联苯化合物的结晶游离碱形式 技术领域 本发明涉及联苯化合物的新颖结晶形式， 预期其可用于治疗肺病症。本发明还涉 及包含所述结晶化合物或自所述化合物制备的医药组合物、 用于制备所述结晶化合物的方 法和中间体和使用所述化合物治疗肺病症的方法。
背景技术 颁予马门 (Mammen) 等人的美国专利公开案第 2005/0203133 号揭示预期用于治疗 肺病症 ( 例如慢性阻塞性肺病 (COPD) 和哮喘 ) 的新颖联苯化合物。具体来说， 化合物联 苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯在本申请案中具体阐述为具有毒蕈碱受体拮抗剂或抗胆碱能活性。
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基 氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的化学结构由式 I 表示 ：
使用市售自动命名软件 (AutoNom software)(MDL， 圣莱昂纳多 (San Leandro)， 加 利福尼亚 (California)) 命名式 I 化合物。
可用于治疗肺或呼吸病症的治疗剂有利地通过吸入直接投与呼吸道中。 就这点来 说， 已研发出数种类型的医药吸入装置以供通过吸入投与治疗剂， 包括干粉吸入器 (DPI)、 定量式吸入器 (MDI) 和雾化罐吸入器。当制备用于所述装置中的医药组合物和调配物时， 高度期望治疗剂具有既非吸湿性也非潮解性晶形且其具有相对高熔点， 由此允许所述物质 被微粉化而不显着分解。尽管式 I 化合物的结晶游离碱形式已在颁予埃克斯特 (Axt) 等人 的美国专利公开案第 2007/0112027 号中报告为形式 I 和形式 II， 但本发明的结晶游离碱形 式具有不同且尤其有用的性质， 包括较高熔点。
发明内容 本发明的一个方面涉及联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基 甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱形式， 其特征在于粉末 x 射线衍射图案在 6.6±0.1、 13.1±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1 和 20.2±0.1 的 2θ 值处包 含衍射峰。
本发明的另一方面涉及联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基 甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱， 其命名为形式 III， 其特征 在于粉末 x 射线衍射图案在 6.6±0.1、 13.1±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1 和 20.2±0.1 的
2θ 值处包含衍射峰 ； 且特征进一步在于在选自以下的 2θ 值处具有另外五个或五个以上 衍射峰： 8.8±0.1、 10.1±0.1、 11.4±0.1、 11.6±0.1、 14.8±0.1、 15.2±0.1、 16.1±0.1、 16.4±0.1 、 16.9±0.1 、 17.5±0.1 、 18.2±0.1 、 19.3±0.1 、 19.9±0.1 、 20.8±0.1 、 21.1±0.1、 21.7±0.1 和 22.3±0.1。
本发明的又一方面涉及联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基 甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱， 其命名为形式 IV， 其特征 在于粉末 x 射线衍射图案在 6.6±0.1、 13.1±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1 和 20.2±0.1 的 2θ 值处包含衍射峰 ； 且特征进一步在于在选自以下的 2θ 值处具有另外五个或五个以上 衍射峰 ： 10.6±0.1、 15.0±0.1、 16.0±0.1、 17.3±0.1、 17.7±0.1、 20.9±0.1、 21.4±0.1、 22.6±0.1、 24.6±0.1 和 27.8±0.1。
本发明的另一方面涉及包含本发明结晶游离碱和医药上可接受的载剂的医药组 合物。 本发明的再一方面涉及包含本发明结晶游离碱与一种或一种以上治疗剂组合的医药 组合物。因此， 在一个实施例中， 本发明涉及包含以下的医药组合物 ： (a) 医药上可接受的 载剂和治疗有效量的本发明结晶游离碱 ； 和 (b) 治疗有效量的选自以下的药剂 ： 类固醇消 炎剂， 例如皮质类固醇 ； β2 肾上腺素能受体激动剂 ； 磷酸二酯酶 -4 抑制剂 ； 或其组合 ； 其中 结晶游离碱和药剂一起或分开调配。 当所述药剂分开调配时， 可包括医药上可接受的载剂。 通常， 本发明结晶游离碱和所述药剂将以治疗有效量存在。 本发明的另一方面涉及医药组合物， 其包含含有本发明结晶游离碱的水性等渗盐 水溶液， 其中所述溶液的 pH 在约 4 到 6 范围内。在一特定实施例中， 用柠檬酸盐缓冲液将 水性雾化罐调配物缓冲到约 5 的 pH。
在一个实施例中， 本发明涉及药物递送装置， 其包含含有医药组合物的干粉吸入 器， 所述医药组合物包含医药上可接受的载剂和本发明结晶游离碱。
式 I 化合物具有毒蕈碱受体拮抗剂活性。 因此， 预期式 I 化合物的结晶游离碱具有 相同活性， 并且因此发现可用于治疗肺病症 ( 例如哮喘和慢性阻塞性肺病 )。因此， 本发明 的另一方面涉及治疗肺病症的方法， 其包含向患者投与治疗有效量的本发明结晶游离碱。 本发明的又一方面涉及引起患者支气管扩张的方法， 其包含向所述患者投与可引起支气管 扩张的量的本发明结晶游离碱。在一个实施例中， 通过吸入投与化合物。本发明还提供治 疗慢性阻塞性肺病或哮喘的方法， 其包含向患者投与治疗有效量的本发明结晶游离碱。本 发明的另一方面涉及在哺乳动物中拮抗毒蕈碱受体的方法， 其包含向哺乳动物投与治疗有 效量的本发明结晶游离碱。
本发明还涉及用于制备式 I 化合物的结晶游离碱形式的方法。本发明还提供纯化 式 I 化合物的方法， 其包含形成联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲 基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱。本发明进一步涉及通过本 文所述方法制备的产物。
本发明还涉及呈微粉化形式的式 I 化合物的结晶游离碱 ； 和包含医药上可接受的 载剂和本发明微粉化结晶游离碱的医药组合物。
本发明还涉及式 I 化合物的结晶游离碱形式， 其用于疗法中或用作药剂。另外， 本 发明涉及本发明结晶游离碱的用途， 其用于制造药剂、 尤其用于制造用于在哺乳动物中治 疗肺病症或拮抗毒蕈碱受体的药剂。
附图说明 参照附图来阐明本发明的各个方面。
图 1 显示联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰 基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯 ( 式 I 化合物 ) 的结晶游离碱的形式 III 的粉末 x 射 线衍射 (PXRD) 图案。形式 III 的其它特征展现于图 4( 其显示差示扫描量热法 (DSC) 热分 析图 ) 和图 6( 其显示热重分析 (TGA) 迹线 ) 中。
图 2 显示式 I 化合物的结晶游离碱的形式 IV 的 PXRD 图案。图 3 显示形式 III 和 形式 IV 的 PXRD 图案的重叠。形式 IV 的其它特征展现于图 5( 其显示 DSC 热分析图 ) 和图 7( 其显示 TGA 迹线 ) 中。
具体实施方式
本发明提供联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲 酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯 ( 式 I) 的结晶游离碱形式。令人感到惊奇的是， 发 现本发明的结晶游离碱形式即使在暴露于大气水分时也不具有潮解性。另外， 本发明的结 晶游离碱形式具有可接受程度的吸湿性和可接受的熔点。例如， 结晶游离碱形式 III 的熔 点为约 125℃且结晶游离碱形式 IV 的熔点为约 119℃。
在其它用途中， 本发明的结晶游离碱形式可用于制备预期可用于治疗肺病症的医 药组合物。因此， 本发明的一个方面涉及包含医药上可接受的载剂和治疗有效量的本发明 结晶游离碱的医药组合物。
定义
当描述本发明化合物、 组合物、 方法和工艺时， 除非另有说明， 否则下述术语具有 以下含义。 另外， 除非所用上下文明确表示其它含义， 否则如本文所用单数形式 “一 (a， an)” 和 “所述 (the)” 包括相应的复数形式。术语 “包含 (comprising)” 、 “包括 (including)” 和 “具有 (having)” 打算为包括性， 并且意指除所列举要素外可存在其它要素。除非另有说 明， 否则本文所用所有表示成份数量、 性质 ( 例如， 分子量 )、 反应条件等的数字在所有情况 下均应理解为受术语 “约” 修饰。因此， 本文所述数字是可根据本发明拟寻求获得的期望性 质而变化的近似值。最低限度地且并非试图将等效教义的应用限制于权利要求书的范围， 至少应根据所报告有效数字且通过运用一般舍入技术来诠释每一数字。
形式 III 和形式 IV 二者均为无水游离碱晶体多晶形。在提及 “本发明结晶游离 碱” 时， 应理解， 所述术语包括形式 III 和形式 IV。
如本文所用短语 “具有式” 或 “具有结构” 并不打算加以限制且是以与通常使用术 语 “包含” 相同的方式来使用。
术语 “医药上可接受” 是指在用于本发明时并非为生物学或其它方面不可接受的 材料。例如， 术语 “医药上可接受的载剂” 是指可纳入组合物中并投与患者而不会造成不可 接受生物学效应或以不可接受方式与所述组合物的其它组份相互作用的材料。 所述医药上 可接受的材料通常符合毒理学和制造测试所要求的标准， 且包含那些由美国食品与药品管 理局 (U.S.Food and Drug Administration) 确定为适宜非活性成份的材料。
术语 “治疗有效量” 意指在向有需要患者投与时足以实现治疗的量， 即， 获得期望治疗效果所需药物的量。例如， 用于治疗肺病症的治疗有效量是 ( 例如 ) 减少、 抑制、 消除 或防止哮喘或慢性阻塞性肺病 (“COPD” ) 的症状或治疗哮喘或 COPD 潜在病因所需化合物 的量。在一个实施例中， 治疗有效量的是引起支气管扩张所需的量。另一方面， 术语 “有效 量” 意指足以获得期望结果的量， 所述期望结果可能不一定是治疗结果。例如， 当研究包含 毒蕈碱受体的系统时， “有效量” 可为拮抗所述受体所需量。
如本文所用术语 “治疗 (treating 或 treatment)” 意指患者 ( 例如哺乳动物 ( 尤 其为人类 )) 的疾病或医学病况 ( 例如 COPD) 的治疗 (treating 或 treatment)， 其包括 ： (a) 防止所述疾病或医学病况发生， 即， 患者的预防性治疗 ； (b) 改善所述疾病或医学病况， 例如， 通过消除患者的所述疾病或医学病况或使其消退 ； (c) 抑制所述疾病或医学病况， 例 如， 通过减缓或阻止患者的所述疾病或医学病状的发展 ； 或 (d) 减轻患者的所述疾病或医 学病况的症状。例如， 术语 “治疗 COPD” 包括防止 COPD 发生、 改善 COPD、 抑制 COPD 和减轻 COPD 的症状。术语 “患者” 打算包括那些需要治疗或防止疾病或者目前正在接受具体疾病 或医学病况的疾病防止或治疗的哺乳动物， 例如人类。术语 “患者” 还包括其中评估本发明 化合物的测试个体或用于分析的测试个体， 例如， 动物模型。
合成 本发明的结晶游离碱可从可容易获得的起始材料按照下文和各实例中所述来合 成。 尽管可存在若干种可用于制造每一结晶游离碱形式的方法， 然而应注意， 结晶内容物以 及晶体习惯 ( 大小和形状 ) 可部分基于制备方法以及溶剂组成而所有变化。
应了解， 尽管给出具体工艺条件 ( 即， 结晶温度、 时间、 反应物的摩尔比、 溶剂、 压 力等 )， 但除非另有说明， 否则也可使用其它工艺条件。在一些情况下， 在室温下实施反应 或结晶且不实施实际温度测量。应理解， 室温可视为意指在实验室环境中属于通常与环境 温度有关的范围内的温度且通常可在约 25℃到约 50℃范围内。在其它情况下， 在室温下实 施反应或结晶且实际上测量并记录温度。所有重量、 体积和等效物均是相对于起始材料联 苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯 ( 或盐形式 )。
通常， 在适宜惰性稀释剂或溶剂系统中实施结晶， 所述惰性稀释剂或溶剂系统的 实例包括 ( 但不限于 ) 甲醇、 乙醇、 异丙醇、 异丁醇、 乙酸乙酯、 乙腈、 二氯甲烷、 甲基第三丁 基醚和其类似物和其混合物。在任何上述结晶完成后， 可通过例如沉淀、 浓缩、 离心和类似 方法的任何常规方式从反应混合物分离所述结晶化合物。
本发明中采用的联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯以及其盐 ( 例如二磷酸盐 ) 可容易地从市售起 始材料和试剂使用实例中所述程序或使用以下中所述程序制备 ： 颁予马门等人的美国专利 公开案第 2005/0203133 和颁予埃克斯特等人的美国专利公开案第 2007/0112027 号。
在本发明方法中所述的摩尔比可通过所属领域技术人员可利用的各种方法来容 易地测定。例如， 可通过 1H NMR 容易地测定所述摩尔比。或者， 可使用元素分析和 HPLC 方 法来测定摩尔比。
形式 III
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基 - 哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲 基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的形式 III 结晶游离碱可从酯或酯的二磷酸盐制得。
在 一 个 实 施 例 中， 形 式 III 结 晶 游 离 碱 是 通 过 使 联 苯 -2- 基 氨 基 甲 酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ]- 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯与 乙腈接触而制得。通常， 酯的毫克数与乙腈的总毫升数的比率是约 100 ∶ 1， 其中在两个步 骤中添加乙腈。通常， 在 0℃至 40℃温度范围内重复循环的同时实施此反应。然后通过真 空过滤分离固体并进行干燥。
在另一实施例中， 形式 III 结晶游离碱是使用形式 III 结晶游离碱的晶种和酯的 二磷酸盐而制得。此方法包括 ： a) 形成结晶游离碱形式 III 的晶种 ； b) 将联苯 -2- 基氨基 甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基 酯的二磷酸盐溶解于乙酸异丙酯和水中以形成溶液 ； c) 和向所述溶液中添加所述晶种。更 具体来说， 在 20±3℃和氮气下将酯的二磷酸盐 (1wt) 在乙酸异丙酯 (17.5 体积 ) 和水 (10 体积 ) 中制成浆液。将悬浮液升温到 53±3℃并添加 10M NaOH(0.5 体积 )。将混合物在所 述温度下搅拌短时间， 然后分离各层并移除基本水层。 向有机层中添加水 (5 体积 ) 并搅拌。 分离各层并移除水层。添加乙酸异丙酯 (17.5 体积 ) 并通过常压蒸馏收集约 10 体积馏出 物。 再利用乙酸异丙酯 (10 体积 ) 重复此步骤。 在第二次蒸馏后， 将澄清溶液的温度降低到 53±3℃， 然后用结晶游离碱形式 III(0.005wt ； 0.5wt％ ) 存于乙酸异丙酯 (0.08 体积 ) 中 的悬浮液引晶。将所得悬浮液于 53±3℃下搅拌至少 2 小时， 然后以 0.19℃ /min 的近似冷 却速率冷却到 10±3℃。将悬浮液于 10±3℃下搅拌至少 2 小时且然后通过过滤收集。用 乙酸异丙酯 (2x 3 体积 ) 洗涤所得滤饼且然后干燥产物以产生形式 III 结晶游离碱。 形式 IV
在一个实施例中， 形式 IV 结晶游离碱是使用形式 III 结晶游离碱的晶种制得。此 方法包括 ： a) 形成结晶游离碱形式 III 的晶种 ； b) 将结晶游离碱形式 III 溶解于乙腈中以 形成溶液 ； c) 和向所述溶液中添加所述晶种。通常， 晶种与酯的重量比在约 2 ∶ 250 范围 内。通常， 结晶游离碱形式 III 的克数与乙腈的总毫升数的比率在约 2 ∶ 10 到 3 ∶ 30 范 围内， 其中 2.5 ∶ 16 是一个范围。通常以若干等份添加乙腈。通常， 在 0℃至 40℃温度范 围内重复循环的同时实施此反应。然后通过真空过滤分离固体并进行干燥。
结晶性质
如在粉末 x 射线衍射领域中所熟知， 粉末 x 射线衍射 (PXRD) 谱的相对峰高度取决 于与试样制备和仪器几何学有关的许多因素， 而峰位置对实验细节相对不敏感。如实例 5 中所述获得结晶游离碱形式 III 和形式 IV 的 PXRD 图案。因此， 在一个实施例中， 本发明结 晶化合物的特征在于 PXRD 图案具有某些峰位置。
本发明的每一结晶游离碱形式均呈现不同 PXRD 图案， 但具有某些共有峰。因此， 在一个实施例中， 本发明涉及联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲 基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱形式， 其特征在于粉末 x 射 线衍射图案在选自 6.6±0.1、 13.1±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1 和 20.2±0.1 的 2θ 值处 包含衍射峰。
在 一 个 实 施 例 中， 结 晶 游 离 碱 形 式 III 的 特 征 在 于 粉 末 x 射 线 衍 射 图 案 在 6.6±0.1、 13.1±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1 和 20.2±0.1 的 2θ 值 处 包 含 衍 射 峰 ； 且 特征进一步在于在选自以下的 2θ 值处具有另外五个或五个以上衍射峰 ： 8.8±0.1、 10.1±0.1 、 11.4±0.1 、 11.6±0.1 、 14.8±0.1 、 15.2±0.1 、 16.1±0.1 、 16.4±0.1 、
16.9±0.1 、 17.5±0.1 、 18.2±0.1 、 19.3±0.1 、 19.9±0.1 、 20.8±0.1 、 21.1±0.1 、 21.7±0.1 和 22.3±0.1。在另一实施例中， 结晶游离碱形式 III 的特征在于粉末 x 射线 衍 射 在 选 自 以 下 的 2θ 值 处 包 含 衍 射 峰 ： 6.6±0.1、 11.4±0.1、 13.1±0.1、 16.1±0.1、 17.5±0.1 、 18.2±0.1 、 18.6±0.1 、 19.3±0.1 、 19.7±0.1 、 19.9±0.1 、 20.2±0.1 、 20.8±0.1、 21.1±0.1、 21.7±0.1 和 22.3±0.1。在又一实施例中， 结晶游离碱形式 III 的 特征在于各峰位置实质上是与图 1 中所示峰位置一致的 PXRD 图案。
在 一 个 实 施 例 中， 结 晶 游 离 碱 形 式 IV 的 特 征 在 于 粉 末 x 射 线 衍 射 图 案 在 6.6±0.1、 13.1±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1 和 20.2±0.1 的 2θ 值 处 包 含 衍 射 峰 ； 且 特征进一步在于在选自以下的 2θ 值处具有另外五个或五个以上衍射峰 ： 10.6±0.1、 15.0±0.1 、 16.0±0.1 、 17.3±0.1 、 17.7±0.1 、 20.9±0.1 、 21.4±0.1 、 22.6±0.1 、 24.6±0.1 和 27.8±0.1。在另一实施例中， 结晶游离碱形式 IV 的特征在于粉末 x 射线衍 射图案在选自以下的 2θ 值处包含衍射峰 ： 6.6±0.1、 13.1±0.1、 15.0±0.1、 17.3±0.1、 17.7±0.1、 18.6±0.1、 19.7±0.1、 20.2±0.1、 20.9±0.1、 21.4±0.1 和 22.6±0.1。在又 一实施例中， 结晶游离碱形式 IV 的特征在于各峰位置实质上是与图 2 中所示峰位置一致的 PXRD 图案。 在又一实施例中， 本发明结晶游离碱的特征在于差示扫描量热法 (DSC) 热分析 图。如实例 6 中所述获得 DSC 热分析图。本文中报告的熔点是基于 DSC 分析期间记录的 熔融起点来估算。因此， 在一个实施例中， 本发明结晶化合物的特征在于其 DSC 温度记录 图。在一个实施例中， 结晶游离碱形式 III 的特征在于 DSC 温度记录图显示吸热热流的起 点在约 123℃处且熔点为约 125℃， 如图 4 中所见。在另一实施例中， 结晶游离碱形式 IV 的 特征在于 DSC 温度记录图显示吸热热流的一个起点在约 66℃处， 吸热热流的第二起点在约 119℃处， 且熔点为约 119℃， 如图 5 中所见。
如实例 6 中所述对本发明的结晶游离碱形式执行热重分析 (TGA)。 因此， 在一个实 施例中， 结晶游离碱的特征在于其 TGA 迹线。在一个实施例中， 结晶游离碱形式 III 的特征 在于图 6 中绘示的 TGA 迹线。在另一实施例中， 结晶游离碱形式 IV 的特征在于图 7 中绘示 的 TGA 迹线。
如实例 7 中所述对本发明的结晶游离碱形式执行重量蒸气吸附 (GVS) 评定。已证 实本发明的结晶游离碱形式具有可逆吸附 / 解吸特征与可接受程度的吸湿性。例如， 结晶 游离碱形式 III 显示于 25℃下介于 0 与 90％相对湿度之间具有＜ 2％ wt/wt 的可逆吸水 性。另外， 已发现结晶游离碱形式 III 在暴露于高温和湿度时稳定。
在下文实例中进一步阐释本发明结晶游离碱形式的这些性质。
效用
式 I 化合物具有毒蕈碱受体拮抗剂活性， 且因此， 预期式 I 化合物的结晶游离碱形 式可用于治疗由毒蕈碱受体调介的医学病况， 即通过用毒蕈碱受体拮抗剂治疗得以改善的 医学病况。所述医学病况包括 ( 例如 ) 肺病症或疾病， 包括那些与可逆气道阻塞相关者， 例如慢性阻塞性肺疾病 ( 例如慢性和喘息性支气管炎和气肿 )、 哮喘、 肺纤维化、 过敏性鼻 炎、 鼻漏和类似病况。可用毒蕈碱受体拮抗剂治疗的其它医学病况是生殖泌尿道病症， 例 如膀胱过动症或逼尿肌过度活动和其症状 ； 胃肠道病症， 例如肠易激综合征、 憩室病、 失弛 缓症、 胃肠运动过度病症和腹泻 ； 心律不齐， 例如窦性心动过缓 ； 帕金森氏病 (Parkinson’ s
disease) ； 认知障碍， 例如阿兹海默氏症 (Alzheimer’ s disease) ； 痛经 ； 和类似病况。
因此， 在一个实施例中， 本发明涉及用于治疗肺病症的方法， 所述方法包含向患者 投与治疗有效量的联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰 基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱。本发明结晶游离碱在用于治疗肺病症 时通常将通过吸入以每天多个剂量、 每日单一剂量或每周单一剂量投与。 一般来说， 治疗肺 病的剂量将在约 10μg/ 天到 200μg/ 天范围内。
当通过吸入投与时， 本发明结晶游离碱通常将具有引起支气管扩张的效应。 因此， 在另一实施例中， 本发明涉及在患者中引起支气管扩张的方法， 所述方法包含向患者投与 可引起支气管扩张的量的联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱。通常， 引起支气管扩张的治疗 有效剂量在约 10μg/ 天至 200μg/ 天范围内。
在一个实施例中， 本发明涉及治疗慢性阻塞性肺病或哮喘的方法， 所述方法包含 向患者投与治疗有效量的联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱。本发明结晶游离碱在用于治疗 COPD 或哮喘时通常将通过吸入以每天多个剂量或每日单一剂量投与。一般来说， 治疗 COPD 或哮喘的剂量将在约 10μg/ 天到 200μg/ 天范围内。如本文所用 COPD 包括慢性阻塞性 支气管炎和肺气肿 ( 例如， 参见伯纳斯 (Barnes)， 慢性阻塞性肺病 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease)， 新 英 格 兰 医 学 期 刊 (New England Journal of Medicine)343 ： 269-78(2000))。
本发明结晶游离碱在用于治疗肺病症时任选地与其它治疗剂组合投与。因此， 在 一特定实施例中， 本发明的医药组合物和方法进一步包含治疗有效量的 β2- 肾上腺素受体 激动剂、 皮质类固醇、 非类固醇消炎剂或其组合。
在另一实施例中， 本发明结晶游离碱用于拮抗生物系统和哺乳动物 ( 具体来说， 例如小鼠、 大鼠、 豚鼠、 兔、 狗、 猪、 人类等 ) 中的毒蕈碱受体。在此实施例中， 向哺乳动物投 与治疗有效量的本发明结晶游离碱。如果需要， 随后可使用常规程序和设备测定拮抗毒蕈 碱受体的效应。
本发明结晶游离碱的性质和效用 ( 例如毒蕈碱受体拮抗活性 ) 可使用所属领域技 术人员熟知的各种活体外和活体内分析来展示。例如， 代表性分析进一步详细阐述于下列 实例中且包括 ( 举例说明但非加以限制 ) 测量 hM1、 hM2、 hM3、 hM4 和 hM5 毒蕈碱受体结合的 分析 ( 例如， 如分析 1 中所述 )。测定本发明结晶游离碱的毒蕈碱受体拮抗活性的可用功 能分析包括 ( 举例说明但非加以限制 ) 测量以下的分析 ： 配体调介的细胞内环腺苷单磷酸 (cAMP) 的变化、 配体调介的腺苷酸环化酶 ( 其合成 cAMP) 的活性变化、 在通过受体催化交 35 35 换鸟苷 5’ -O-(γ- 硫基 ) 三磷酸 ([ S]GTPγS) 与 GDP 来将 [ S]GTPγS 纳入隔离膜中配 体调介的变化、 配体调介的细胞内游离钙离子的变化 ( 例如， 用来自分子装置 (Molecular Devices) 公司的荧光联合成像板读数器或 FLIPR 测量 ) 和类似情况。实例性分析阐述于 分析 2 中。预期在上文所列任一分析或类似性质的分析中结晶游离碱均可拮抗或降低毒蕈 碱受体的活化， 并且通常以约 0.1-100 纳摩尔的浓度用于这些研究中。因此， 上述分析可用 于测定本发明结晶游离碱的治疗效用， 例如支气管扩张活性。
本发明结晶游离碱的其它性质和效用可使用所属领域的技术人员熟知的多种活体外和活体内分析来展示。例如， 可在例如艾因托芬 (Einthoven) 模型的动物模型中测 量结晶游离碱的活体内效能。简单来说， 在经麻醉动物 ( 艾因托芬模型 ) 中评估结晶游离 碱的支气管扩张活性， 其中使用换气压力作为气道阻力的替代量度。例如， 参见艾因托芬 (1892)Pfugers Arch.51 ： 367-445 ； 和默罕默德 (Mohammed) 等人 (2000) 肺脏药理学与治疗 学 (Pulm Pharmacol Ther.)13(6) ： 287-92， 以及阐述大鼠艾因托芬模型的分析 3。另一可 用活体内分析是大鼠止涎分析 ( 例如， 如分析 4 中所述 )。
医药组合物和调配物
本发明的结晶游离碱通常是以医药组合物或调配物的形式投与患者。 所述医药组 合物可通过任何可接受的投与途径投与患者， 包括 ( 但不限于 ) 吸入、 经口、 经鼻、 局部 ( 包 括经皮 ) 和非经肠投与模式。然而， 所属领域技术人员应了解， 本发明的结晶游离碱一旦调 配， 其即可不再呈结晶型， 即， 结晶游离碱可溶解于适宜载剂中。
因此， 在一个实施例中， 本发明涉及包含医药上可接受的载剂或赋形剂和联 苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱的医药组合物。如果需要， 那么所述医药组合物可含有其它治 疗剂和 / 或调配剂。 本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的作为活性药剂的联苯 -2- 基氨基甲 酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯 的结晶游离碱。通常， 所述医药组合物应包含约 0.01 重量％到约 95 重量％的活性药剂 ； 包 括约 0.01 重量％到约 30 重量％ ； 例如约 0.01 重量％到约 10 重量％的活性药剂。
任何常规载剂或赋形剂均可用于本发明的医药组合物中。具体载剂或赋形剂， 或 载剂或赋形剂的组合的选择将取决于正用于治疗特定患者的投与模式或医学病况的类型 或疾病状态。就这点来说， 用于特定投与模式的适宜医药组合物的制备同样在熟悉制药技 术者的范围内。另外， 用于所述组合物的成份可购自 ( 例如 ) 西格玛 (Sigma)， 邮政信箱 (P.O.Box)14508， 圣路易斯 (St.Louis)， MO 63178。出于进一步阐释的目的， 常规调配技术 阐述于雷鸣登 (Remington) ： 药物科学与实践 (The Science and Practice of Pharmacy)， 第 20 版， 利 平 科 特 威 廉 姆 斯 与 怀 特 公 司 (Lippincott Williams & White)， 巴尔的摩 (Baltimore)， 马里兰 (Maryland)(2000) ； 和 H.C. 安塞尔 (H.C.Ansel) 等人， 医药剂型与药 物递送系统 (Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)， 第 7 版， 利平 科特威廉姆斯与怀特公司， 巴尔的摩， 马里兰 (1999) 中。
可用作医药上可接受的载剂的材料的代表性实例包括 ( 但不限于 ) 下述物质 ： 糖， 例如乳糖、 葡萄糖和蔗糖 ； 淀粉， 例如玉米淀粉和马铃薯淀粉 ； 纤维素和其衍生物， 例如 羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素和乙酸纤维素 ； 粉状黄芪胶 ； 麦芽 ； 明胶 ； 滑石粉 ； 赋形剂， 例 如可可油和栓剂蜡 ； 油， 例如花生油、 棉籽油、 红花油、 芝麻油、 橄榄油、 玉米油和大豆油 ； 二 醇， 例如丙二醇 ； 多元醇， 例如甘油、 山梨醇、 甘露醇和聚乙二醇 ； 酯， 例如油酸乙酯和月桂 酸乙酯 ； 琼脂 ； 缓冲剂， 例如氢氧化镁和氢氧化铝 ； 海藻酸 ； 无致热源的水 ； 等渗盐水 ； 林格 氏溶液 (Ringer’ s solution) ； 乙醇 ； 磷酸盐缓冲溶液 ； 压缩的推进剂气体， 例如氯氟碳化 合物和氢氟碳化合物 ； 和其它用于医药组合物中的无毒相容性物质。
本发明医药组合物通常是通过将结晶游离碱与医药上可接受的载剂和一种或一 种以上任选成份彻底和充分地混合或掺合来制备。必要或需要时， 之后可使用常规程序和
设备将所得均匀掺合的混合物制成片剂、 胶囊、 丸剂等或装填到药罐、 药筒、 分配器等之中。
在一个实施例中， 本发明医药组合物适用于吸入投与。适用于吸入投与的医药组 合物通常可呈气溶胶或粉末形式。所述组合物一般是使用众所周知的递送装置来投与， 例 如雾化吸入器、 定量式吸入器 (MDI)、 干粉吸入器 (DPI) 或类似递送装置。
在本发明的一具体实施例中， 使用雾化吸入器通过吸入来投与包含活性药剂的医 药组合物。所述雾化器装置通常产生高速空气流， 其使包含活性药剂的医药组合物以雾气 形式被喷雾输送到患者的呼吸道中。 因此， 当经调配用于雾化吸入器中时， 通常将结晶游离 碱活性药剂溶解于适宜载剂中以形成溶液。 适宜雾化器装置包括 Respimat Soft MistTM 吸 入器 ( 德国勃林格殷格翰制药公司 (Boehringer Ingelheim))、 AERx 肺部递送系统 ( 阿拉 迪姆公司 (Aradigm Corp.)) 和百瑞 LC 普乐士可重复使用雾化器 (PARI LC Plus Reusable Nebulizer)( 德国百瑞有限责任公司 (Pari GmbH))。
可用于雾化吸入器中的代表性医药组合物包含等渗水性溶液， 其包含约 0.05μg/ ml 到约 10mg/mL 的本发明结晶游离碱。在一个实施例中， 水性雾化器调配物等渗。在一 个实施例中， 所述溶液的 pH 值为约 4-6。在一特定实施例中， 用柠檬酸盐缓冲液将水性雾 化器调配物缓冲到约 5 的 pH 值。在另一特定实施例中， 水性调配物含有约 0.1mg/mL 到约 1.0mg/mL 的联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲 基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的游离碱等效物。 在本发明的另一具体实施例中， 包含治疗药剂的医药组合物是使用 DPI 通过吸入 来投与。所述 DPI 通常以自由流动性粉剂形式投与活性药剂， 所述粉剂在吸气期间分散于 患者的气流中。为获得自由流动性粉剂， 通常将结晶游离碱活性药剂与适宜赋形剂一起调 配， 例如乳糖、 淀粉、 甘露醇、 右旋糖、 聚乳酸、 聚交酯 - 共 - 乙交酯和其组合。微粉化是将晶 体大小减小到适于经肺递送的大小的普通方法。通常， 将结晶游离碱活性药剂微粉化并与 适宜载剂组合形成可吸入大小的微粉化颗粒的悬浮液， 其中 “微粉化颗粒” 或 “微粉化形式” 意指至少约 90％颗粒具有小于约 10μm 的直径。 还可使用其它减小粒径的方法， 例如， 精细 研磨、 短切、 磨碎、 研磨、 筛选、 研制、 粉碎等， 只要可获得期望粒径即可。
用于 DPI 中的代表性医药组合物包含粒径介于约 1μm 与约 100μm 之间的干燥乳 糖和本发明结晶游离碱的微粉化颗粒。所述干粉调配物可 ( 例如 ) 通过将乳糖与结晶游离 碱活性药剂组合且然后干掺合各组份来制造。 或者， 如果需要， 可在不使用赋形剂的情况下 调配结晶游离碱活性药剂。 然后， 通常将医药组合物装填到干粉分配器中， 或装填到吸入药 筒或胶囊中以供与干粉递送装置一起使用。
DPI 递 送 装 置 的 实 例 包 括 碟 式 吸 入 器 (Diskhaler)( 葛 兰 素 史 克 (GlaxoSmithKline)， 三角研究园 (Research Triangle Park)， NC ； 例如， 参见颁予纽厄尔 (Newell) 等人的美国专利第 5,035,237 号 ) ； 迪斯科斯 (Diskus)( 葛兰素史克 ； 例如， 参见 颁予戴维斯 (Davies) 等人的美国专利第 6,378,519 号 ) ； 涡轮吸入器 (Turbuhaler)( 阿斯 利康 (AstraZeneca)， 威耳明顿 (Wilmington)， DE ； 例如， 参见颁予维特林 (Wetterlin) 的 美国专利第 4,524,769 号 ) ； 旋转吸入器 (Rotahaler)( 葛兰素史克 ； 例如， 参见颁予霍尔沃 思 (Hallworth) 等人的美国专利第 4,353,365 号 ) 和便利型吸入器 (Handihaler)( 勃林格 殷格翰 (Boehringer Ingelheim))。适宜 DPI 装置的其它实例阐述于颁予卡斯帕 (Casper) 等人的美国专利第 5,415,162 号、 颁予埃文斯 (Evans) 等人的美国专利第 5,239,993 号和
颁予阿姆斯壮 (Armstrong) 等人的美国专利第 5,715,810 号和其中引用的参考文献中。上 述专利的揭示内容的全文以引用方式并入本文中。
在本发明的又一具体实施例中， 使用 MDI 通过吸入投与包含结晶游离碱活性药剂 的医药组合物， 所述 MDI 通常使用压缩的推进剂气体排放出测定量的活性药剂。因此， 使用 MDI 投与的医药组合物通常包含结晶游离碱活性药剂存于液化推进剂中的溶液或悬浮液。 可采用任何适宜液化推进剂， 包括氯氟烃类 ( 例如 CCl3F) 和氢氟烷类 (HFA)( 例如 1， 1， 1， 2- 四氟乙烷 (HFA 134a) 和 1， 1， 1， 2， 3， 3， 3- 七氟 - 正 - 丙烷 (HFA 227))。 由于顾虑氯氟烃 类会影响臭氧层， 因此一般含有 HFA 的调配物是优选的。 HFA 调配物的其它任选组份包括共 溶剂 ( 例如乙醇或戊烷 ) 和表面活性剂 ( 例如山梨醇三油酸酯、 油酸、 卵磷脂和甘油 )。例 如， 参见颁予普若沃 (Purewal) 等人的美国专利第 5,225,183 号、 EP 0717987 A2( 明尼苏达 矿业和制造公司 (Minnesota Mining and Manufacturing Company)) 和 WO 92/22286( 明 尼苏达矿业和制造公司 )， 所述案件的揭示内容全文以引用方式并入本文中。
用于定量式吸入器的代表性医药组合物包含约 0.01 重量％到 5 重量％的本发明 的结晶游离碱化合物 ； 约 0 重量％到 20 重量％的乙醇 ； 和约 0 重量％到 5 重量％的表面活 性剂 ； 其余部分为 HFA 推进剂。 所述组合物通常是通过将经冷淬或加压的氢氟烷添加到含有结晶游离碱活性药 剂、 乙醇 ( 如果存在 ) 和表面活性剂 ( 如果存在 ) 的适宜容器中来制备。将结晶游离碱活 性药剂微粉化并然后与推进剂合并来制备悬浮液。 然后， 将调配物装填到气溶胶罐中， 所述 罐形成定量式吸入器装置的一部分。尤其经研发与 HFA 推进剂一起使用的定量式吸入器装 置的实例阐述于颁予马雷茨基 (Marecki) 的美国专利第 6,006,745 号和颁予阿什赫斯特 (Ashurst) 等人的美国专利第 6,143,277 中。或者， 可通过喷雾干燥活性药剂微粉化颗粒 上的表面活性剂涂层来制备悬浮液调配物。例如， 参见 WO 99/53901( 葛兰素集团有限公司 (Glaxo Group Ltd.)) 和 WO 00/61108( 葛兰素集团有限公司 )。上述专利和公开案的揭示 内容的全文以引用方式并入本文中。
关于制备可吸入颗粒的方法和适于吸入投药的调配物和装置的额外实例， 参 见 颁 予 高 (Gao) 等 人 的 美 国 专 利 第 6,268,533 号、 颁 予 舒 法 特 (Trofast) 的 美 国 专 利 第 5,983,956 号、 颁予布里纳 (Briggner) 的美国专利第 5,874,063 号和颁予亚库波夫 (Jakupovic) 的美国专利第 6,221,398 号和 WO 99/55319( 葛兰素集团有限公司 ) 和 WO 00/30614( 阿斯利康 AB) ； 所述案件的揭示内容全文以引用方式并入本文中。
在另一实施例中， 本发明医药组合物适用于经口投与。用于经口投与的适宜医 药组合物可呈胶囊、 片剂、 药丸、 菱形片剂、 扁囊剂、 糖衣药丸、 粉剂、 颗粒形式 ； 或作为存于 水性或非水性液体中的溶液或悬浮液 ； 或作为水包油或油包水液体乳液 ； 或作为酏剂或糖 浆； 和类似形式 ； 各自均含有预定量的本发明结晶游离碱作为活性成份。医药组合物可包 装成单位剂型。
当待以固体剂型 ( 即作为胶囊、 片剂、 丸剂和其类似物 ) 经口投与时， 本发明医药 组合物通常可包含作为活性成份的本发明结晶游离碱和一种或一种以上医药上可接受的 载剂， 例如柠檬酸钠或磷酸二钙。任选地或另一选择为， 所述固体剂型还可包含 ： 填充剂或 增量剂， 例如淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和 / 或硅酸 ； 结合剂， 例如羧甲基纤维素、 海 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、 蔗糖和 / 或阿拉伯胶 ； 保湿剂， 例如甘油 ； 崩解剂， 例如琼
脂、 碳酸钙、 马铃薯或木薯淀粉、 海藻酸、 某些硅酸盐和 / 或碳酸钠 ； 溶液阻滞剂， 例如石蜡 ； 吸收促进剂， 例如四级铵化合物 ； 润湿剂， 例如鲸蜡醇和 / 或甘油单硬脂酸酯 ； 吸收剂， 例如 高岭土和 / 或膨润土 ； 润滑剂， 例如滑石粉、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 月桂基硫 酸钠和 / 或其混合物 ； 着色剂 ； 和缓冲剂。
离型剂、 润湿剂、 涂布剂、 甜味剂、 矫味剂和加香剂、 防腐剂和抗氧化剂也可存在于 本发明医药组合物中。医药上可接受的抗氧化剂的实例包括 ： 水溶性抗氧化剂， 例如抗坏 血酸、 盐酸半胱胺酸、 硫酸氢钠、 偏亚硫酸氢钠、 亚硫酸钠和其类似物 ； 油溶性抗氧化剂， 例 如棕榈酸抗坏血酯、 丁基化羟基苯甲醚 (BHA)、 丁基化羟基甲苯 (BHT)、 卵磷脂、 没食子酸丙 酯、 α- 生育酚和其类似物 ； 和金属螯合剂， 例如柠檬酸、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 山梨醇、 酒 石酸、 磷酸和其类似物。 用于片剂、 胶囊、 丸剂和其类似物的涂布剂包括用于肠溶包衣者， 例 如纤维素乙酸酞酸酯 (CAP)、 聚酞酸乙酸乙烯酯 (PVAP)、 羟丙基甲基纤维素酞酸酯、 甲基丙 烯酸 - 甲基丙烯酸酯共聚物、 乙酸均苯三甲酸纤维素 (CAT)、 羧甲基乙基纤维素 (CMEC)、 羟 丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯 (HPMCAS) 和其类似物。
如果需要， 也可以不同比例使用 ( 例如 ) 羟丙基甲基纤维素或其它聚合体基质、 脂 质体和 / 或微球体来调配本发明医药组合物以提供活性成份的缓慢或受控释放。
此外， 本发明医药组合物可任选地含有遮光剂且可经调配以便其任选地以延迟方 式仅 ( 或优先 ) 在胃肠道的某一部分中释放活性成份。可使用的包埋组合物实例包括聚合 物质和蜡。如果适当， 则结晶游离碱活性成份也可呈含有一种或一种以上上述赋形剂的微 胶囊形式。
适用于经口投与的液体剂型包括 ( 举例说明 ) 医药上可接受的乳液、 微乳液、 溶 液、 悬浮液、 糖浆和酏剂。所述液体剂型通常包含活性成份和惰性稀释剂， 例如水或其它溶 剂、 增溶剂和乳化剂， 例如乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 苄醇、 苯甲酸苄基酯、 丙二醇、 1， 3- 丁二醇、 油类 ( 尤其棉籽油、 花生油、 玉米油、 胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油 )、 甘油、 四 氢呋喃醇、 聚乙二醇和山梨醇的脂肪酸酯和其混合物。 除所述活性成份外， 悬浮液可含有悬 浮剂， 例如乙氧基化异硬脂醇、 聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酐酯、 微晶纤维素、 偏氢氧化 铝、 膨润土、 琼脂和黄蓍胶和其混合物。
本发明的结晶游离碱还可使用已知的经皮递送系统和赋形剂经皮投与。例如， 可 将结晶游离碱与渗透促进剂 ( 例如， 丙二醇、 聚乙二醇单月桂酸酯、 氮杂环烷 -2- 酮和其类 似物 ) 混合并纳入到贴片或类似递送系统中。如果需要， 包括胶凝剂、 乳化剂和缓冲剂在内 的额外赋形剂可用于所述经皮组合物中。
本发明结晶游离碱也可与其它治疗剂共投与。 此组合疗法包括使用与这些次要药 剂中的一种或一种以上组合的结晶游离碱， 其一起调配 ( 例如， 在单一调配物中包装在一 起 ) 或分开调配 ( 例如， 包装为单独单位剂型 )。 将多种药剂在同一调配物中调配在一起或 在单独单位剂型中调配的方法已为业内所熟知。术语 “单位剂型” 是指适于给予患者的物 理离散单位， 即每一单位含有经计算以单独或与一个或一个以上额外单位组合产生期望治 疗效果的预定量的本发明化合物。例如， 所述单位剂型可为胶囊、 片剂、 丸剂和其类似物。
额外治疗剂可选自其它支气管扩张药 ( 例如， PDE3 抑制剂、 腺苷 2b 调节剂和 β2 肾上腺素能受体激动剂 ) ； 消炎剂 ( 例如， 类固醇消炎剂， 例如皮质类固醇 ； 非类固醇消炎剂 (NSAID) 和 PDE4 抑制剂 ) ； 其它毒蕈碱受体拮抗剂 ( 即， 抗胆碱药剂 ) ； 抗感染剂 ( 例如， 革兰氏 (Gram) 阳性和革兰氏阴性抗生素或抗病毒剂 ) ； 抗组胺药 ； 蛋白酶抑制剂 ； 和传入阻 断剂 ( 例如， D2 激动剂和神经激肽调节剂 )。
本发明的一个特定实施例涉及包含以下的组合物 ： (a) 医药上可接受的载剂和治 疗有效量的本发明结晶游离碱 ； 和 (b) 医药上可接受的载剂和治疗有效量的选自以下的药 剂： 类固醇消炎剂， 例如皮质类固醇 ； β2 肾上腺素能受体激动剂 ； 磷酸二酯酶 -4 抑制剂 ； 或 其组合 ； 其中结晶游离碱和药剂一起或分开调配。在另一实施例中， (b) 是医药上可接受的 载剂和治疗有效量的 β2 肾上腺素能受体激动剂和类固醇消炎剂。次要药剂可以医药上可 接受的盐或溶剂合物形式且 ( 如果适当 ) 以光学纯立体异构体形式使用。
可与本发明结晶游离碱组合使用的代表性 β2 肾上腺素能受体激动剂包括 ( 但不 限于 ) 沙美特罗 (salmeterol)、 舒喘灵 (salbutamol)、 福莫特罗 (formoterol)、 沙甲胺醇 (salmefamol)、 非诺特罗 (fenoterol)、 特布他林 (terbutaline)、 沙丁胺醇 (albuterol)、 异 他 林 (isoetharine)、 奥 西 那 林 (metaproterenol)、 比 托 特 罗 (bitolterol)、 吡布 特 罗 (pirbuterol)、 左 旋 沙 丁 胺 醇 (levalbuterol) 和 其 类 似 物 或 其 医 药 上 可 接 受 的 盐。其它可使用的 β2 肾上腺素能受体激动剂包括 ( 但不限于 )3-(4-{[6-({(2R)-2- 羟 基 -2-[4- 羟基 -3-( 羟基甲基 )- 苯基 ] 乙基 } 氨基 )- 己基 ] 氧基 } 丁基 ) 苯磺酰胺 和 3-(-3-{[7-({(2R)-2- 羟基 -2-[4- 羟基 -3-( 羟基甲基 ) 苯基 ] 乙基 }- 氨基 ) 庚基 ] 氧基 }- 丙基 ) 苯磺酰胺和阐述于中 WO 02/066422 的相关化合物 ( 葛兰素集团有限公 司)； 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2- 羟基 -2-[4- 羟基 -3-( 羟基甲基 ) 苯基 ] 乙基 } 氨基 ) 己 基 ] 氧基 } 丁基 )- 苯基 ] 咪唑烷 -2， 4- 二酮和阐述于 WO 02/070490 中的相关化合物 ( 葛兰素集团有限公司 ) ； 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-( 甲酰基氨基 )-4- 羟基苯基 ]-2- 羟 基 乙 基 } 氨 基 ) 己 基 ] 氧 基 } 丁 基 )- 苯 磺 酰 胺、 3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-( 甲 酰 基 氨 基 )-4- 羟基苯基 ]-2- 羟基乙基 } 氨基 ) 己基 ] 氧基 } 丁基 )- 苯磺酰胺、 3-(4-{[6-({(2R/ S)-2-[3-( 甲酰基氨基 )-4- 羟基苯基 ]-2- 羟基乙基 } 氨基 ) 己基 ] 氧基 } 丁基 )- 苯 磺酰胺、 N-( 叔丁基 )-3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-( 甲酰基氨基 )-4- 羟基苯基 ]-2- 羟基乙 基 } 氨基 ) 己基 ]- 氧基 } 丁基 ) 苯磺酰胺、 N-( 叔丁基 )-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-( 甲酰 基氨基 )-4- 羟基苯基 ]-2- 羟基乙基 } 氨基 )- 己基 ] 氧基 } 丁基 )- 苯磺酰胺、 N-( 叔丁 基 )-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-( 甲酰基氨基 )-4- 羟基苯基 ]-2- 羟基乙基 } 氨基 ) 己 基 ]- 氧基 } 丁基 ) 苯磺酰胺和阐述于 WO 02/076933 中的相关化合物 ( 葛兰素集团有限 公司 ) ； 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2， 6- 二氯苄基 ) 氧基 ] 乙氧基 } 己基 ) 氨基 ]-1- 羟基乙 基 }-2-( 羟基甲基 ) 苯酚和阐述于 WO 03/024439 中的相关化合物 ( 葛兰素集团有限公 司)； N-{2-[4-((R)-2- 羟基 -2- 苯基乙基氨基 ) 苯基 ] 乙基 }-(R)-2- 羟基 -2-(3- 甲酰胺 基 -4- 羟基苯基 ) 乙胺和阐述于颁予莫兰 (Moran) 等人的美国专利第 6,576,793 号中的相 关化合物 ； N-{2-[4-(3- 苯基 -4- 甲氧基苯基 ) 氨基苯基 ] 乙基 }-((R)-2- 羟基 -2-(8- 羟 基 -2(1H)- 喹啉酮 -5- 基 ) 乙胺和阐述于颁予莫兰等人的美国专利第 6,653,323 号中 的相关化合物 ； 和其医药上可接受的盐。在一特定实施例中， β2 肾上腺素受体激动剂 是 N-{2-[4-((R)-2- 羟基 -2- 苯基乙基氨基 ) 苯基 ] 乙基 }-(R)-2- 羟基 -2-(3- 甲酰胺 基 -4- 羟基苯基 ) 乙胺的结晶单盐酸盐。β2- 肾上腺素受体激动剂在采用时可以治疗有效 量存于医药组合物中。通常， β2- 肾上腺素受体激动剂可以足以提供每剂量约 0.05μg 到 500μg 的量存在。上述专利和公开案的揭示内容的全文以引用方式并入本文中。可与本发明结晶游离碱组合使用的代表性类固醇消炎剂包括 ( 但不限于 ) 甲基泼 尼松龙 (methyl prednisolone)、 泼尼松龙 (prednisolone)、 地塞米松 (dexamethasone)、 丙酸氟替卡松 (fluticasone propionate)、 6α， 9α- 二氟 -17α-[(2- 呋喃基羰基 ) 氧 基 ]-11β- 羟基 -16α- 甲基 -3- 氧代雄甾 -1， 4- 二烯 -17β- 甲硫羟酸 S- 氟甲基酯、 6α， 9α- 二氟 -11β- 羟基 -16α- 甲基 -3- 氧代 -17α- 丙酰氧基 - 雄甾 -1， 4- 二烯 -17β- 甲 硫羟酸 S-(2- 氧代 - 四氢呋喃 -3S- 基 ) 酯、 倍氯米松 (beclomethasone) 酯 ( 例如， 17- 丙 酸 酯 或 17， 21- 二 丙 酸 酯 )、 布 地 奈 德 (budesonide)、 氟 尼 缩 松 (flunisolide)、 莫米松 (mometasone) 酯 ( 例如， 呋喃甲酸酯 )、 曲安奈德 (triamcinolone acetonide)、 罗氟奈 德 (rofleponide)、 环索奈德 (ciclesonide)、 丙酸布替可特 (butixocort propionate)、 RPR-106541、 ST-126 和其类似物或其医药上可接受的盐。类固醇消炎剂在采用时可以治疗 有效量存于组合物中。通常， 类固醇消炎剂可以足以提供每剂量约 0.05μg 到 500μg 的量 存在。
实例性组合是共投与的本发明结晶游离碱与 β2 肾上腺素能受体激动剂和作为类 固醇消炎剂的丙酸氟替卡松。 另一实例性组合是共投与的本发明结晶游离碱与作为 β2- 肾 上腺素受体激动剂的 N-{2-[4-((R)-2- 羟基 -2- 苯基乙基氨基 ) 苯基 ] 乙基 }-(R)-2- 羟 基 -2-(3- 甲酰胺基 -4- 羟基苯基 ) 乙胺的结晶单盐酸盐和作为类固醇消炎剂的 6α， 9α- 二氟 -17α-[(2- 呋喃基羰基 ) 氧基 ]-11β- 羟基 -16α- 甲基 -3- 氧代雄甾 -1， 4- 二 烯 -17β- 甲硫羟酸 S- 氟甲基酯。如上所述， 所述药剂可一起或分开调配。
其它适宜组合包括 ( 例如 ) 其它消炎剂， 例如 NSAID( 例如色甘酸钠、 奈多罗米钠 (nedocromil sodium) 和磷酸二酯酶 (PDE) 抑制剂 ( 例如， 茶碱、 PDE4 抑制剂和 PDE3/PDE4 混合抑制剂 )) ； 白三烯拮抗剂 ( 例如， 孟鲁司特 (monteleukast) ； 白三烯合成抑制剂 ； iNOS 抑制剂 ； 蛋白酶抑制剂， 例如类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂 ； β-2 整联蛋白拮抗剂和腺 苷受体激动剂或拮抗剂 ( 例如， 腺苷 2a 激动剂 ) ； 细胞因子拮抗剂 ( 例如， 趋化因子拮抗剂， 例如白细胞介素抗体 (αIL 抗体 )， 尤其 αIL-4 疗法、 αIL-13 疗法或其组合 ) ； 或细胞因 子合成抑制剂。
可与本发明结晶游离碱组合使用的代表性磷酸二酯酶 -4(PDE4) 抑制剂或 PDE3/ PDE4 混合抑制剂包括 ( 但不限于 ) 顺 -4- 氰基 -4-(3- 环戊基氧基 -4- 甲氧基苯基 ) 环 己烷 -1- 甲酸、 2- 甲氧羰基 -4- 氰基 -4-(3- 环丙基甲氧基 -4- 二氟甲氧基苯基 ) 环己 烷 -1- 酮 ； 顺 -[4- 氰 基 -4-(3- 环 丙 基 甲 氧 基 -4- 二 氟 甲 氧 基 苯 基 ) 环 己 烷 -1- 醇 ] ； 顺 -4- 氰 基 -4-[3-( 环 戊 基 氧 基 )-4- 甲 氧 基 苯 基 ] 环 己 烷 -1- 甲 酸 和 其 类 似 物 或 其 医 药 上 可 接 受 的 盐。 其 它 代 表 性 PDE4 或 PDE4/PDE3 混 合 抑 制 剂 包 括 AWD-12-281( 艾 尔 鲍 (elbion)) ； NCS-613(INSERM) ； D-4418( 螺 旋 藻 科 学 (Chiroscience) 和 先 灵 葆 雅 (Schering-Plough)) ； CI-1018 或 PD-168787( 辉 瑞 (Pfizer)) ； 阐 述 于 WO99/16766( 日 本协和发酵 (Kyowa Hakko)) 中的苯并间二氧杂环戊烯化合物 ； K-34( 日本协和发酵 ) ； V-1294A( 纳 普 (Napp)) ； 罗 氟 司 特 (roflumilast)( 德 国 百 克 顿 (Byk-Gulden)) ； 阐述 于 WO99/47505( 德 国 百 克 顿 ) 中 的 酞 嗪 酮 化 合 物 ； 普 马 芬 群 (Pumafentrine)( 德 国 百 克 顿， 现 为 德 国 阿 尔 塔 纳 (Altana)) ； 阿 罗 茶 碱 (arofylline)( 西 班 牙 艾 美 罗 医 药 (Almirall-Prodesfarma)) ； VM554/UM565( 英国沃那里斯 (Vernalis)) ； T-440( 日本田边制 药 (Tanabe Seiyaku)) ； 和 T2585( 日本田边制药 )。可与本发明结晶游离碱组合使用的代表性毒蕈碱拮抗剂 ( 即抗胆碱能药剂 ) 包 括 ( 但不限于 ) 阿托品 (atropine)、 硫酸阿托品、 氧阿托品、 硝甲阿托品、 氢溴酸后马托品 (homatropine hydrobromide)、 氢溴酸莨菪碱 (d， l)(hyoscyamine(d， l)hydrobromide)、 氢 溴 酸 东 莨 菪 碱 (scopolamine hydrobromide)、 异 丙 托 溴 铵 (ipratropium bromide)、 氧 托 溴 铵 (oxitropium bromide)、噻 托 溴 铵 (tiotropium bromide)、溴 甲 胺 太 林 (methantheline)、 溴 丙 胺 太 林 (propantheline bromide)、 甲 溴 辛 托 品 (anisotropine methyl bromide)、克 利 溴 铵 (clidinium bromide)、格 隆 溴 铵 (copyrrolate)( 甘 罗 溴 铵 (Robinul))、异 丙 碘 铵 (isopropamide iodide)、溴 美 喷 酯 (mepenzolate bromide)、 曲 地 氯 铵 (tridihexethyl chloride)( 埃 博 霉 素 (Pathilone))、 甲硫己环 铵 (hexocyclium methylsulfate)、盐 酸 环 戊 通 (cyclopentolate hydrochloride)、 托 吡 卡 胺 (tropicamide)、 盐 酸 苯 海 索 (trihexyphenidyl hydrochloride)、 哌仑西平 (pirenzepine)、 替仑西平 (telenzepine)、 AF-DX 116 和美索曲明 (methoctramine) 和其类 似物或其医药上可接受的盐 ； 或对于列举为盐的所述化合物来说， 为其替代医药上可接受 的盐。
可 与 本 发 明 结 晶 游 离 碱 组 合 使 用 的 代 表 性 抗 组 胺 剂 ( 即 H1- 拮 抗 剂 ) 包 括 ( 但不限于 ) 乙醇胺， 例如马来酸卡比沙明 (carbinoxamine maleate)、 富马酸氯马斯 汀 (clemastine fumarate)、 盐 酸 苯 海 拉 明 (diphenylhydramine hydrochloride) 和 茶 苯海明 (dimenhydrinate) ； 乙二胺， 例如马来酸吡拉明 (pyrilamine amleate)、 盐酸曲 吡 那 敏 (tripelennamine hydrochloride) 和 柠 檬 酸 曲 吡 那 敏 ； 烷 基 胺， 例如氯苯那敏 (chlorpheniramine) 和阿伐斯汀 (acrivastine) ； 哌嗪， 例如盐酸羟嗪、 双羟萘酸羟嗪、 盐 酸赛克力嗪 (cyclizine hydrochloride)、 乳酸赛克力嗪 (cyclizine lactate)、 盐酸美 克洛嗪 (meclizine hydrochloride) 和盐酸西替利嗪 (cetirizine hydrochloride) ； 哌 啶， 例如阿司咪唑 (astemizole)、 盐酸左卡巴斯汀 (levocabastine hydrochloride)、 氯雷 他定 (loratadine) 或其去乙氧羰基类似物、 特非那定 (terfenadine) 和盐酸非索非那定 (fexofenadine hydrochloride) ； 盐酸氮卓斯丁 (azelastine hydrochloride) ； 和其类似 物或其医药上可接受的盐 ； 或对于列举为盐的所述化合物来说， 为其替代医药上可接受的 盐。
除非另有说明， 否则与本发明结晶游离碱组合投与的其它治疗剂的实例性适宜剂 量在约 0.05μg/ 天到 100mg/ 天范围内。
下列调配物阐释本发明的代表性医药组合物以及实例性制备方法。 一种或一种以 上次要药剂可任选地与本发明结晶游离碱 ( 主要活性药剂 ) 一起调配。或者， 次要药剂可 分开调配并与主要活性药剂同时或依序共投与。 例如， 在一个实施例中， 单一干粉调配物可 制造为同时包括本发明结晶游离碱与一种或一种以上次要药剂。在另一实施例中， 一种调 配物制造为含有本发明结晶游离碱且单独调配物制造为含有次要药剂。 所述干粉调配物随 后可包装于单独泡罩包装中并利用 DPI 装置投与。
通过吸入投与的实例性干粉调配物
将 0.2mg 本发明结晶游离碱微粉化且然后使其与 25mg 乳糖一起掺和。然后将经 掺和的混合物装填到明胶吸入药筒中。所述药筒的内容物是使用粉末吸入器投与。
通过干粉吸入器投与的实例性干粉调配物制备本发明微粉化结晶游离碱 ( 活性药剂 ) 与乳糖的体积调配物比率为 1 ∶ 200 的干粉。将粉末包装于能够每剂量递送约 10μg 到 100μg 活性药剂的干粉吸入装置中。
通过定量式吸入器投与的实例性调配物
通过将 10g 结晶游离碱 ( 作为平均尺寸小于 10μm 的微粉化颗粒 ) 分散于由 0.2g 卵磷脂溶解于 200mL 脱矿质水形成的溶液中来制备含 5 重量％本发明结晶游离碱 ( 活性药 剂 ) 和 0.1wt％卵磷脂的悬浮液。 喷雾干燥悬浮液， 并且将所得材料微粉化成平均直径小于 1.5μm 的颗粒。将所述颗粒装填到具有经压缩 1， 1， 1， 2- 四氟乙烷的药筒中。
或者， 通过将 5g 呈平均尺寸小于 10μm 的微粉化颗粒形式的结晶游离碱分散于通 过将 0.5g 海藻糖和 0.5g 卵磷脂溶解于 100mL 脱矿质水中所形成的胶质溶液中来制备含有 5wt％本发明结晶游离碱、 0.5wt％卵磷脂和 0.5wt％海藻糖的悬浮液。喷雾干燥悬浮液， 并 且将所得材料微粉化成平均直径小于 1.5μm 的颗粒。将颗粒装填到含有加压 1， 1， 1， 2- 四 氟乙烷的药罐中。
通过雾化罐投与的实例性水性气溶胶调配物
通过将 0.5mg 本发明结晶游离碱 ( 活性药剂 ) 溶解于 1mL 经柠檬酸酸化的 0.9％ 氯化钠溶液中来制备医药组合物。将所述混合物搅拌并实施超声处理直到活性药剂溶解。 通过缓慢添加 NaOH 将溶液的 pH 调节到 3 到 8 范围内的值 ( 通常约 5)。
用于经口投与的实例性硬明胶胶囊调配物
将下列成份彻底掺和并随后装填到硬明胶胶囊中 ： 250mg 本发明结晶游离碱、 200mg 乳糖 ( 喷雾干燥 ) 和 10mg 硬脂酸镁， 每个胶囊总共 460mg 组合物。
用于经口投与的实例性悬浮液调配物
将下列成份混合以形成每 10mL 悬浮液含有 100mg 活性成份的悬浮液。
实例性可注射调配 将下列成份掺和并使用 0.5N HCl 或 0.5N NaOH 将 pH 调节到 4±0.5。
实例
提供下列制备和实例来阐释本发明的具体实施例。 然而， 除非明确说明， 否则所述 具体实施例并不打算以任何方式限制本发明范围。除非另有说明， 否则下列缩写具有下列 含义， 且本文所用且未定义的任何其它缩写都具有其标准含义 ：
本文所用但未定义的任何其它缩写都具有其公认的标准含义。除非另有注明， 否 则试剂、 起始材料和溶剂都购自商业供应商 ( 例如西格玛 - 奥德里奇 (Sigma-Aldrich)、 弗 卢卡 (Fluka) 等 )， 并且未经进一步纯化即使用。
制备 1
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基 氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯
将联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲 基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的二磷酸盐 (16g) 溶解于水 (100mL) 与 EtOAc(200mL) 的两 相混合物中。经 5 分钟的时段添加 NaOH(2N， 75mL)。然后将混合物搅拌 30 分钟。分离各相 且用 EtOAc(200mL) 萃取水相。浓缩合并的有机相。添加 DCM(100mL)， 并将混合物蒸发至干
燥。将固体在炉中干燥约 48 小时以产生标题化合物 (9.6g)。
实例 1
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基 氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱 ( 形式 III)
将联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲 基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯 (102.4mg) 溶解于 MeCN(500μL) 中。将溶液于室温下搅拌 80 分钟并形成白色固体沉淀。将混合物放置于振荡器区 (block) 中以热循环 ( 在 1 小时 区中 0℃到 40℃ )48 小时。观察到白色致密静止固体。添加 MeCN(500μL) 以使浆液流动。 然后将混合物放置回振荡器区中并保持 2 小时。通过使用烧结漏斗的真空过滤分离固体， 随后在 40℃和完全真空下将其放置于活塞式干燥器中达 15.5 小时， 从而产生 76.85mg 标题 结晶化合物。
实例 2
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基甲基氨 基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱 ( 形式 III)
在室温和氮下将联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基 - 哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的二磷酸盐 (C35H43N5O4·2H3PO4 ； MW 793.75 ； 632.9g) 在乙酸异丙基酯 (11.08L) 和水 (6.33L) 中制成浆液。将悬浮液升温到 53±3℃并 向搅拌混合物中添加 10M NaOH(317mL)， 同时维持混合物的温度高于 50℃。在 53±3℃下 将混合物搅拌约 5 分钟， 之后使各层沉降。然后分离各层并移除水层。向有机层中添加水 (3.16L)， 同时维持混合物的温度高于 50℃。在 53±3℃下将混合物搅拌 5 分钟， 之后使各 层沉降。分离各层并移除水层。添加乙酸异丙基酯 (6.33L) 且然后通过常压蒸馏收集约 10 体积的馏出物。利用额外乙酸异丙基酯 (3.2L) 重复此步骤。在第二次蒸馏后， 将澄清溶液 的温度降低到 53±3℃， 然后用联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲 基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯结晶游离碱 ( 形式 III ； 3.2g) 存于乙酸异 丙基酯 (51mL) 中的悬浮液引晶。将所得悬浮液于 53±3℃下搅拌 2 小时， 然后经 4 小时冷 冻到 10±3℃。将悬浮液于 10±3℃下搅拌至少 2 小时且然后通过过滤收集固体。用乙酸 异丙基酯 (2x1.9L) 洗涤所得滤饼且将产物于 50℃下在真空中干燥， 从而产生标题结晶化 合物 (C35H43N5O4 ； MW 597.76 ； 382.5g， 80.3％产率 )。
实例 3
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基 氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱 ( 形式 III) 的重结晶
在 20±3 ℃和氮下将联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基 甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱 ( 形式 III ； C35H43N5O4 ； MW 597.76 ； 372.5g) 在甲苯 (5.6L) 中制成浆液。将悬浮液升温到 82±3℃， 且保持在此温 度下直至观察到完全溶解为止。然后将溶液澄清到结晶器容器中， 之后用甲苯 (373μL) 冲洗。在结晶器容器中观察到固体， 且将容器重新加热到 82±3 ℃以实施溶解， 然后冷却 到 58±3℃并用存于甲苯 (8μL) 中的预先经超声波处理 ( 约 1 分钟 ) 的结晶游离碱 ( 形 式 III ； 1.9g) 引晶。使所得悬浮液于 58±3 ℃下静置至少 4 小时， 然后经 2 小时冷却到 20±3℃ ( 近似冷却速率为 0.33℃ /min)。将悬浮液于 20±3℃下搅拌至少 1 小时， 然后通过过滤收集固体。用甲苯 (2x1.2L) 洗涤所得滤饼且将产物于 52±3℃下在真空中干燥， 从 而产生标题结晶化合物 (345.3g， 92.7％产率 )。
实例 4
联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 剂甲基 ) 苯甲酰基甲基氨 基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯的结晶游离碱 ( 形式 IV)
将联苯 -2- 基氨基甲酸 1-(2-{[4-(4- 氨甲酰基哌啶 -1- 基甲基 ) 苯甲酰基 ] 甲 基氨基 } 乙基 ) 哌啶 -4- 基酯 ( 如制备 1 中所述制备 ； 2.5g) 溶解于 MeCN(10mL) 中以产生 粘性油状浅黄色物质。添加额外 MeCN(5mL) 以稀释所述物质。将溶液用结晶游离碱 (20mg ； 形式 III， 如实例 1 中所述制备 ) 引晶并于室温下搅拌 90 分钟。观察到大量白色沉淀 ( 小 晶体 )。在偏振光显微镜下分析浆液且发现具有双折射性。
添加额外 MeCN(3mL) 并将浆液放置于梅兹西恩 10(Metz Syn10) 区中以在 800rpm 下热循环 ( 在 1 小时区中 0℃到 40℃ ) 过夜。梅兹西恩 10 是静态的 10 位置平行反应站。 通过交叉磁力搅拌棒搅动溶液 / 浆液。振荡器区是设备中通过外部优莱博 (Julabo) 浴槽 加热和冷却的单独件。 在 0℃下移除所述物质。 观察到浆液沉降析出， 在白色沉淀上留下浅 黄色溶液。搅拌浆液并将其放置回振荡器区中以热循环。
于 40 ℃下移除所述物质， 且在室温下以高搅动速率搅拌 80 分钟。再次分析浆 液且发现其具有双折射性。通过使用烧结漏斗的真空过滤分离滤饼。在过滤之前， 使用 MeCN(3mL) 以润湿滤纸并用 MeCN 洗涤滤饼。 将所述饼在真空下脱液 40 分钟， 从而产生 2.3g 流动白色粉末。于 40℃下将所述物质放置于活塞式干燥器中达 65 小时， 从而产生 2.2g 白 色粉末状标题结晶化合物 (99.6％纯度 )。
大多数产物的拉曼 (Raman) 光谱与形式 III 起始材料一致。然而， 记录到三个位 移：
形式 III 产物 -1
878cm 881cm-1
775cm-1 772cm-1
485cm-1 488cm-1
然后通过粉末 x 射线衍射、 差示扫描量热法和热重分析分析所述产物。测得产物 是与形式 III 起始材料不同的游离碱结晶， 且命名为形式 IV。
实例 5
粉末 x 射线衍射
在配备有埃克斯塞雷瑞特 (XCelerator) 检测器的 PANalytical X′ Pert Pro 粉 末衍射仪上采集结晶游离碱形式 III( 来自实例 1) 和 IV( 来自实例 4) 的粉末 x 射线衍射 (PXRD) 图案。 采集条件为 ： 辐射 ： Cu Kα ； 发生器电压 ： 40kV ； 发生器电流 ： 45mA ； 起始角度 ： 2.0° 2θ ； 终止角度 ： 40.0° 2θ ； 步长 ： 0.0167° 2θ。时间 / 步为 31.750 秒通过将数 毫克试样放置于硅晶片 ( 零背景 ) 板上从而形成粉末薄层来准备试样。
下文概述特征峰位置和所计算 d 间距， 仅报告具有大于 14％相对强度的所述峰。 使用高分 (Highscore) 软件根据原始数据计算这些值。峰位置的实验误差为约 ±0.1° 2θ。相对峰强度将因优选定向而变化。
结晶游离碱形式 III 的代表性 PXRD 图案示于图 1 中。结晶游离碱形式 IV 的代表 性 PXRD 图案示于图 2 中。
实例 6
热分析
使用 TA 仪器 (Instruments) 热量计获得结晶游离碱形式 III( 来自实例 1) 和
IV( 来自实例 4) 的差示扫描量热法 (DSC) 热分析图。将试样称量到铝盘中， 将盘盖置于顶 部并轻微折曲而不密封所述盘。使用 10℃ /min 的加热速率进行实验。
结晶游离碱形式 III 的代表性 DSC 温度记录图示于图 4 中。DSC 温度记录图展示， 形式 III 的特征在于 DSC 温度记录图显示吸热热流的起点在约 123.1℃处 ( 焓为 67.7J/g)。
结晶游离碱形式 IV 的代表性 DSC 温度记录图示于图 5 中。DSC 温度记录图展示， 形式 IV 的特征在于 DSC 温度记录图显示较小吸热和主要吸热， 即吸热热流的较小第一起 点出现在 65.6℃处 ( 焓为 0.8J/g)， 且吸热热流的主要第二起点出现在 118.8℃处 ( 焓为 66.8J/g)。
使用 TA 仪器 Q500 仪器获得热重分析 (TGA) 数据。将试样在开放铝盘中以 10℃ / min 的加热速率加热到 200℃。
结晶游离碱形式 III 的代表性 TGA 迹线示于图 6 中， 并且表示在试样降解之前观 察到可忽略的重量损失。结晶游离碱形式 IV 的代表性 TGA 迹线示于图 7 中， 并且表示在试 样熔融之前观察到约 0.3％重量损失， 此与残余溶剂的损失一致。
实例 7
重量蒸气吸附评定
于 25 ℃下使用产生完全吸附等温线的表面测量系统 (Surface Measurements System)DVS-1 仪器使用水蒸汽灌注来执行重量蒸气吸附 (GVS) 研究。 将约 7mg 的试样量放 置于清洁干燥的配衡试样筛盘中并使用内部平衡来称重。目标相对湿度 (RH) 范围为 30％ 到 90％， 随后为 90％到 0％和 0％到 30％， 步长为 10％。使用 0.02dm/dt 渐近线设定来自 动确定平衡点。
于 25 ℃下对结晶游离碱形式 III 的试样实施的 GVS 研究展示， 所述物质在范围 0％ RH 到 90％ RH 内具有低的吸收水分的倾向。试样显示， 于 25℃下介于 0 与 90％ RH 之间 的可逆水吸收＜ 2％ w/w。此 GVS 迹线展示， 形式 III 在暴露于宽湿度范围时具有可接受的 重量增加。
实例 8
微粉化
使用 APTM 4” 微粉化器微粉化结晶游离碱形式 III 的试样并通过激光衍射测定粒 径。
为进行参考， 输入结晶游离碱形式 III 的粒径为 X10 ＝ 5.58μm， X50 ＝ 18.2μm， 且 X90 ＝ 49.7μm。微粉化产生可吸入大小范围内的颗粒。微粉化导致结晶度降低但保留预微 粉化材料的基本特征。在 40℃ /20％相对湿度、 40℃ /75％相对湿度 ( 未封盖 ) 和 50℃ / 环境湿度下存储 3 个月后， 未观察到 PXRD 变化。
结晶游离碱形式 III 的 DSC 温度记录图显示在微粉化之前和之后， 在 125 ℃下 突然熔融。在 87 ℃下在微粉化材料中存在另一较小热事件， 可能是由于结晶引起的。在 40 ℃ /20 ％ RH、 40 ℃ / 裸 75 ％ RH 和 50 ℃ / 环境湿度下存储 3 个月后， 微粉化材料显示在
125℃下突然熔融， 且无非晶形内容物的证据。
实例 9
乳糖相容性
结晶游离碱形式 III 的两种调配物评估为关于在 40 ℃ /20 ％相对湿度 (RH)、 40 ℃ /75 ％ RH( 未封盖 ) 和 50 ℃ / 环境湿度下稳定 3 个月。0.08wt/wt ％ (10μg DPI 剂 量 ) 和 2wt/wt％ (250μg DPI 剂量 ) 调配物制备为仅与乳糖或与乳糖和 1wt/wt％硬脂酸 镁的掺合物。发现所有调配物的稳定性都可接受。
实例 10
pH 溶解性和稳定性
结晶游离碱形式 III 显示在高达 pH 7 的介质中具有良好溶解性 ( 大于约 2mg/ mL)。 在 8.9 的中性 pH 下于水中的溶解性为 0.66mg/mL。 于模拟肺液中的溶解性为 0.46mg/ mL， 在 4 小时与 24 小时溶解性测量之间未观察到变化。
结晶游离碱形式 III 溶液在 pH 4 和 pH 6 缓冲液中于 50℃下或暴露于光中可稳定 高达 7 天。所述溶液于室温下在水和盐水中稳定 7 天， 免受光影响。
分析 1
放射性配体结合分析
从表达 hM1、 hM2、 hM3 和 hM4 毒蕈碱受体亚型的细胞制备膜
使稳定表达经克隆人类 hM1、 hM2、 hM3 和 hM4 毒蕈碱受体亚型的 CHO 细胞系分别 在有补加 10 ％ FBS 和 250μg/mL 遗传霉素 (Geneticin) 的哈莫斯 (HAM ′ s)F-12 组成的 培养基中生长至几乎汇合。在 5 ％ CO2 下于 37 ℃培育器中使细胞生长， 并用存于 dPBS 中 的 2mM EDTA 提取出细胞。通过以 650x g 离心 5 分钟来收集细胞， 并将细胞沉淀冷冻存储 在 -80℃下或立即制备膜。对于膜的制备， 使细胞沉淀再悬浮于溶胞缓冲液中， 并用保利通 (Polytron)PT-2100 组织破碎器匀浆 ( 凯恩迈特格 (Kinematica)AG ； 20 秒 x 2 次破裂 )。 在 4℃下以 40,000x g 将粗制膜离心 15 分钟。然后用再悬浮缓冲液使膜沉淀再悬浮， 并用 保利通组织破碎器再次匀浆。通过劳瑞， O.(Lowry， O.) 等人， 生物化学期刊 (Journal of Biochemistry)， 193 ： 265(1951) 中所述的方法来测定膜悬浮液的蛋白质浓度。以多个等份 将所有膜在 -80℃下冷冻存储或立即使用。直接从铂金埃尔默 (PerkinElmer) 公司购得多 个等份的已制备 hM5 受体膜， 并将其存储在 -80℃下直至使用。
对毒蕈碱受体亚型 hM1、 hM2、 hM3、 hM4 和 hM5 的放射性配体结合分析
放射性配体结合分析是在 96 孔微量滴定板中以 1000μL 的总分析体积来执行。 使稳定表达 hM1、 hM2、 hM3、 hM4 或 hM5 毒蕈碱亚型的 CHO 细胞膜在分析缓冲液中稀释到以下 具体目标蛋白质浓度 (μg/ 孔 ) ： 10μg hM1、 10-15μg hM2、 10-20μg hM3、 10-20μg hM4 和 10-12μg hM5。在分析板添加前， 使用保利通组织破碎器对膜实施短暂匀浆 (10 秒 )。测 定放射性配体 KD 值的饱和结合研究是以 0.001nM 到 20nM 范围的浓度使用 L-[N- 甲基 -3H] 氯化甲基东莨菪碱 ([3H]-NMS)(TRK666， 84.0Ci/mmol， 安法玛西亚生物制药公司 (Amersham Pharmacia Biotech)， 白金汉郡 (Buckinghamshire)， 英格兰 ) 来执行。测定测试化合物 Ki 3 值的置换分析是以 1nM 的 [ H]-NMS 和 11 种不同测试化合物浓度来执行。首先将测试化合 物以 40μM 的浓度溶解于稀释缓冲液中， 且然后用稀释缓冲液将其连续稀释 5x 至 400fM 至 4μM 的最终浓度。向分析板中添加的顺序和体积如下所述 ： 825μL 具有 0.1 ％ BSA 的分析缓冲液、 25μL 放射性配体、 100μL 经稀释测试化合物和 50μL 膜。将分析板在 37℃下 培育 6 小时。通过经在 0.3％聚乙烯亚胺 (PEI) 中预处理的 GF/B 玻璃纤维过滤板 ( 铂金 埃尔默公司， 韦尔斯利 (Wellesley)， MA) 快速过滤来终止结合反应。用洗涤缓冲液 (10mM HEPES) 将滤板冲洗三次以移除未结合的放射活性。然后使板风干， 并将 50μL 微森特 (Microscint)-20 液态闪烁流体 ( 铂金埃尔默公司， 韦尔斯利， MA) 添加到各孔中。然后在 铂金埃尔默拓普康 (TopCount) 液体闪烁计数器 ( 铂金埃尔默公司， 韦尔斯利， MA) 中对板 实施计数。结合数据是通过非线性回归分析使用格拉夫派得普锐斯 (GraphPad Prism) 软 件包 ( 格拉夫派得 (GraphPad) 软件公司， 加利福尼亚州圣地亚哥 (San Diego， CA)) 以单一 位点竞争模式来分析。使用程 - 普鲁萨福 (Cheng-Prusoff) 方程 ( 程 Y(Cheng Y) ； 普鲁萨 福 (Prusoff W.H.)， 生化药理学 (Biochemical Pharmacology)， 22(23) ： 3099-108(1973)) 从所观测到的放射性配体的 IC50 值和 KD 值来计算测试化合物的 Ki 值。使 Ki 值转化成 pKi 值以测定几何平均和 95％置信区间。然后， 将这些汇总统计值转化回 Ki 值用于数据报告。
在此分析中， 较低 Ki 值表示测试化合物对所测试受体具有较高结合亲和力。已发 现， 在此分析或类似分析中测试时式 I 化合物与 M3 毒蕈碱受体亚型的 Ki 值小于约 5nM。
分析 2
毒蕈碱受体的功能性效能分析
对 cAMP 积累的激动剂调介抑制的阻断
在此分析中， 通过在表达 hM2 受体的 CHO-K1 细胞中测量测试化合物阻断福司柯林 (forskolin) 调介 cAMP 积累的氧代震颤素抑制的能力来测定测试化合物的功能性效能。
cAMP 分析是根据制造商说明书使用具有 125I-cAMP 的闪光板腺苷酸环化酶活化分 析系统 (NEN SMP004B， 铂金埃尔默生命科学公司 (PerkinElmer Life Sciences Inc.)， 波 士顿 (Boston)， MA) 以放射性免疫分析模式来执行。
用 dPBS 将 细 胞 冲 洗 一 次 并 用 胰 蛋 白 酶 -EDTA 溶 液 (0.05 ％ 胰 蛋 白 酶 /0.53mMEDTA) 将细胞提取出来， 如分析 1 中所述。通过以 650x g 离心 5 分钟将已分离细胞 在 50mL dPBS 中洗涤两次。然后使细胞沉淀再悬浮于 10mL dPBS 中， 并用 Coulter Z1 双颗 粒计数器 ( 贝克曼库尔特 (Beckman Coulter)， 富勒顿 (Fullerton)， CA) 对细胞实施计数。 6 6 再次以 650x g 将细胞离心 5 分钟， 并以 1.6x 10 -2.8x 10 个细胞 /mL 的分析浓度使细胞 再悬浮于刺激缓冲液中。
首 先 以 400μM 的 浓 度 使 测 试 化 合 物 溶 解 于 稀 释 缓 冲 液 ( 补 加 有 1mg/mL BSA(0.1％ ) 的 dPBS) 中， 然后用稀释缓冲液连续稀释到介于 100μM 到 0.1nM 之间的最终 摩尔浓度。以类似方式稀释氧代震颤素。
为测量 AC 活性的氧代震颤素抑制， 将 25μL 福司柯林 ( 以 25μm 最后浓度稀释于 dPBS 中 )、 25μL 经稀释氧代震颤素和 50μL 细胞添加到激动剂分析孔中。 为测量测试化合 物阻断氧代震颤素抑制 AC 活性的能力， 将 25μL 福司柯林和氧代震颤素 ( 分别以 25μM 和 5μM 的最终浓度稀释于 dPBS 中 )、 25μL 经稀释测试化合物和 50μL 细胞添加到其余分析 孔中。
在 37℃下将反应物培育 10 分钟， 并通过添加 100μL 冰冷检测缓冲液使其停止。 将 板密封， 在室温下培育过夜， 并在第二天早利用在铂金埃尔默拓普康液体闪烁计数器 ( 铂 金埃尔默公司， 韦尔斯利， MA) 计数。 根据制造商的使用者手册中所述基于在试样和 cAMP 标准物中所观测到的计数来计算所产生 cAMP 的量 (pmol/ 孔 )。通过非线性回归分析使用格 拉夫派得普锐斯软件包 ( 格拉夫派得软件公司， 加利福尼亚州圣地亚哥 ) 以非线性回归单 一位点竞争方程来分析数据。使用程 - 普鲁萨福方程来计算 Ki， 其中分别使用氧代震颤素 浓度 - 反应曲线的 EC50 和氧代震颤素分析浓度来作为 KD 和 [L]。使 Ki 值转化成 pKi 值以测 定几何平均和 95％置信区间。然后， 将汇总统计值转化回 Ki 值以用于数据报告。
在此分析中， 较低 Ki 值表示测试化合物对所测试受体具有较高功能性活性。已发 现， 式 I 化合物在此分析或类似分析中测试时在表达 hM2 受体的 CHO-K1 细胞中阻断福司柯 林调介 cAMP 积累的氧代震颤素抑制的 Ki 值小于约 5nM。
对激动剂调介的 [35S]GTPγS 结合的阻断
在第二功能性分析中， 可通过在表达 hM2 受体的 CHO-K1 细胞中测量化合物阻断氧 35 代震颤素刺激 [ S]GTPγS 结合的能力来测定测试化合物的功能性效能。
在使用时， 使冷冻膜解冻， 然后以 5-10μg 蛋白质 / 孔的最终目标组织浓度将其稀 释于分析缓冲液中。使用保利通 PT-2100 组织破碎器将膜短暂匀浆， 然后添加到分析板中。 35
在各实验中测定激动剂氧代震颤素刺激 [ S]GTPγS 结合的 EC90 值 ( 达成 90％最 大反应的有效浓度 )。
为测定测试化合物抑制氧代震颤素刺激 [35S]GTPγS 结合的能力， 将以下材料添 35 加到 96 孔板的各孔中 ： 25μL 含有 [ S]GTPγS(0.4nM) 的分析缓冲液、 25μL 氧代震颤素 (EC90) 和 GDP(3μM)、 25μL 经稀释测试化合物和 25μL 表达 hM2 受体的 CHO 细胞膜。然后 将分析板在 37℃下培育 60 分钟。经用 1％ BSA 预处理的 GF/B 过滤器使用铂金埃尔默 96 孔采集器来过滤分析板。用冰冷洗涤缓冲液将板冲洗 3x 3 秒， 然后风干或真空干燥。将微 森特 -20 闪烁液体 (50μL) 添加到各孔中， 并将各板密封并利用顶端显示计数器 ( 铂金埃 尔默 ) 计数放射性活性。通过非线性回归分析使用格拉夫派得普锐斯软件包 ( 格拉夫派 得软件公司， 加利福尼亚州圣地亚哥 ) 以非线性回归单一位点竞争方程来分析数据。使用 程 - 普鲁萨福方程来计算 Ki， 其中分别使用测试化合物的浓度 - 反应曲线的 IC50 值和分析 中氧代震颤素的浓度作为 KD 和 [L]( 配体浓度 )。
在此分析中， 较低 Ki 值表示测试化合物对所测试受体具有较高功能性活性。已发 现， 式 I 化合物在此分析或类似分析中测试时在表达 hM2 受体的 CHO-K1 细胞中阻断氧代震 颤素刺激 [35S]GTPγS 结合的 Ki 值小于约 5nM。
通过 FLIPR 分析对激动剂调介钙释放的阻断
与 Gq 蛋白偶合的毒蕈碱受体亚型 (M1、 M3 和 M5 受体 ) 在激动剂与受体结合后激 活磷脂酶 C(PLC) 路径。因此， 激活的 PLC 将磷脂酰肌醇二磷酸 (PIP2) 水解成二酰甘油 (DAG) 和磷脂酰基 -1， 4， 5- 三磷酸盐 (IP3)， 其又引起从细胞内存储点 ( 即内质网和肌质 网 ) 释放钙。FLIPR( 分子装置公司 (Molecular Devices， Inc.)， 加利福尼亚州森尼韦尔 (Sunnyvale， CA)) 分析通过使用在结合游离钙时可发出荧光的钙敏染料 (Fluo-4AM， 分子 探针 (Molecular Probes)) 来表现此细胞内钙增加。此荧光事件是通过 FLIPR 实时测量， 其检测来自克隆有人类 M1 与 M3 和黑猩猩 M5 受体的细胞单层的荧光的变化。可通过测量拮 抗剂抑制激动剂调介细胞内钙增加的能力来测定拮抗剂效能。
对于 FLIPR 钙刺激分析， 在实施分析之前一晚将稳定表达 hM1、 hM3 和 cM5 受体 的 CHO 细胞引晶到 96 孔 FLIPR 板中。通过细胞洗涤器 (Cellwash)(MTX 实验室系统 (MTXLabsystems) 公司 ) 使用 FLIPR 缓冲液 (10mM HEPES， pH 7.4， 2mM 氯化钙， 2.5mM 丙磺舒 (probenecid)， 存于不含钙和镁的 HBSS 中 ) 将引晶的细胞洗涤两次以移除生长培养基并 保留 50μL/ 孔的 FLIPR 缓冲液。然后， 在 37℃、 5％二氧化碳下将细胞与 50μL/ 孔的 4μM FLUO-4AM( 制成 2X 溶液 ) 一起培育 40 分钟。在染料培育期之后， 用 FLIPR 缓冲液将细胞洗 涤两次， 并保留 50μL/ 孔的最终体积。
为测定拮抗剂效能， 首先测定氧代震颤素对细胞内 Ca2+ 释放的剂量依赖性刺激， 从而稍后可在 EC90 浓度下根据氧代震颤素刺激来测量拮抗剂效能。首先， 将细胞与化合物 稀释缓冲液一起培育 20 分钟， 然后添加激动剂， 此是通过 FLIPR 来执行。根据下文 FLIPR 测量和数据归纳部分中所详述的方法， 结合公式 ECF ＝ ((F/100-F)^1/H)*EC50 来获得氧代 震颤素的 EC90 值。在刺激板中制备 3x ECF 浓度的氧代震颤素， 从而将 EC90 浓度的氧代震颤 素添加到拮抗剂抑制分析板的各孔中。
用于 FLIPR 的参数是 ： 0.4 秒的暴露时间长度、 0.5 瓦特的激光强度、 488nm 的激发 波长和 550nm 的发射波长。 在添加激动剂之前， 通过测量荧光在 10 秒中的变化来确定基线。 在激动剂刺激之后， 在 1.5 分钟内 FLIPR 每 0.5 秒到 1 秒连续测量荧光变化以捕获最大荧 光变化。 荧光变化表示为各孔的最大荧光减去基线荧光。 通过非线性回归用格拉夫派得普 锐斯 ( 格拉夫派得软件公司， 加利福尼亚州圣地亚哥 ) 使用 S 形剂量 - 反应的内建模型根 据药物浓度的对数来分析原始数据。 根据程 - 普鲁萨福方程 ( 程和普鲁萨福， 1973) 通过普 锐斯来测定拮抗剂 Ki 值， 其中使用氧代震颤素 EC50 值作为 KD 并使用氧代震颤素 EC90 作为配 体浓度。
在此分析中， 较低 Ki 值表示测试化合物对所测试受体具有较高功能性活性。已发 现， 式 I 化合物在此分析或类似分析中测试时在稳定表达 hM3 受体的 CHO 细胞中阻断激动 剂调介钙释放的 Ki 值小于约 5nM。
分析 3
大鼠艾因托芬分析
使用此活体内分析来评定表现毒蕈碱受体拮抗活性的测试化合物的支气管保护 效应。将所有测试化合物均稀释于无菌水中并通过吸入途径 (IH) 给予。使大鼠 ( 斯普 拉 - 道来氏 (Sprague-Dawley)， 雄性， 250-350g) 暴露于从 LC 星式 (Star) 雾化器组产生并 通过气体混合物 (5％ CO2/95％大气 ) 喷出的气溶胶中。经 10 分钟时间段在能够容纳 6 只 大鼠的扇形投药室中雾化各测试化合物溶液。 在吸入化合物后的预定时间点执行艾因托芬 分析。
在开始实施肺评估前 30 分钟， 用仲丁硫巴比妥 (inactin)( 仲丁硫巴比妥钠 (thiobutabarbital)， 120mg/kg IP) 来麻醉动物。将填充有盐水的聚乙烯导管 (PE-50) 插 入颈静脉中并使用其来输注 MCh。随后剖开气管并插入 14G 针头以供在肺评估期间给大鼠 换气。 在手术完成后， 使用活塞式呼吸器给大鼠换气， 将所述活塞呼吸器设置为每搏输出量 为 1ml/100g 体重但不超过 2.5ml 体积， 并且速率为 90 搏 / 分钟。
测量每次呼吸时产生的压力变化。经至少 2.5 分钟收集基线值， 随后以非累积方 式使用 2 倍递增的支气管收缩性 MCh(5、 10、 20、 40 和 80μg/ml) 激发大鼠。经 2.5 分钟以 2mL/kg/min 的速率用注射泵输注 MCh。在研究完成后将动物无痛致死。
将所治疗动物的换气压力 (cm H2O) 变化表示为相对于对照动物对 MCh 反应的抑 制％。在此分析中， 较高抑制％值表示测试化合物具有支气管保护效应。预期在此分析中 以 100μg/ml 剂量测试时式 I 化合物表现大于 35％的抑制， 可能大于 70％的抑制， 并且甚 至更可能大于 90％的抑制。
1.5hr ID50 测定
在大鼠艾因托芬分析中于投用后 1.5hr 对标准物蕈碱拮抗剂实施评估。经测定， 所测试 5 种标准物的效能 (ID50s) 大小顺序为 ： 异丙托铵 (4.4μg/ml) ＞噻托溴铵 (6μg/ ml) ＞去甲基噻托溴铵 (12μg/ml) ＞格隆溴铵 (15μg/ml) ＞ LAS-34237(24μg/ml)。在 投用后 1.5hr 以类似方式测定测试化合物的效能。
6hr 和 24hr ID50 测定
也在大鼠艾因托芬分析中在投用后 24hr 和 / 或 6hr 对标准物噻托溴铵和异丙托 铵实施评估。在投用后 6hr 异丙托铵 (10 和 30μg/ml) 的效能是其投用后 1.5hr 的约 1/3。 在此时间点 (6hr) 所观察到的活性降低与临床上其作用持续时间相对较短一致。噻托溴铵 显示较迟开始发挥效应， 其在投用后 6hr 达到支气管保护的峰值。其在 6hr 和 24hr 的效能 值之间无显著差异， 并且都为其 1.5hr 效能的约 2 倍。以类似方式测定测试化合物的作用 起点以及 6hr 和 24hr 的效能值。
分析 4
大鼠止涎分析
如分析 3 中所述对大鼠 ( 斯普拉 - 道来氏， 雄性， 250-350g) 进行投药， 麻醉和插入 导管。 在预定时间点和手术后， 将动物背侧朝下放置， 使其头部向下倾斜 20°。 将预先称重 的纱布垫插入动物口腔中并投与毒蕈碱激动剂毛果芸香碱 (PILO)(3mg/kg， 静脉内 )。通过 测定投与 PILO 之前和之后纱布垫的重量以比重测定方式来测量投与 PILO 后 10 分钟期间 所产生的唾液。止涎效应表示为相对于对照动物对唾液分泌的抑制％。
1hr、 6hr 和 24hr ID50 测定
实施大鼠止涎分析以评价全身暴露量并计算测试化合物的肺选择性指数 (LSI)。 在此模型中与投用后 1hr、 6hr 和 24hr 对标准物噻托溴铵实施评估。已发现， 在投用后 6hr 噻托溴铵抑制毛果芸香碱诱导唾液分泌的效能最强。 此发现与在艾因托芬分析中观察到的 峰值效应一致。
此模型是瑞车德 (Rechter)， “通过拮抗毛果芸香碱诱导的唾液分泌来估算小鼠 中的抗胆碱能药物效应 (Estimation of anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced salivation)” ， 药理学与毒理学杂志 (Acta Pharmacol Toxicol)24 ： 243-254(1996) 中所述程序的修改形式。计算在各预处理时间媒 剂处理动物中的平均唾液重量， 并使用其来计算在对应预处理时间每种剂量对唾液分泌的 抑制％。
预期在此分析中测试的本发明实例性化合物表现小于 100μg/ml( 在第 24 小时 测量 ) 的 ID50 值， 其中预期某些化合物表现小于 30μg/ml 的 ID50 值， 某些化合物表现小于 20μg/ml 的 ID50 值， 并且某些表现小于 15μg/ml 的 ID50 值。
使用止涎 ID50 与支气管保护 ED50 的比来计算测试化合物的表观肺选择性指数。 通 常， 优选化合物的表观肺选择性指数大于约 5。尽管已参考本发明的特定方面或实施例来描述本发明， 但所属领域技术人员应理 解， 在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下可进行各种改变或可取代等效内容。 此外， 根据适用专利法和条例所允许的程度， 本文中所引用的所有出版物、 专利和专利申请案都 是全文以引用方式并入本文中， 其并入程度如同各文件都单独地以引用方式并入本文中一 般。