通过在含有羧基的不溶性材料上进行吸附来纯化天然钴胺 素的方法 【技术领域】
本发明涉及一种通过在含有羧基的不溶性材料上进行吸附来纯化和 / 或浓缩天 然钴胺素的方法。背景技术
维生素 B12( 或钴胺素， Cbl) 是一种复杂结构的有机金属辅因子。它只是通过细菌 合成， 而所有其他生物体经过复杂的食物链来获取该维生素。 人体中 B12 的缺乏引起严重的 疾病， 伴有神经系统异常、 贫血以及最终死亡。
Cbl 的核心结构 ( 图 1A) 包括带有中心钴离子的咕啉环。它的下面配位位置 ( 也 称作 α- 位 ) 被 5′， 6′ - 二甲基 - 苯并咪唑基 (Bzm) 占据。上面的轴向位置 (β- 位 ) 可 能含有以不同强度与钴结合的不同基团。然而， Cbl 的所有变体在动物细胞内都被转化成 辅因子甲基 - 和 5′ - 脱氧 -5′ - 腺苷基 - 钴胺素 ( 分别为 Me·Cbl， Ado·Cbl)。以上两 种形式的钴胺素在生理条件下经过偶然的转化成为 H2O·Cbl， 维生素 B12a。因此， Me·Cb、 Ado·Cbl 和 H2O·Cbl 是天然钴胺素的三种普遍存在的变体。
工业纯化迄今已瞄准了该维生素的另一种形式， 即 CN· Cbl， 其含有与 Cbl 的 β 位 牢固结合的氰基。严格来讲， 名称 “维生素 B12” 是指 CN·Cbl。这种形式是通过用 KCN 或 NaCN 处理细菌提取物并将生物钴胺素转化成 CN· Cbl 来制备。维生素 B12 在工业上是通过 微生物发酵， 利用几乎完全重组的脱氮假单胞菌 (Pseudomonas denitrificans) 和丙酸杆 菌 (Propionibacterium species)， 然后将天然钴胺素通过化学方法 ( 包括氰化接着用有 机溶剂提取和纯化的步骤 ) 转化成氰钴胺素形式来生产。化学转化步骤和随后的任何纯化 步骤导致该生产工艺昂贵， 对操作人员不安全而且不环保。
本文提出的方法不同于文件 WO2006/024303 中描述的方法， 其使用了另一种具有 不同结合性质的钴配位基团。在 WO2006/024303 中， H2O·Cbl 被描述为是使用含有四氮唑 的基质作为 Cbl- 配位化合物从粗提取物中纯化。然而， 已经发现含有四氮唑的物质不与 Ado·Cbl 和 Me·Cbl 结合， 细胞提取物必须被强烈照射以使其他钴胺素转化为 H2O·Cbl。 另外的缺点在于含四氮唑的物质价格相对较高。
本发明描述了一种纯化钴胺素的方法， 该方法具有天然钴胺素与含有 COOH 基 的物质之间相互作用的最佳条件。该物质可以是商业可得的材料， 例如含有 COOH 基的 Amberlite 树脂。通过使用本发明来纯化钴胺素， 意外地发现， 很可能以比先前使用的方法 更容易且低廉的工艺获得钴胺素， 并且本质上减少或完全排除了污染且有毒的氰化物的应 用。 发明内容 本文描述的发明涉及一种方法的应用以及该方法本身， 其中该方法是用于获得包 含至少一种钴胺素的浓缩溶液的方法， 并且该方法包括步骤 ：
●提供包含至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液，
●提供能够与所述天然钴胺素进行特异性相互作用的含有羧基的吸附材料，
●使所述含有至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液与所述吸附材料接触， 由此 至少一部分所述至少一种类型的天然钴胺素被吸附和 / 或结合在所述吸附材料上， 以及
●从所述吸附材料上洗脱所述至少一种类型的天然钴胺素， 由此
●获得含有至少一种钴胺素的浓缩溶液。
可获得的天然钴胺素可以是 5 ′ - 脱氧 -5 ′ - 腺苷基 - 钴胺素 ( 腺苷基 -Cbl， Ado·Cbl)、 甲基 - 钴胺素 ( 甲基 -Cbl， Me·Cbl) 和水 - 钴胺素 ( 水 -Cbl， H2O·Cbl) 中的 任何。
与其他方法相比， 可以不使用氰化物或者使用减少量的氰化物来获得这些钴胺 素。
通过上述方法获得浓缩溶液， 该溶液包含至少一种天然钴胺素和 / 或 CN·Cbl， 其 可以用于制备药物、 膳食补充剂和 / 或维生素制剂。
钴胺素 (Cbl， 维生素 B12) 是人类代谢必需的复杂有机分子。它从氰化物处理的 细菌提取物中进行的工业纯化是基于 CN·Cbl 与亲水性或疏水性吸附剂的非特异性结合。 本发明使 Cbl 与含羧基的吸附剂 ( 例如 Amberlite Cobalamion) 之间的相互作用的特异 性增强， 这使得纯化程序更加有效。该方法是基于某些 Cbl 通过 Cbl 的钴离子与 COOH 基 之间的特异性配位键而结合到含 COOH 的树脂上的能力。这具体涉及天然钴胺素， 即腺苷 基 -Cbl(Ado·Cbl)、 甲 基 -Cbl(Me·Cbl) 和 水 -Cbl(H2O·Cbl)， 已经发现它们基本上比 CN·Cbl 更好地结合到 COOH- 树脂上。H2O·Cbl 的水分子在例如 pH3-6 时容易被 COOH 基 从钴上置换。其他两种生物形式 (Ado· 和 Me· Cbl) 的钴离子在一定程度上被保护， 不过已 经发现它们在 pH ≤ 4 时易于配位。因此， 由于有另外的 RCOOH- 钴结合， 所有天然钴胺素在 pH 值约 3.5 都基本上将比 CN· Cbl 更好地结合在 COOH- 吸附剂上。开发本发明以改进从发 酵液对 Cbl 的吸附， 减少吸附剂的量， 以及排除用危险氰化物处理发酵液， 因为 CN·Cbl 不 能与 RCOOH- 钴结合。 附图说明 图1： Cbl 的结构及其轴向配位位置。A)Cbl 的结构， α 位有 Bzm 并且 β 位有 R 基； B)H2O·Cbl ； C)Ado·Cbl 和 Me·Cbl ； D)CN·Cbl。
图2： 不同 pH 下 Cbl 与 CM-Sepharose 的结合。A) 在低离子强度下结合 ； B) 在高 离子强度下结合 ； C) 用 NaOH 滴定 CM-Sepharose 悬浮液基质∶水＝ 1 ∶ 1。
图3： Cbl 与 Amberlite Cobalamion 的结合。A) 在 pH 3.5 从溶液中除去不同的 钴胺素 ； B) 在不同 pH 和离子强度下从溶液中除去 H2O·Cbl ； C) 将 Cbl 从用或未用氰化物 处理的发酵液中结合到 Cobalamion 树脂上。
图4 ： 从发酵液中纯化 Cbl。 A) 纯化程序的方案 ； B) 在不同纯化步骤获得的产品的 吸收光谱。
发明详细描述
本发明一方面涉及一种用于获得包含至少一种钴胺素的浓缩溶液的方法， 该方法 包括 ：
●提供包含至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液，
●提供能够与所述天然钴胺素进行特异性相互作用的含有羧基的吸附材料，
●使所述包含至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液与所述吸附材料接触， 由此 至少一部分所述至少一种类型的天然钴胺素被吸附和 / 或结合在所述吸附材料上， 以及
●从所述吸附材料上洗脱所述至少一种类型的天然钴胺素和 / 或 CN·Cbl， 由此
●获得含有至少一种钴胺素的浓缩溶液。
本文所述的方法还可以用于纯化和 / 或分离和 / 或浓缩天然钴胺素。包含至少一 种钴胺素的浓缩溶液可能含有杂质， 并且该浓缩溶液可进一步被处理， 例如按本文如下所 述处理。
在一种实施方式中， 天然钴胺素可以是 5′ - 脱氧 -5′ - 腺苷基 - 钴胺素 ( 腺苷 基 -Cbl， Ado· Cbl)、 甲基 - 钴胺素 ( 甲基 -Cbl， Me· Cbl) 和水 - 钴胺素 ( 水 -Cbl， H2O· Cbl) 中的一种或多种天然钴胺素。这些钴胺素是目前存在于活细胞中的 Cbl 的主要形式， 具有 以下大致分配 ： 60％ Ado·Cbl、 20％ Me·Cbl、 20％ H2O·Cbl。浓缩溶液中获得的钴胺素 可包含主要部分为钴胺素原始混合物 ( 在黑暗中碱性洗脱 )， CN· Cbl( 在 KCN 或 NaCN 存在 下碱性洗脱 )， 或 H2O·Cbl( 碱性洗脱伴随照射 )。 在另一种实施方式中， 该包含至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液可以是选自 以下的溶液 ： 发酵液 ； 细胞提取物， 如培养上清液或滤液 ； 生物提取物 ； 含有纯的或带污染 性化合物的天然钴胺素的任意组合物的液体 ； 或它们的混合物。
上述类型的基于微生物的溶液可以是基于细菌培养物和 / 或重组酵母。细菌脱氮 假单胞菌 (Pseudomonas denitrificans) 和丙酸杆菌 (Propionibacterium species)( 野 生型以及重组体 ) 可以用于生产发酵液。生物提取物也可以是来自重组植物的植物提取物 和 / 或来自动物或人类组织 ( 如肝、 肾、 肌肉 ) 或者动物或人类液体 ( 如血浆、 乳汁、 唾液 ) 的提取物。
来自动物的提取物或液体可获自任何动物的上述器官， 优选获自猪和牛。
本文所述的第一溶液可在与吸附材料接触之前进行预处理。 预处理可以是过滤以 除去碎片， 例如来自细胞壁、 细胞膜和 / 或细胞器的组分。
在进一步的实施方式中， 当该含有至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液与吸附 材料接触时， 所述第一溶液可具有介于约 2 和约 8 之间的 pH 值。优选的是 pH 值介于 3 和 6 之间。还优选的是 pH 值介于约 2.5 和约 4.5 之间。更优选的是 pH 值介于约 3 和约 4 之 间。最优选的是 pH 值约 3.5。细胞的破坏和匀化作用使 H2O· Cbl 暴露于能进行配位的不同 的亲核物质， 例如组氨酸、 含有组氨酸和 / 或半胱氨酸的肽类， 以及还原型谷胱甘肽 (GSH)。 为了使这种竞争性配位最小化， 溶液的 pH 值应该如上面所述的那样低 ( 例如 pH 3-3.5) 以 使上述物质质子化。活细胞中不存在氰化物， 因为这种化合物有剧毒。有可能用氰化物处 理细胞提取物， 然后将 CN·Cbl 吸附在非特异性吸附材料上。
在一种实施方式中， 当该含有至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液与吸附材料 接触时， 所述第一溶液具有约 0 至约 0.5M 的离子强度。优选的是离子强度约 0 至约 0.25M。 更优选的是离子强度约 0 至约 0.1M。
在进一步的实施方式中， 当该含有至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液与吸 附材料接触时， 所述第一溶液具有 5-50 ℃的温度。该温度也可以更高， 例如高达 90 ℃或
100℃。升高的温度加速结合进程。优选的是温度介于 10 和 40℃之间。更优选的是温度介 于 15 和 35℃之间。尤其更优选的是温度介于 20 和 30℃之间。最优选的是温度约 25℃或 者室温。
在另一种实施方式中， 所述含有至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液进一步包 含有机溶剂。该有机溶剂可能是有机醇或丙酮。有机溶剂中可能单独或结合使用以下 ： 甲 醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇。有机溶剂的量可能是所述第一溶液体积的 1-50％， 例如 5-30％， 例如 10-20％。
在一种实施方式中， 由于天然钴胺素的钴原子与吸附材料的羧基之间的特异性吸 附和 / 或结合和 / 或由于弱氢键合， 至少一种类型的天然钴胺素被吸附和 / 或结合到该吸 附材料上。
所有钴胺素都能潜在地与聚合物相互作用， 例如通过咕啉环的酰胺侧链与吸附剂 的质子化羧基 (R-COOH) 之间的弱氢键合， 如图 1A 所示。同时， 这种类型的结合是弱的、 非 特异性的， 并且需要在树脂内部有大小合适的孔。某些形式的 Cbl 与 COOH- 树脂之间可以 达到较强的结合。这种类型的相互作用涉及 Cbl 的上面和 / 或下面的轴向位置 ( 分别为 β- 和 α- 位 )， 其可以开放或关闭以便配位， 取决于 Cbl 的形式和结合条件。 H2O·Cbl 包含一个 β- 配位水分子， 其与钴弱结合并可以轻易地被其他化学物质 置换 ( 图 1B)。已经发现 H2O·Cbl 可以潜在地经由其上表面与带亲核基团的吸附剂 ( 如 COOH- 树脂 ) 结合。这两种催化形式 (Me·Cbl 和 Ado·Cbl) 在上侧都被保护以免于配位。 然而， 它们的 Bzm 碱基可以在约 2-4 的酸性 pH 下脱离咕啉环的下表面， 该 pH 使钴离子开放 以便配位 ( 图 1C)。在本发明的开发中， 已经认识到所有生物形式的 Cbl 都可以通过与钴 结合而有效地吸附在 COOH- 树脂上。相反， 氰化物处理的维生素 (CN· Cbl) 则完全被保护。 在本文其他地方描述的一些非破坏性条件下， 不管是上面的氰基还是 Bzm 碱基都不能脱离 钴 ( 图 1D)。因此， 根据该方法中使用的参数， 吸附材料的 COOH 基与 CN·Cbl 弱结合， 这是 通过与咕啉环的酰胺键的氢键结合， 而非钴离子。 如果使用低的 pH 2-4， 则 CN· Cbl 与 COOH 基非特异性地弱结合。
生物钴胺素的钴配位性质可以用于它们从粗细胞提取物中的纯化。与 CN· Cbl 和 亲水性或疏水性树脂的非特异性弱结合相比， 本方法有本质的优势。由此， 向 CN· Cbl 的转 化实质上弱化了钴胺素与本文所述含有羧基的吸附材料之间的相互作用。
如果氰基 - 钴胺素 (CN·Cbl) 存在于第一溶液中， 那么 CN·Cbl 可能通过弱氢键 以非特异性方式与吸附材料结合。天然钴胺素可以与吸附材料结合， 因为钴胺素的钴离子 与吸附材料的 COOH 残基之间的特异性相互作用。氢键也有可能参与天然钴胺素与吸附材 料的结合。氰基钴胺素与天然钴胺素的不同结合体系使达到的结合速度和亲和力不同， 其 对于天然钴胺素来说实质上可能较高。
在一种实施方式中， 包含羧基的吸附材料可以是包括游离羧基的聚合物材料。优 选的是羟基浓度为 0.5-5mol/L 的湿材料。更优选的是浓度 0.7-4mol/L 的湿材料。最优选 的是浓度 1-3mol/L 的湿材料。
如上所述， 第一溶液的 pH 值可能是介于 2 和 8 之间， 然而在吸附材料内部和 / 或 接近吸附材料处， pH 预计为约 2 至约 3， 基本上与第一溶液的 pH 无关。吸附材料的体积内 部和 / 或接近吸附材料处可能被吸附材料的 COOH 基缓冲。
Ado·Cbl 以及 H2O·Cbl 的结合是在上述条件下进行， 即低 pH， 大约比 CN·Cbl 快 10 倍并且强 20 倍。在从培养液进行柱吸附期间， 大约 30 分钟之后观察到第一溶液的高达 约 90％的钴胺素的结合， 因此第一溶液的流量可以是每小时 1-2 个床体积。
本文所述的聚合物材料可以是任何形式， 如网状形式和 / 或珠状形式。
在大孔网状树脂中， 非常小的凝胶珠可能交联在一起并产生多孔的网。在本发明 中， 这些孔可能具有适合钴胺素分子渗透该材料的直径。这些孔可能具有例如 的 直 径， 例如 例如
例如 例如例如例如例如由本文所述材料制成的小珠子可以产生更大的珠子， 例如直径 0.1 至 1mm。 珠子尺 寸可以以 “目” 衡量。目表示每英寸的单位数目。例如， 50 目对应≈ 0.5mm 的颗粒。本发明 的较大颗粒可能具有 0.1-3mm 的直径。优选的是 0.2-2mm 的直径。更优选的是 0.3-1mm 的 直径。最优选的是约 0.5mm 的直径。
在进一步的实施方式中， 吸附材料可能包含活性单体和共聚体。 活性单体可选自 ： 例如， 丙烯酸 (CH2 ＝ CH-COOH)、 甲基丙烯酸 (CH2 ＝ C(CH3)-COOH) 和苯甲酸乙烯酯 (CH2 ＝ CH(C6H4)-COOH)， 或者它们的结合。 用作聚合物材料的丙烯类组分可选自丙烯酸、 丙烯酸丁酯、 2- 丙烯酸乙基己酯、 丙 烯酸甲酯、 丙烯酸乙酯丙烯腈、 甲基丙烯酸甲酯和 / 或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯， 或者它们 的结合。
在一种实施方式中， 聚合物材料可进一步包括苯乙烯、 乙烯类、 丙烯类和 / 或糖类 组分。聚合物材料也可包括丙烯腈、 甲基苯乙烯、 丁二烯、 苯乙烯、 二乙烯基苯 (DVB) 和 / 或 二乙烯醚 (DVE) 以获得交联树脂。
在一种实施方式中， 上述活性单体构成吸附材料的 1-90 ％。活性单体的量可以 是聚合物材料总量的 1-80 ％， 例如 1-70 ％， 例如 1-60 ％， 例如 1-50 ％， 例如 1-40 ％， 例如 1-30％， 例如 1-20％， 例如 1-10％。 活性单体的量也可能是例如 5-10％、 10-15％、 15-20％。
基本上所有非活性单体部分的吸附材料都是共聚物。任何合适的共聚物都可使 用， 例如至少一种丙烯类组分。丙烯类组分可以是本文其他地方所述的一种。
在优选的实施方式中， 活性单体， 丙烯酸、 甲基丙烯酸和 / 或苯甲酸乙烯酯， 可能 与选自丙烯酸、 丙烯酸丁酯、 丙烯酸 2- 乙基己酯、 甲基丙烯酸、 丙烯酸乙酯丙烯腈、 甲基丙 烯酸甲酯和 / 或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和 / 或与丙烯腈、 甲基苯乙烯、 丁二烯、 苯乙烯、 二 乙烯基苯 (DVB)、 二乙烯醚 (DVE) 中的一种或多种组分共聚， 以得到交联树脂。
本文所述的交联材料可以是商业可得的产品， 其已经和 / 或可以被改性以获得大 量羧基基团。商业产品的实例是 Amberlites 产品， 例如 Amberlites Cobalamio、 IRC-50、 IRC-76 和 / 或 CM-Sepharose。
本文所述的吸附材料可在使用前预处理。预处理可以是树脂的再生。在优选的实 施方式中， 再生是用酸性溶液进行。在更优选的实施方式中， 再生是用 HCl 进行。再生可用 1M 的 HCl 进行。酸性溶液的体积可以是任何合适的， 例如 1-5 个床体积的溶液。在优选的 实施方式中， 可以使用 2 个床体积的 HCl。
在一种实施方式中， 至少一种类型的天然钴胺素与吸附材料的结合是通过柱色谱 和 / 或分批吸附和 / 或膜过滤的方式来实施。培养液∶吸附材料的比率可以是 200 ∶ 1 至
1 ∶ 1， 优选 40 ∶ 1。相对体积 1V 相当于使用培养液∶吸附材料的比率＝ 40 ∶ 1 的吸附方 案时， 珠子在柱子中占据的体积 ( 包括珠子之间的空隙 )。
当结合到吸附材料上时， 吸附材料可能是被冲洗过的。 冲洗或洗涤溶液可以是水、 醇或丙酮。水冲洗溶液可以是 20℃的水， 或者它可能加热至例如 25℃和 70℃之间。醇可 能是乙醇、 丙醇 (1- 或 2-)、 丁醇 (1- 或 2-) 和 / 或叔丁醇。可能单独或混合使用一种或多 种冲洗溶液。在优选的实施方式中， 吸附材料是用水接着用醇然后再用水冲洗。醇的浓度 可以是 10-100％， 优选 15-25％， 或者基本上为 20％。冲洗溶液的一个实例是 20％的 2- 丁 醇。
冲洗溶液的体积可以是适于冲洗吸附材料的任何体积。该体积可以是共计 2-50 个床体积， 例如 3-40 个床体积， 例如 4-30 个床体积， 例如 5-20 个床体积， 例如 6-10 个床体 积。
在进一步的实施方式中， 当结合到吸附材料上时， 至少一种类型的天然钴胺素被 碱性溶液从吸附材料上被洗脱下来。碱性溶液可以是任何合适的溶液， 并且可选自 NH4OH、 K3PO4、 NaOH、 KOH、 Tris、 三乙胺、 碳酸氢盐、 含有胺的化合物、 或其结合。洗脱还可以通过逐 步应用碱性溶液来完成， 例如先是一些 NH4OH 然后是一些 KOH。这种碱性溶液的逐步使用可 以是以任意顺序使用本文提到的碱性溶液。
当用碱性溶液洗脱被结合的钴胺素时， 该碱性溶液可以是以吸附材料的 2-50 个 床体积的量来使用。优选的是 2-40 个床体积。更优选的是 2-30 个床体积。尤其更优选的 是 2-20 个床体积。最优选的是 2-10 个床体积。
碱性溶液可以具有介于 0.2 至 10M 之间的高摩尔浓度。优选的是 0.3-9M 的摩尔 浓度。更优选的是 0.4-8M 的摩尔浓度。尤其更优选的是 0.5-7M 的摩尔浓度。进一步优选 的是 0.6-6M 的摩尔浓度。还优选的是 0.7-5M 的摩尔浓度。更优选的是 0.8-4M 的摩尔浓 度。尤其更优选的是 0.9-3M 的摩尔浓度。进一步优选的是 1-2M 的摩尔浓度。
就 K3PO4 而言， 该碱性溶液的优选摩尔浓度是 0.2-5M。优选的是 0.5-4M。更优选 的是 1-3M 的摩尔浓度。尤其更优选的是约 2M 的摩尔浓度。
就 NH4OH 而言， 该碱性溶液的优选摩尔浓度是 1-10M， 相当于 3-30 ％。优选的是 2-9M 的摩尔浓度。更优选的是 3-8M 的摩尔浓度。尤其更优选的是约 4-7 的摩尔浓度。进 一步优选的是约 5-6M 的摩尔浓度。
在一种实施方式中， 碱性溶液可含有氰化物。氰化物可以是 KCN 和 / 或 NaCN。 氰化物的浓度的实例可以是 1-200mM 浓度， 该浓度也可能是 1-25mM、 25-50mM、 50-75mM、 75-100mM、 100-150mM 或 150-200mM， 优选 5-10mM。
如果使用了氰化物， 它就与钴胺素的钴离子结合。氰化物的结合彻底阻止了 R-COOH 与钴胺素的钴离子的特异性配位。
也有可能在洗脱介质中避免氰化物。在这种情况下， 洗脱产物将是 H2O·Cbl、 Ado·Cbl 和 Me·Cbl 的混合物， 其中如果没有提供避光保护的话， 预计 H2O·Cbl 为主要的 形式。这样， 纯化可以是针对 H2O·Cbl。
在优选的实施方式中， 碱性溶液可选自不含或含有 1-100mM 氰化物的 3-30 ％ NH4OH(1-10M)， 或者是不含或含有 1-100mM 氰化物的 0.2-5M K3PO4。
在一种实施方式中， 所述包含至少一种钴胺素的浓缩溶液可以包含所述第一溶液中至少 30％的钴胺素。浓缩溶液中钴胺素的浓度还可以是至少 40％， 例如至少 50％， 例如 至少 60％， 例如至少 70％， 例如至少 80％， 例如至少 90％， 例如至少 95％。在优选的实施 方式中， 浓缩溶液中获得了第一溶液中 30-70％的钴胺素。在另一种实施方式中， 该浓度为 40-60％。在进一步优选的实施方式中， 该浓度为 45-55％。
在另一种实施方式中， 所述包含至少一种钴胺素的浓缩溶液， 就至少一种钴胺 素而言， 可含有至少 0.5mM 的浓度。该浓度还可以是至少 0.75mM， 例如至少 1mM， 例如至 少 1.25mM， 例如至少 1.5mM， 例如至少 2mM， 例如至少 2.25mM， 例如至少 2.5mM， 例如至少 2.75mM， 例如至少 3mM， 例如至少 3.5mM， 例如至少 4mM， 例如至少 4.5mM， 例如至少 5mM。
在进一步的实施方式中， 所述浓缩溶液可以是纯化的。可以使用任何适宜的纯化 工艺。此种纯化工艺的实例包括步骤 ：
●蒸发或冻干液体和 / 或脱盐， 和
●用甲醇沉降杂质， 和
●蒸发或旋转蒸发甲醇， 溶于水中， 以及
●在混合离子交换器上吸附 / 吸收杂质。
蒸发步骤可以通过任何已知的蒸发技术进行， 可包括空气流或真空下旋转蒸发。 还可以加热该浓缩溶液， 以提高蒸发效率。蒸发可进行 3-12 小时。脱盐可包括在木炭或 XAD- 树脂上吸附， 然后用醇 ( 例如 96％乙醇 ) 洗脱并蒸发。 杂质的去除可通过将先前步骤中的干燥浓缩样品溶解于 3-5 倍相对体积 V 的甲醇 (80-100％， 优选 100％ ) 中来实现。 钴胺素溶于甲醇中， 而杂质或污染物仍保持粒状并且可 以通过离心和 / 或过滤除去。为了提供 0.1-10mM， 优选 3mM 的最终 Cbl 浓度， 所使用的甲醇 体积可以是 4 倍相对体积 V。
在一种实施方式中， 旋转蒸发可以在 10-80℃的温度， 优选 20-40℃， 并且真空下 进行。
在有大致相等的三个组分下， 混合离子交换器的相对体积相当于 1V ： 1)0.333V 强 阳离子交换剂 ( 网状形式 )Amberlite 200C 或类似产品， 2)0.333V 强阴离子交换剂 ( 网状 形式 )Amberlite IRA-900 或类似产品， 3)0.333V 选自 Amberlite IRN-150L 的强阳离子交 换剂组分， 或者 0.333V 强阳离子交换剂 ( 凝胶形式 )Amberlyst 131 或类似产品。
在一种实施方式中， 在所述包含至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液与吸附材 料接触之前， 所述包含至少一种类型的天然钴胺素的第一溶液不用氰化物处理。
氰化物是有毒的化合物， 因此在优选的实施方式中不向所述第一溶液中添加氰化 物。在另一种优选的实施方式中， 在洗脱过程中也不使用氰化物。在更优选的实施方式中， 既不在第一溶液中也不在洗脱过程中使用氰化物。在最优选的实施方式中， 在本文描述的 所有过程中都不使用氰化物。
在一种实施方式中， 将浓缩溶液用作所述第一溶液， 由此将该浓缩溶液再经历一 次这种方法， 并且产生另一种浓度的溶液。
在另一方面， 本发明涉及本文所述的方法的应用。
在一种实施方式中， 本文所述的方法可以用于纯化和 / 或分离和 / 或浓缩至少一 种类型的钴胺素。
在进一步的方面， 本发明涉及一种包含至少一种天然钴胺素的浓缩溶液， 其中所
述浓缩溶液是通过本文其他地方所述的方法获得。
在优选的实施方式中， 该浓缩溶液包含以钴胺素总量计， 小于 25％的 CN- 钴胺素。 在更优选的实施方式中， CN- 钴胺素的含量小于 15％。在进一步优选的实施方式中， CN- 钴 胺素的含量小于 10％。在尤其更优选的实施方式中， CN- 钴胺素的含量小于 5％。在最优 选的实施方式中， CN- 钴胺素的含量基本为 0。
在另一方面， 本发明涉及本文其他地方所述的浓缩溶液的应用。
在优选的实施方式中， 所述浓缩溶液用于制备药物、 膳食补充剂和 / 或维生素制 剂。该浓缩溶液在掺入药物、 膳食补充剂和 / 或维生素制剂之前可被预处理。预处理可包 括纯化。
附图详细说明
图1： Cbl 的结构及其轴向配位位置。A)Cbl 的结构， 其中下面的轴向位置 (α) 被 Bzm 核苷酸碱基占据， 而上面的轴向位置 (β) 含有一活性基团 R。所有 Cbl 形式都能与 质子化羧基 R-COOH 产生氢键。B)H2O·Cbl 的配位模式。亲核配体 L 替代 β- 位的水。C) Ado·Cbl 和 Me·Cbl 的配位模式。Ado- 或 Me- 基团向钴离子强供电子， 使 Bzm 的配位不稳 定并且它可以在低 pH 值下解离。然后， 某些配体可以配位到下面的 β- 位置。D)CN·Cbl 中的轴向位置的保护阻止了外部配体的任何配位。 图2 ： 不同 pH 下 Cbl 与 CM-Sepharose 的结合。 A) 在低离子强度下结合 (10mM 缓冲 液、 磷酸盐、 醋酸盐、 Tris、 碳酸盐 )。 将 200μm H2O· Cbl 或 Ado· Cbl 的溶液与 CM-Sepharose 以 10 ∶ 1 的比例孵育 3min(22 ℃ )。将该样品离心， 用 1ml H2O 简单洗涤， 并且将结合 的 Cbl 在 pH 12， 0.2M 磷酸盐缓冲液中洗脱。对照对应结合对 ： H2O·Cbl+Sepharose 4B， CN· Cbl+CM-Sepharose。B) 在高离子强度下结合 (50mM 缓冲液 )。其他条件同 A 板。C) 用 NaOH 滴定 CM-Sepharose 悬浮液基质∶水＝ 1 ∶ 1。箭头指示用于 H2O·Cbl 结合的最佳条 件。
图3： Cbl 与 Amberlite Cobalamion 的结合。A) 在 pH3.5， I ≈ 0 M， 22℃下从溶液 中除去不同的钴胺素。将 400μM H2O·Cbl、 Ado·Cbl 和 CN·Cbl 的水样用树脂以液体∶ 树脂＝ 10 ∶ 1 的体积比孵育， 并且随时间监测游离 Cbl 的减少。最终比率 Cbl 游离 /Cbl 结合 对应 0.02(Ado·Cbl)， 0.03(H2O·Cbl) 和 0.5(CN·Cbl)。B) 在不同 pH 和离子强度下从溶 液中除去 H2O·Cbl(22℃ )。最终比率 Cbl 游离 /Cbl 结合对应 0.03(pH 5.5， I ≈ 0M)， 0.04(pH 3.5， I ≈ 0M) 和 0.2(pH 3.5， I ≈ 0.1M)。其他所有条件同 A 板。C) 从发酵液中结合 Cbl。 将提取物 (pH 3.7， 22℃， 用或未用氰化物处理 ) 用 Cobalamion 树脂以液体∶树脂＝ 10 ∶ 1 的比例分批孵育。在吸附 2h 和 5h 后测量结合的 Cbl， 同时将带有结合 Cbl 的树脂用 0.5M K3PO4， 5mM KCN 处理， 并测量洗脱的二氰基 -Cbl 的吸收情况 (ε579 ＝ 9900M-1cm-1)。从培养 液中吸附 2h 后， 将两个样品用 3×H2O， 1×20％ 2- 丁醇， 2×H2O( 所有情况均为液体∶树脂 ＝ 10 ∶ 1 的比率 ) 洗涤。通过测量用 0.1M K3PO4， 5mM KCN 过夜处理后的洗液的吸附光谱 -1 -1 (ε579 ＝ 9900M cm ) 来测量 Cbl 的浓度。
图4： 从发酵液中纯化 Cbl。A) 纯化程序的方案。所概括的方法在实施例 4 中进 一步说明。B) 在不同纯化步骤获得的产品的吸收光谱。测量前， 将样品用水稀释到 70-100 倍。洗脱的 CN· Cbl( 馏分 3) 的吸收光谱显示存在污染性化合物， 其在 UV(250-350nm) 和可 见光域 ( ＞ 350nm) 吸收光。以在可见域吸收为特征的污染物通常在馏分 7 中被除去。以
UV- 光吸收为特征的污染物在馏分 8 中被除去。最终的馏分 8 的光谱与商业得到的 CN· Cbl 的制剂 (Sigma) 一致。 实施例 本文所述的方法已针对原发酵液进行测试， 原发酵液是由 B12 生产商根据我们的 建议而制备。生物钴胺素在 pH 3.7 有效地吸附在不同的 COOH-Amberlites 上， 并且在存在 或不存在 KCN 下在 pH 10-12 洗脱。所得的产品在第一次分离步骤后已经具有较高的浓度 和纯度。
用 Amberlite Cobalamion 获得了最佳结果。证实， 这种树脂对生物形式的 Cbl 具 有高亲和力， 而工业形式的该维生素， 即 CN·Cbl， 与 Cobalamion 结合要弱得多。通过本发 明提出的方法成功地从粗细胞提取物中纯化了 Cbl， 该方法优于标准程序。
实施例 1 测试与 CM-Sepharose 的结合
最初的实验表明， 含有羧基 (R-COOH) 的 Amberlite 树脂可以通过咕啉环的侧链以 非特异性方式与钴胺素 ( 例如 CN·Cbl) 相互作用， 正如引言中所说。因此， 用含有 R-COOH 的基质 CM-Sepharose 来测试 COOH 基与 Cbl 的 α/β- 位的特异性轴向结合， 其中没有观察 到相互作用的副效应。由此， 对照试验揭示， CM-Sepharose 根本不与 CN· Cbl 结合 ( 图 2A、 B 的底部曲线 )。类似地， 碱性材料 Sepharose 4B( 不含羧基的基质 ) 不与 H2O·Cbl 相互
作用。这意味着， 天然钴胺素与 Sepharose 的结合， 如果有的话， 可能完全归因于它们与基 质的 COOH 基的特异性相互作用。
CM-Sepharose 在 pH 3-8 从溶液中吸附了显著量的 H2O·Cbl， 见图 2A 和 B， 上面 的曲线。辅因子形式 Ado·Cbl 与 CM-Sepharose 结合程度较低并且只在 pH ＜ 4 结合 ( 图 2A)。这些数据与图 1A 和 1B 中显示的预期结合机制一致。与高离子强度 (50mM 缓冲液， 图 2B) 相比， 在低离子强度下 (10mM 缓冲液， 图 2A) 吸附明显更好。 图 2C 中显示 CM-Sepharose 的悬浮液中 COOH 基的滴定 ( 基质∶水＝ 1 ∶ 1)。填装的基质中 COOH 基的总浓度估计为 100mM。需要进行至少三个 pK 的多次酸 - 碱平衡以符合滴定曲线 ： pK1 ＝ 3.0(30％ )， pK2 ＝ 4.6(48％ ) 和 pK3 ＝ 6.0(24％ )。 似乎当基质中同时存在去质子化和质子化基团 (R-COO- 和 R-COOH) 时， 可以实现 CM-Sepharose 与 H2O· Cbl/Ado· Cbl 之间最有效的相互作用 ( 图 2C)。 这一观察可能意味着一种比图 1B、 C 中显示的那些更加复杂的配位机制。例如， 一个 Cbl 分 子的结合中可能涉及若干羧基残基， 其中 Cbl 表面的氢键网络稳定了配体 - 基质的连接。
初步数据表明， 生物钴胺素与 CM-Sepharose 的结合比 CN· Cbl 的吸附要有效的多 ( 后者实际上不存在结合 )。由此， 将结合试验从软 Sepharose 基质延伸到适合工业应用的 硬树脂。
实施例 2 Cbl 与含有 COOH 基的不同 Amberlite 树脂的结合
Amberlite 是由珠子制成的强吸附剂， 能够耐受高压和腐蚀性介质。 实验中根据酸 性湿珠在量杯中占据的空间来测量吸附剂的体积。珠子之间的体积也包含在该数值中。测 试材料中活性元素是羧基 R-COOH， 在用水平衡这些珠子后得到 pH 3-4。该活性基团的浓度 相当于 2-3mol 每 1L 湿树脂。
初步试验中使用了三种改良的 COOH-Amberlite(Cobalamion、 IRC-76 和 IRC-50)， 从中选择最合适的吸附剂。当以液体∶树脂＝ 4 ∶ 1， pH 3.5， 22℃的比率在水中进行分批结合时， 珠子以下述速率系数与 H2O· Cbl 结合 ： 1.2min-1(Cobalamion)、 0.3min-1(IRC-76) 和 0.15min-1(IRC-50)。 用 Amberlite Cobalamion 获得了最佳结果， 因此使用这种结合材料继 续以下的工作。
将三种钴胺素 H2O·Cbl、 Ado·Cbl 和 CN·Cbl 的溶液 (400μM) 用 Cobalamion 以 液体∶树脂＝ 10 ∶ 1( 水， pH 3.5， 22℃ ) 的比率在不断混合下孵育。通过测量其吸收情 况， 随时间跟踪游离 Cbl 的浓度的下降 ( 图 3A)。所进行的实验证明， H2O·Cbl 和 Ado·Cbl 离开基质比 CN·Cbl 更快并且达到更高程度。该结果与先前用 CM-Sepharose 进行的试验 是一致的。用水洗涤饱和树脂还证明了一方 Ado·Cbl 和 H2O·Cbl 保留与另一方 CN·Cbl 保留之间的差异。由此， 在洗涤程序中观察到 CN· Cbl 从珠子明显的渗漏， 而其他两种配体 没有发现明显的释放。这意味着， 工业吸附剂 Amberlite Cobalamion 与天然形式的 Cbl 之 间的结合优于 CN-Cbl。
为了评估 Cbl 在不同 pH 下的结合， 将珠子在 pH 6.8， 1M 磷酸盐缓冲液中过夜孵 育， 然后用水彻底洗涤。 最后， 用水平衡树脂， 并且测得的 pH 为 5.5。 H2O· Cbl 与 Cobalamion 在 pH 5.5 的结合与在 pH 3.5 的吸附没有本质区别 ( 图 3B)。两个过程的相似速率可能表 明， 吸附的速率限制步骤是 H2O·Cbl 向树脂颗粒的扩散， 而不是 H2O·Cbl 与 COOH 基的相互 作用。盐的存在 (I ≈ 0.05M， pH 3.5) 降低了吸附效率 ( 图 3B)。
实施例 3 将 Cbl 从发酵液结合在 Amberlite Cobalamion 上
在对纯钴胺素的吸附进行初步实验之后， 对 B12 生产商提供的发酵液进行对比结 合分析。该溶液含有天然钴胺素或者经用氰化物处理制备的 CN· Cbl。在这两种情况下， 吸 附都是以液体∶树脂＝ 10 ∶ 1(pH 3.7， 22℃ ) 的比率分批进行。孵育 5 小时足以保证未用 或者已用氰化物处理的 Cbl 分别有约 95％和 60％的结合， 图 3C。二者结合过程相对较慢， 这可以通过树脂与细胞提取物的其他组分相结合造成的明显污染来解释。 Cobalamion 珠子 表面上的污染物的出现减缓 Cbl 穿过珠子孔隙渗透的速度， 并且使该过程受到速率限制。 然而， 根据最终的吸附水平来看发酵液中的天然钴胺素与 Cobalamion 的结合比 CN· Cbl 好 10-15 倍， 分别为 95％和 60％。
用几份的 H2O、 20％ 2- 丁醇、 H2O 洗涤 Cbl- 饱和树脂， 除去了主要量的杂质， 然而 也观察到从吸附剂渗漏了一些 Cbl( 图 3C)。对天然钴胺素来说配体的损失是可以忽略的， 然而 CN·Cbl 的渗漏占了结合配体的三分之一。
总的来说， 天然钴胺素通过 Cobalamion 保留要比 CN· Cbl 的保留更加有效。这使 得 1) 在较高的液体∶树脂比率下捕获配体以及 2) 彻底洗涤树脂， 而不损失 Cbl。 所以， Cbl 的制备可以获得更高的收率、 浓度和纯度。
实施例 4 从发酵液中纯化 Cbl
从 发 酵 液 中 进 行 Cbl 的 纯 化 模 型 ( 图 4A)。 第 一 纯 化 步 骤 是 天 然 钴 胺 素 在 Amberlite Cobalamion 树脂上的柱吸附。将柱子内部由珠子占据的空间 ( 包括珠子之间 的空隙 ) 指定为一个相对体积单位 (1V)。将发酵液 (pH 3.7， 20℃， 40V， Cbl ＝ 300μM) 以 2V/ 小时的流速加到 Cobalamion 柱上。在这一程序的最后约有 90％的 Cbl 被结合在树脂 上。被吸附的物质在室温下依次用水 (4V)， 20％ 2- 丁醇 (4V) 和水 (4V) 洗涤。可选地， 也 可能用温水 (50℃， 10V) 洗涤作为一种替换方式， 只是污染物去除效率较低。被吸附的 Cbl 的洗脱可以用高摩尔浓度的碱溶液在 3-4 个步骤内完成， 例如 1) 含有或不含 10mM KCN 的15％ NH4OH(4×1V， 每步骤 1 小时 ) 或 2) 含有或不含 10mM KCN 的 0.5M K3PO4(3×1V， 每步 骤 8 小时 )。洗脱后， 以 2V 的 1M HCl 洗涤再生树脂。
最佳洗脱剂的选择取决于以下的纯化方案。例如， 以 K3PO4 洗脱需要后续脱盐， 因 此不太方便。 洗脱剂中氰化物的存在使天然钴胺素转化成其氰基 - 和二氰基 - 形式， 它们是 典型的工业纯化的产物。在不存在 KCN 的情况下， 洗脱剂中 Cbl 的主要形式是 H2O· Cbl( 如 果没有使用避光 )。 避光的样品含有天然钴胺素的初始混合物。 在纯化程序中， 使用含 10mM KCN 的 15％ NH4OH 溶液。因为氰化物过量， 所以洗脱得到的钴胺素是它的二氰基形式。二 氰基 -Cbl 在以水、 中性缓冲液稀释， 或者在基质的酸化处理之后， 经历 CN· Cbl 的转化。根 据图 4B 中显示的稀释产品 CN·Cbl 的吸收光谱 ( 顶部曲线 3)， 在第一步骤之后就已经达 到了主要的纯化程度。光谱表明存在污染物， 其在紫外域 (250nm-350nm) 和可见波长 ( ＞ 350nm， 褐色物质 ) 范围内吸收光。显示 CN·Cbl 标准制品的吸收记录用于对比 ( 图 4B， 底 部曲线 )。根据下述程序除去检测到的杂质， 但其他方法也是可能的。
含有 10mM KCN 的 15％ NH4OH 中的 Cbl 样品在通风橱中在气流下于 65℃蒸发。添 加甲醇 (100％， 4V) 以溶解 CN·Cbl， 并且通过离心沉降不溶性棕色污染物。将甲醇在通风 橱中在气流下于 65℃蒸发， 并且将干燥的残留物溶解于水中。吸收光谱确认棕色污染物的 去除， 根据试验样品与标准 CN·Cbl 在 450-550nm( 图 4B， 曲线 7) 有更好的一致性。同时， 在 250nm-350nm 处的 UV 记录还证明存在污染性化合物。 这些杂质通过离子交换色谱法被除 去， 该离子交换色谱法用混合的 Amberlite 树脂 (1V) 进行， 其由相同体积的三种组分组成 ： 强阴离子交换剂 900( 网状形式， Cl )， 强阳离子交换剂 200( 网状形式， Na+) 以及 IRN-150L 的强阳离子交换剂组分 ( 凝胶形式， Na+)。也可以使用其他品牌的类似产品。色谱法是以 1V/h 的流速进行。在应用前后， 以 2V 的 5M NaCl 洗涤树脂。经过滤的溶液中不含 UV- 污 染物， 并且得到的 CN·Cbl 制品与标准 CN·Cbl 没有差异 ( 图 4B， 曲线 8 和标准 )。最终的 Cbl 制品相当于发酵液中初始钴胺素的 70％。
显示的纯化实例表明， 应用所述吸附方法从粗混合物中分离 Cbl 是可行的。