生产劳动强度大。滤饼即板框菌渣的含湿量大，溶媒浸提效率低。由于加入5-15％的硅藻土助滤剂，使得环保废渣的处理量大，而且无法利用。浸提溶媒溶剂用量大，达到滤饼重量的3-6倍。溶剂的回收量也大，给生产带来安全隐患因素增加。同时浸提过程中的存在明显的溶剂损失，造成生产成本的上升。萃取溶剂用量大，浓缩回收过程中耗能大。总之现有工艺存在生产效率低，劳动强度大，溶剂耗量大，后续溶剂回收工序，能耗增加；而且生产环境恶劣，安全生产隐患多。为此需要提供一种减少滤渣体积的办法，以减少溶剂用量，回收量，损耗量以降低生产成本。利普司他汀为油状粘性液体，不稳定，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇以及烷烃类溶剂。这些特点可以作为改进发明的基础。本发明的目的在于克服现有工艺技术上的缺点，提供一种从毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的改进工艺。既能满足提取过程的高效率，也能减少环保压力，改善生产作业环境，降低生产运行成本。发明内容本发明为一种毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的新工艺，包括发酵液的预处理工艺，发酵液预浓缩工艺，干燥工艺，菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺，浸提液的浓缩工艺，浓缩浸提液的萃取工艺，萃取液浓缩工艺。具体每步工艺如下：1.发酵液预处理工艺：在发酵终了时立刻对发酵液酸化处理，即用酸化剂调节发酵液的pH＝1-6，使菌体蛋白变性，同时使发酵液具有一定的流动性，酸化液可以方便的进入离心分离设备。其中所说的酸化剂是硫酸或者其他有机酸，浓度在5％-45％：2.发酵液预浓缩工艺：发酵液浓缩采用分离机进行预浓缩，所用的分离机采用喷嘴式，具有处理量大，不容易阻塞的优点。将10-20％发酵液通过分离机浓缩到15-35％；3.干燥工艺：采用离心喷雾干燥的方式，将预浓缩的发酵液快速干燥，以获取含有高效价的利普司他汀的菌渣。喷雾干燥条件：进风温度100-200℃，出风温度40-100℃；物料温度30-70℃；离心雾化器转速6000-12000rpm；菌渣水分含量2-12％；4.菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺：喷雾干燥的菌渣采用溶剂在常温下实现浸提，经过离心达到固液分离；所说的提取溶媒是低级醇类，(如甲醇、乙醇、丙醇，丁醇和异丁醇等等)，丙酮，非极性溶剂类，(如石油醚，戊烷，己烷，环己烷、庚烷和乙酸乙酯等等)等中的一种；所说的离心采用卧螺沉降离心机(防爆)。固渣可烘干作为饲料；5.浸提液浓缩工艺：指将浸提液在20-50℃，真空条件下，利用薄膜浓缩器得到浓缩浸提液。6.浓缩浸提液萃取工艺：将浓缩浸提液用极性溶剂类/非极性溶剂类用溶剂反相萃取分离，达到相的转移；得到萃取液。萃取工艺条件：温度5-40℃；两相体积比从1∶1到5∶1(溶剂/萃取剂)；所说的极性溶媒是低级醇类，(如甲醇、乙醇、丙醇，丁醇和异丁醇等等)，和丙酮等等中的一种，萃取溶剂是非极性溶剂类，(如石油醚，戊烷，己烷，环己烷、庚烷和乙酸乙酯等等)等中的一种。7.萃取液浓缩工艺：将萃取液在20-50℃，真空条件下，利用薄膜浓缩器浓缩，实现浓缩以及溶剂的回收。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本发明的内容实施例1取中试发酵液45L，固形物含量14％。(含0.6％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，边搅拌边流加，pH调至约2.5-4.5。经分离机得到的浓缩液30.6L(固形物含量22％)，进入离心喷雾干燥系统。干燥的条件：进风温度160℃，出风温度85℃，得到含湿量5％的干粉3012g。将干粉按照重量体积比1∶3的量加入9036ml的丙酮中120rpm搅拌1h，离心过滤，得到浸提液体8200ml(利普司他汀含量251.13g，回收率93％)。40℃下薄膜真空浓缩至2050ml(回收丙酮)，加入庚烷1025ml，常温下萃取，真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏493.2g，利普司他汀回收率为80％。实施例2取中试发酵液45L，固形物含量15％。(含0.58％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，调节pH至约2.5-4.5。经分离机分离得到30.2L浓缩液。(固形物含量21％)，进入离心喷雾干燥系统。干燥条件：进风150℃，出风80℃。得到含湿量6.2％干粉3097g。将干粉按照重量体积比1∶3的量分两次加入9291ml乙醇浸提，120rpm搅拌1h。离心过滤，两次得到提取液8.29L(利普司他汀含量为248.92g，回收率96％)。40℃下薄膜真空浓缩至2.1L(回收乙醇)，加入庚烷1.0L，常温下萃取，庚烷萃取液真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏501.3g，利普司他汀总回收率为83％。实施例3取中试发酵液42L，固形物含量14％(含0.57％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，调节pH至约2.5-4.5。经分离机分离得到29.3L浓缩液。进入离心喷雾干燥系统。干燥条件：进风140℃，出风80℃。得到含湿量6.8％干粉2895g。将干粉按照重量体积比1∶3的量加入8.7L乙醇浸提，120rpm搅拌1h。离心过滤，得到浸提液7.790L(利普司他汀的含量为231.4g，回收率97％)。40℃下薄膜真空浓缩至1.940L(回收乙醇)，加入庚烷970ml，常温下萃取，真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏457.8g，利普司他汀的总回收率为84％。实施例4取中试发酵液42L，固形物含量14％(含0.61％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，调节pH至约1.5-3.5。经分离机分离得到29.4L浓缩液。进入离心喷雾干燥系统。干燥条件：进风140℃，出风80℃。得到含湿量6.9％的干粉2910g。将干粉按照重量体积比1∶3的量加入8.7L乙醇浸提，120rpm搅拌1h。离心过滤，得到浸提液7.8L(利普司他汀含量为249.92g，回收率97.8％)。40℃下经薄膜真空浓缩至1.95L(回收乙醇)，加入庚烷970ml，常温下萃取，真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏493.5g，利普司他汀的总回收率为85.6％。综上所述可见，本发明通过对发酵液的预处理改变菌体表面的化学性质，从而大大提高发酵液中利普司他汀高温下的稳定性；通过预浓缩和喷雾干燥，去除助滤剂的使用，和减少提取和萃取溶剂用量、减少了生产成本。在特定的喷雾干燥条件下，所得的干菌渣；经合适的溶剂浸提反萃后，总收率达到80％以上。
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中提取胞内产物的方法，特别是涉及从毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的方法。
背景技术
利普司他汀是毒三素链霉菌的代谢产物，能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收。其四氢衍生物奥利司他已经被罗氏公司成功的开发为减肥药-赛尼可，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用而上市的治疗肥胖症的药物。
目前传统的发酵液处理方式其主要缺点：
固液两相分离困难。毒三素链霉菌发酵液粘性大，含有一定量的油性物质；同时PMV含量高达60-70％，不得不采用板框压滤技术进行过滤。由于直接压滤很容易堵塞滤布，因此在发酵液中加入大量的助滤剂，不仅造成固渣体积大，而且生产劳动强度大。
滤饼即板框菌渣的含湿量大，溶媒浸提效率低。由于加入5-15％的硅藻土助滤剂，使得环保废渣的处理量大，而且无法利用。
浸提溶媒溶剂用量大，达到滤饼重量的3-6倍。溶剂的回收量也大，给生产带来安全隐患因素增加。同时浸提过程中的存在明显的溶剂损失，造成生产成本的上升。
萃取溶剂用量大，浓缩回收过程中耗能大。
总之现有工艺存在生产效率低，劳动强度大，溶剂耗量大，后续溶剂回收工序，能耗增加；而且生产环境恶劣，安全生产隐患多。为此需要提供一种减少滤渣体积的办法，以减少溶剂用量，回收量，损耗量以降低生产成本。
利普司他汀为油状粘性液体，不稳定，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇以及烷烃类溶剂。这些特点可以作为改进发明的基础。
本发明的目的在于克服现有工艺技术上的缺点，提供一种从毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的改进工艺。既能满足提取过程的高效率，也能减少环保压力，改善生产作业环境，降低生产运行成本。
发明内容
本发明为一种毒三素链霉菌发酵液中分离提取利普司他汀的新工艺，包括发酵液的预处理工艺，发酵液预浓缩工艺，干燥工艺，菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺，浸提液的浓缩工艺，浓缩浸提液的萃取工艺，萃取液浓缩工艺。具体每步工艺如下：
1.发酵液预处理工艺：在发酵终了时立刻对发酵液酸化处理，即用酸化剂调节发酵液的pH＝1-6，使菌体蛋白变性，同时使发酵液具有一定的流动性，酸化液可以方便的进入离心分离设备。其中所说的酸化剂是硫酸或者其他有机酸，浓度在5％-45％：
2.发酵液预浓缩工艺：发酵液浓缩采用分离机进行预浓缩，所用的分离机采用喷嘴式，具有处理量大，不容易阻塞的优点。将10-20％发酵液通过分离机浓缩到15-35％；
3.干燥工艺：采用离心喷雾干燥的方式，将预浓缩的发酵液快速干燥，以获取含有高效价的利普司他汀的菌渣。喷雾干燥条件：进风温度100-200℃，出风温度40-100℃；物料温度30-70℃；离心雾化器转速6000-12000rpm；菌渣水分含量2-12％；
4.菌渣的溶媒浸提与菌渣的固液分离工艺：喷雾干燥的菌渣采用溶剂在常温下实现浸提，经过离心达到固液分离；所说的提取溶媒是低级醇类，(如甲醇、乙醇、丙醇，丁醇和异丁醇等等)，丙酮，非极性溶剂类，(如石油醚，戊烷，己烷，环己烷、庚烷和乙酸乙酯等等)等中的一种；所说的离心采用卧螺沉降离心机(防爆)。固渣可烘干作为饲料；
5.浸提液浓缩工艺：指将浸提液在20-50℃，真空条件下，利用薄膜浓缩器得到浓缩浸提液。
6.浓缩浸提液萃取工艺：将浓缩浸提液用极性溶剂类/非极性溶剂类用溶剂反相萃取分离，达到相的转移；得到萃取液。萃取工艺条件：温度5-40℃；两相体积比从1∶1到5∶1(溶剂/萃取剂)；所说的极性溶媒是低级醇类，(如甲醇、乙醇、丙醇，丁醇和异丁醇等等)，和丙酮等等中的一种，萃取溶剂是非极性溶剂类，(如石油醚，戊烷，己烷，环己烷、庚烷和乙酸乙酯等等)等中的一种。
7.萃取液浓缩工艺：将萃取液在20-50℃，真空条件下，利用薄膜浓缩器浓缩，实现浓缩以及溶剂的回收。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明的内容
实施例1
取中试发酵液45L，固形物含量14％。(含0.6％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，边搅拌边流加，pH调至约2.5-4.5。经分离机得到的浓缩液30.6L(固形物含量22％)，进入离心喷雾干燥系统。干燥的条件：进风温度160℃，出风温度85℃，得到含湿量5％的干粉3012g。将干粉按照重量体积比1∶3的量加入9036ml的丙酮中120rpm搅拌1h，离心过滤，得到浸提液体8200ml(利普司他汀含量251.13g，回收率93％)。40℃下薄膜真空浓缩至2050ml(回收丙酮)，加入庚烷1025ml，常温下萃取，真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏493.2g，利普司他汀回收率为80％。
实施例2
取中试发酵液45L，固形物含量15％。(含0.58％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，调节pH至约2.5-4.5。经分离机分离得到30.2L浓缩液。(固形物含量21％)，进入离心喷雾干燥系统。干燥条件：进风150℃，出风80℃。得到含湿量6.2％干粉3097g。将干粉按照重量体积比1∶3的量分两次加入9291ml乙醇浸提，120rpm搅拌1h。离心过滤，两次得到提取液8.29L(利普司他汀含量为248.92g，回收率96％)。40℃下薄膜真空浓缩至2.1L(回收乙醇)，加入庚烷1.0L，常温下萃取，庚烷萃取液真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏501.3g，利普司他汀总回收率为83％。
实施例3
取中试发酵液42L，固形物含量14％(含0.57％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，调节pH至约2.5-4.5。经分离机分离得到29.3L浓缩液。进入离心喷雾干燥系统。干燥条件：进风140℃，出风80℃。得到含湿量6.8％干粉2895g。将干粉按照重量体积比1∶3的量加入8.7L乙醇浸提，120rpm搅拌1h。离心过滤，得到浸提液7.790L(利普司他汀的含量为231.4g，回收率97％)。40℃下薄膜真空浓缩至1.940L(回收乙醇)，加入庚烷970ml，常温下萃取，真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏457.8g，利普司他汀的总回收率为84％。
实施例4
取中试发酵液42L，固形物含量14％(含0.61％利普司他汀)。发酵液用硫酸调节，调节pH至约1.5-3.5。经分离机分离得到29.4L浓缩液。进入离心喷雾干燥系统。干燥条件：进风140℃，出风80℃。得到含湿量6.9％的干粉2910g。将干粉按照重量体积比1∶3的量加入8.7L乙醇浸提，120rpm搅拌1h。离心过滤，得到浸提液7.8L(利普司他汀含量为249.92g，回收率97.8％)。40℃下经薄膜真空浓缩至1.95L(回收乙醇)，加入庚烷970ml，常温下萃取，真空浓缩至无庚烷冷凝出，得到浓缩膏493.5g，利普司他汀的总回收率为85.6％。
综上所述可见，本发明通过对发酵液的预处理改变菌体表面的化学性质，从而大大提高发酵液中利普司他汀高温下的稳定性；通过预浓缩和喷雾干燥，去除助滤剂的使用，和减少提取和萃取溶剂用量、减少了生产成本。在特定的喷雾干燥条件下，所得的干菌渣；经合适的溶剂浸提反萃后，总收率达到80％以上。
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