技术领域
本发明涉及用于制备带有马来酰亚胺官能团的水溶性和非肽的 聚合物的方法，特别是用于制备马来酰亚胺封端的聚(乙二醇)聚合 物的方法，并且涉及包括所述聚合物的组合物和制剂。
发明背景
马来酰亚胺是具有多用途的衍生物，其广泛地用于化学合成、生 物和药理用途。马来酰亚胺作为迈克尔受体，易与巯基反应形成稳 定的硫醚键。与其中同时存在巯基和胺基的蛋白质等的这种反应被 广泛应用。在大约为中性的pH下，马来酰亚胺具有高度的选择性， 巯基的反应性比胺基的反应性高约1,000倍(Smyth等，Biochem.J.， 91，589，1964；Gorin等.Arch.Biochem.Biophys.115，593，1966； Partis等，J.Protein Chem，2，263-277，1983)。在8或8以上 的较高pH值下，马来酰亚胺与胺基的反应开始具有显著的竞争性 (Brewer和Riehm，Anal.Biochem.18，248，1967)。
尽管马来酰亚胺是公知的迈克尔受体，但因其反应性还用作亲双 烯体(Baldwin等，Tetrahedron Lett.，32，5877，1991；Philp 和Robertson，J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1998，879；Bravo 等，Heterocycles，53，81，2000)和亲偶极物(Grigg等，J.Chem. Soc.，Perkin Trans.1，1988，2693；Konopikova等，Collect. Czech.Chem.Commun.，57，1521，1991；Philp和Booth， Tetrahedron Lett.，39，6987，1998)。
可以使用马来酰亚胺基团来促使蛋白质和其他分子共价连接于 聚合物。例如，通常使用亲水性聚合物“聚(乙二醇)”(缩写为“PEG”) 来轭合生物活性分子，而使得所述生物活性分子可溶于水性介质 (Harris等.“Poly(Ethylene Glycol)Chemistry and Biological Applications”，ACS Symposium Series，ACS，Washington，DC， 1997)。PEG-马来酰亚胺是适合与生物活性分子上的巯基或胺基反 应的反应性聚合物的例子。
许多用于制备PEG马来酰亚胺的方法包括将活化的PEG与包含马 来酰亚胺基团的小的连接体分子相连，所述连接体分子大多数在商 业上可获得。一些已知的PEG马来酰亚胺及其生产方法具有许多缺 点。例如，通常采用两种方法中的一种来从PEG胺直接制备所谓的 “无连接体”PEG马来酰亚胺，即，PEG和马来酰亚胺基团之间无连 接基团(参见美国专利第6,602,498号)。但是，这些方法一般得 到相对不纯的产物，原因如下将讨论的，在终产品中存在数量相当 多的含有开环马来酰胺酸的衍生物。
在美国专利第6,602,498号所公开的第一种方法中，水溶性和 非肽的聚合物骨架与马来酐反应形成开环的羧酸酰胺中间体(马来 酰胺酸中间体)。然后在第二步骤中，通过在乙酸酐和乙酸盐(如 乙酸钠或乙酸钾)存在下将所述中间体加热到约50℃至约140℃的 温度大约0.2小时至大约5小时，而闭合所述中间体的环。将这种 二步法概括于以下给出的反应图解I中：
反应图解I
由该方法制备的、含有马来酰亚胺封端的水溶性聚合物粗品的组 合物可以包括大量开环的马来酰胺酸中间体。所述开环的马来酰胺 酸中间体的外观的主要成因在于加热步骤，尤其是在乙酸酐中产生 或污染任何酸性物质时。在这些条件下，如果可能的话，就会使C＝C 键异构化并由此造成环闭合困难。因此，希望通过某些能够去除杂 质的方法来纯化聚合物产品，其中所述方法如离子交换色谱法。然 而，马来酰亚胺环系统不能耐受具有碱性或亲核部位的色谱柱，由 此使得纯化更加困难。该合成途径的第二个问题源于PEG胺的使用。
同样地，Sakanoue等人的美国专利申请公布文本No. 2003/0065134 A1描述了相关的方法，不同之处在于其中生成的PEG- 马来酰亚胺在最后的PEG氧与马来酰亚胺氮之间所包括的是丙烯基 而不是乙烯基。但是，Sakanoue等人描述的方法面临如上所述的相 同问题。此外，该参考文献教导PEG胺一般是通过使用氢和镍催化 剂来还原腈基而制备的，其可能因胺产物与亚胺中间体之间的反应 而导致引入另外的杂质。
在美国专利第6,602,498号所描述的第二种合成途径(“含水 的N-烷氧羰基马来酰亚胺途径”)中，N-烷氧羰基马来酰亚胺与聚 胺反应形成马来酰亚胺封端的水溶性聚合物产品。开环和闭环反应 在以上描述的相似条件下进行。该反应在缓慢增加的温度梯度下于 pH约8.5的碳酸氢钠水性缓冲液中进行。然而，马来酰亚胺基团在 那些条件下不稳定，其被水解为马来酰胺酸。因此，在合成期间存 在两种平行反应：马来酰亚胺环的形成和马来酰亚胺环的水解。
用于解决此问题的一种方法是在形成最大量的马来酰亚胺封端 的水溶性聚合物产物的同时，停止该反应。尽管这种方法理论上显 得有道理，但是因改变反应温度而使得其在商业实践上几乎是不可 能的任务，其中很难在连续生产批次间重复实现该温度梯度。例如， 发现某些马来酰亚胺封端的水溶性聚合物在商业上的连续批次具有 的马来酰亚胺纯度为65％至80％，马来酰胺酸的含量为约20％至35％。 同样，因马来酰亚胺基团对离子交换柱官能团的敏感性，而使得色 谱法并不是可行的选择。此外，即使可能再现地控制此温度梯度并 在适当的时间停止反应，该方法也需要中止监控和关闭另外的设备 (如，热电偶、加热套，等等)，从而增加了该方法的复杂性。
国际专利公布文本WO 05/056636描述了用于制备马来酰亚胺封 端的水溶性聚合物的其他方法。在一种方法(以下标为“反应图解 II”)中，包括离去基团(“LG”)的聚合物与亚胺盐(显示为三 环酰胺的钾盐)经由亲核取代反应，形成聚合物中间体，然后通过 反向第尔斯-阿尔德反应得到马来酰亚胺官能化的聚合物和呋喃。
反应图解II
尽管以上显示的反应利用相对简单的官能化的聚合物和第尔斯-阿 尔德加成物试剂来反应形成所谓的“无连接体”马来酰亚胺(指马 来酰亚胺基团直接与聚合物相连)，但是该反应需要商业上不可获 得的试剂。
尽管具有以上描述的方法，但是仍需提供其他用于制备马来酰亚 胺封端的水溶性聚合物的方法，以便例如可以使用最适于特定需求 的方法。除了别的以外，认为本文描述的新方法提供了高收率的马 来酰亚胺封端的聚合物，并且该聚合物不含大量聚合杂质，特别是 使用常规的纯化技术(如离子交换色谱法)不能轻易除去的大量聚 合物杂质。
发明内容
在一个或多个实施方案中，提供了用于制备取代的马来酰胺酸封 端的水溶性聚合物的方法，所述方法包括：
a)在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚 胺试剂结合，以形成取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物；和
a′)任选地，分离所述取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物。
在一个或多个实施方案中，提供了用于制备马来酰亚胺封端的水 溶性聚合物的方法，所述方法包括：
a)在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚 胺试剂结合，以形成取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物；和
b)在大体上非水的条件下，将所述马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物暴露于消除条件，从而得到马来酰亚胺封端的水溶性聚合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了含有马来酰亚胺封端 的水溶性聚合物的组合物，所述组合物由包括以下步骤的方法产生：
a)在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚 胺试剂结合，以形成马来酰胺酸封端的水溶性聚合物；和
b)在大体上非水的条件下，将所述马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物暴露于消除条件，从而得到含有马来酰亚胺封端的水溶性聚合物 的组合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了用于制备含有轭合物 的组合物的方法，所述方法包括将含有巯基的生物活性剂与本文所 提供的马来酰亚胺封端的水溶性聚合物结合，从而得到含有轭合物 的组合物。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了含有轭合物的组合 物，所述组合物由包括以下步骤的方法产生：将含有巯基的活性剂 与本文所提供的含有马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的组合物结 合。
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了化合物，所述化合物 为分离的形式，其具有以下结构：
(式I)
其中：
POLY是水溶性聚合物；
(b)是0或1；
其中存在的X1是间隔部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
(a)是从1至20的整数；
在各种情况下，R1独立地为H或有机基；
在各种情况下，R2独立地为H或有机基；
在各种情况下，R3独立地为H或有机基；和
在各种情况下，R4独立地为H或有机基。
发明详述
在详细地描述本发明的一个或多个实施方案之前，应理解的是本 发明不受限于特定的聚合物、试剂等，因为这些可以改变。
应注意的是，如本说明书和权利要求所使用的单数形式“一(a)”、 “一(an)”和“所述(the)”包括复数对象，除非上下文以其他 方式清楚地指明。因此，例如，所提及的“聚合物”包括一种聚合 物和两种或多种相同或不同的聚合物，所提及的“干燥剂”是指一 种干燥剂和两种或多种相同或不同的干燥剂，等等。
在描述和要求本发明的权利时，将依据以下给出的定义使用下列 术语。
如本文所使用的“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”可互 换。通常，依据本发明使用的PEG包括以下结构：“-(OCH2CH2)n-”， 其中(n)是2至4000。如本文所使用的PEG还包括 “-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)nO-，其取决于末端 氧是否已被置换。应注意，遍及整个说明书和权利要求的术语“PEG” 包括具有不同末端基团或“封端”基团的结构。术语“PEG”还指含 有多数(即大于50％)的-OCH2CH2-或-CH2CH2O-重复亚基的聚合物。就 具体形式而言，PEG可以采用有待在下文更详细描述的多种分子量中 的任何数值和结构或几何形状，如“支链”、“直链”、“叉状”、 “多官能的”等等。
术语“封端的”和“末端封端的”在本文可互换使用，其指具有 封端部分的聚合物的末端或端点。尽管不是必需的，但是所述封端 部分通常包括羟基或C1-20烷氧基，更优选C1-10烷氧基，还更优选C1-5烷氧基。因此，封端部分的实例包括烷氧基(如甲氧基、乙氧基和 苄氧基)和芳基、杂芳基、环、杂环，等等。必须注意的是，所述 封端部分可以包括聚合物中末端单体[如，CH3(OCH2CH2)n-中的封端部 分“甲氧基”]的一个或多个原子。此外，预想了前述每一种形式的 饱和、不饱和、取代和未取代的形式。其次，所述封端基团还可以 是硅烷。所述封端基团还可以有利地包括可检测的标记物。当聚合 物具有包括可检测的标记物的封端基团时，与所述聚合物偶联的聚 合物和/或部分(如，活性剂)的数量或位置可以通过采用合适的检 测器进行测定。这样的标记物包括，但不限于荧光增白剂、化学发 光剂、酶标记中使用的部分、比色部分(如染料)、金属离子、放射 性部分等。合适的检测器包括光度计、膜、分光计，等等。所述封 端基团还可以有利地包括磷脂。当聚合物具有包括磷脂的封端基团 时，其使得所述聚合物和得到的轭合物具有独特的性能。示例性的 磷脂包括，但不限于选自称为磷脂酰胆碱的磷脂类别的那些。具体 的磷脂包括，但不限于选自由二月桂酰磷脂酰胆碱、二油基磷脂酰 胆碱、二棕榈基磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山萮炔酰磷脂 酰胆碱(behenoylphosphatidylcholine)、花生四烯酸基磷脂酰胆 碱(arachidoyl phosphatidylcholine)和卵磷脂组成的组的那些。
如本文就聚合物描述的“非天然存在的”，是指自然界中完全不 存在的聚合物。但是，非天然存在的聚合物可以含有天然存在的一 个或多个单体或单体的片段，只要整个聚合物结构在自然界中不存 在即可。
如“水溶性聚合物”中的术语“水溶性”，是指在室温下可溶于 水的任何聚合物。通常，在过滤后，水溶性聚合物透射的光是相同 溶液过滤后透射的光的至少约75％，更优选至少约95％。以重量为基 础，水溶性聚合物在水中优选溶解至少约35％(按重量计)，更优选 在水中溶解至少约50％(按重量计)，还更优选在水中溶解约70％(按 重量计)，并且还更优选在水中溶解约85％(按重量计)。但是，所 述水溶性聚合物最优选在水中溶解约95％(按重量计)或在水中完全 溶解。
上下文中水溶性聚合物(如PEG)的分子量，可以表示为数均分 子量或重均分子量。除非另有说明，本文所有提及的分子量是指重 均分子量。数均分子量和重均分子量的测定，均可采用凝胶渗透色 谱法或其他的液相色谱技术进行测量。还可以使用其他用于测量分 子量值的方法，比如使用端基分析或测定依数性(如，冰点降低、 沸点升高或渗透压)来确定数均分子量，或使用光散射技术、超离 心法或粘度测定法来确定重均分子量。本发明的聚合物通常为多分 散(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，其所具有的 低多分散性值优选小于约1.2，更优选小于约1.15，还更优选小于 约1.10，仍更优选小于约1.05，最优选小于约1.03。如本文所使用 的，有时提及具有重均分子量或数均分子量的单种水溶性聚合物做 出参考；这样的提及应理解为是指由具有所述分子量的水溶性聚合 物组合物得到的单种水溶性聚合物。
当术语“活性”或“活化的”与特定的官能团一起使用时，是指 容易与另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这与那 些为了发生反应而需要强催化剂或极度不切实际的反应条件的基团 (即，“非反应性”基团或“惰性”基团)大不相同。
如本文所使用的术语“官能团”或其任何同义词，是指包括其受 保护的形式和未受保护的形式。
如本文所使用的术语“间隔部分”、“键”或“连接体”，是指 用来连接互连部分与活性剂或活性剂的亲电体或亲核体的原子或原 子集合，所述互连部分如聚合物的末端。所述间隔部分是水解稳定 的或者可包括生理上可水解的键或酶可降解的键。
“烷基”是指烃链，其长度范围一般为约1至15个原子。这样 的烃链优选但不是必须为饱和的，并且虽然一般优选直链，但是其 可以为支链或直链。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、 戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基，等等。如本文所使 用的“烷基”包括环烷基和含有环亚烷基的烷基。
“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基，且可为直链或支 链。低级烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丁基、异丁基和 叔丁基。
“环烷基”是指饱和或不饱和的环状烃链，其包括桥连的、稠合 的或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子构成，更优选由3至约 8个碳原子构成。“环亚烷基”是指通过环状的环系统中的任何两个 碳使链键合而插入烷基链的环烷基。
“烷氧基”是指-O-R基团，其中R为烷基或取代的烷基，优选 C1-6烷基(如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等)。
例如，在“取代的烷基”中的术语“取代的”，是指使用一个或 多个不相互干扰的取代基取代的部分(如烷基)，所述不相互干扰 的取代基例如，但不限于：烷基；C3-8环烷基，如环丙基、环丁基等； 卤素，如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基；低级苯基；取代的苯基 等。“取代的芳基”是指具有一个或多个不相互干扰的取代基的芳 基。对于苯环上的取代而言，所述取代基可以是任何取向(即，邻、 间或对)。
“不相互干扰的取代”是指在分子中存在时，通常不与所述分子 内含有的其他官能团发生反应的那些基团。
“芳基”是指分别具有5个或6个中心碳原子的一个或多个芳香 环。芳基包括多个稠合的芳环(如萘基)或未稠合的芳环(如联苯)。 芳环还可以与一个或多个环烃、杂芳基或杂环稠合或不稠合。如本 文所使用的“芳基”包括杂芳基。
“杂芳基”是指含有1至4个杂原子的芳基，所述杂原子优选为 硫、氧或氮，或其组合。杂芳环还可以与一个或多个环烃、杂环、 芳基或杂芳环稠合。
“杂环”或“杂环的”是指5-12个原子，优选5-7个原子的一 个或多个环，其具有或没有不饱和现象或芳香特征，且具有至少一 个不是碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
“取代的杂芳基”是指具有一个或多个不相互干扰的基团(如取 代基)的杂芳基。
“取代的杂环”是指具有由不相互干扰的取代基形成的一个或多 个侧链的杂环。
如本文所使用的“有机基”应包括烷基、取代的烷基、芳基和取 代的芳基。
“亲电体”和“亲电基团”是指可以为离子的、具有亲电中心(即 觅电子(electron seeking)的、能够与亲核体反应的中心)的离 子或原子或原子集合。
“亲核体”和“亲核基团”是指可以为离子的、具有亲核中心(即 觅亲电中心或能够与亲电体反应的中心)的离子或原子或原子集合。
“生理上可裂解的”或“可水解的”键是指在生理条件下与水反 应(即被水解)的键。优选的是在pH 8、25℃下具有小于约30分钟 的水解半衰期的键。键在水中水解的倾向不仅取决于连接两个给定 原子的键的一般类型，而且取决于连接在这两个给定原子上的取代 基。合适的水解不稳定或弱的键包括，但不限于羧酸酯、磷酸酯、 酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“酶可降解的键”是指经受一种或多种酶降解的键。
“水解稳定的”键(linkage)或键(bond)，是指在水中大体 上稳定，即，在延长的时间周期内于生理条件下不会经受任何明显 程度水解的化学键，其通常为共价键。水解稳定的键的实例包括， 但不限于以下：(如，在脂肪族链中的)碳-碳键、醚、酰胺、氨基 甲酸乙酯，等等。一般而言，水解稳定的键是指在生理条件下表现 出的水解速率低于约1-2％/天的键。具代表性的化学键的水解速率在 大多数标准的化学教科书中均可见到。
“药学上可接受的赋形剂”是指可任选地包括在组合物中且一经 施用对患者不造成显著毒副作用的赋形剂。
本文所使用的“治疗有效量”是指继施用后在血流或靶组织中产 生期望的轭合物(或相应的非共轭活性剂)水平所需的轭合物量。 精确的量取决于多种因素并可容易由本领域技术人员进行确定，所 述因素如特定的活性剂、治疗组合物的组分和物理特性、预期的患 者群、递送的方式、个体患者的考虑，等等。
“多官能的”是指其中含有三个或多个官能团的聚合物，其中所 述官能团相同或不同。多官能的聚合物试剂通常含有的官能团数目 为以下范围中的一种或多种：约3-100个官能团、3-50个官能团、 3-25个官能团、3-15个官能团、3-10个官能团。聚合物骨架内的示 例性官能团数目包括3、4、5、6、7、8、9和10个官能团。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的可能或不可能发生的情 况，因而所述描述包括所述情况发生的例子以及所述情况不发生的 例子。
“大体上”(除非其它地方的特定内容做出具体定义，或上下文 清楚地以其他方式指明)，是指接近全部或完全，例如，满足以下 的一种或多种：大于所述条件的50％、51％或更大、75％或更大、80％ 或更大、90％或更大以及95％或更大。
短语“大体上非水的条件”是指具有少于百万分之10,000的水 (少于1％)，更优选具有少于百万分之1,000的水(少于0.1％)， 还更优选少于百万分之100的水(少于0.01％)，还更优选少于百万 分之10的水(少于0.001％)的组合物或反应介质。优选地，但不是 必须地，大体上非水的条件包括惰性气氛。
除非上下文以其他方式清楚地指明，当术语“约”在数值之前时， 该数值理解为所述数值的平均值±10％。
用于制备取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物的方法
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了用于制备取代的马来 酰胺酸封端的水溶性聚合物的方法。所述方法包括：
a)在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚 胺试剂结合，以形成取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物；和
a′)任选地，分离所述取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物。
所述结合步骤需要作为原材料的胺封端的水溶性聚合物。如本文 所使用的“胺封端的水溶性聚合物”是指含有至少一个胺基(“-NH2”) 的任何水溶性聚合物，而不考虑所述胺基实际上是否位于所述水溶 性聚合物的末端。通常，但不是必须地，所述胺封端的水溶性聚合 物可以只有一个胺基，而且所述胺封端的水溶性聚合物也可以具有 超过一个的胺基。因此，所述胺封端的水溶性聚合物(例如)具有 的胺基总数可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9和10中的任何一种。
示例性的胺封端的水溶性聚合物包括以下结构： POLY-(X2)c-NH2
(式II)
其中：
POLY是水溶性聚合物(优选直链或支链的，且优选为 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中当POLY为直链时，(n)是2至4000)；
(c)是0或1(优选0)；和
其中存在的X2是间隔部分，
所述结合步骤还需要马来酰亚胺试剂。马来酰亚胺试剂是一经与 胺封端的水溶性聚合物结合，即导致以下一种形成的试剂：马来酰 亚胺封端的水溶性聚合物或取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物。
示例性的马来酰亚胺试剂包括以下结构：
(式III)
其中：
Y1是O或S(优选O)；
Y2是O或S(优选O)；
(a)是从1至20的整数(优选1或2)；
在各种情况下，R1独立地为H或有机基(优选H)；
在各种情况下，R2独立地为H或有机基(优选H)；
在各种情况下，R3独立地为H或有机基(优选H)；和
在各种情况下，R4独立地为H或有机基(优选H)。
优选的马来酰亚胺试剂是N-烷氧羰基马来酰亚胺，特别地其中 的烷氧基是低级烷氧基。优选的N-烷氧羰基马来酰亚胺是以下显示 的N-甲氧羰基马来酰亚胺：
(式IV)
所述结合步骤包括将所述胺封端的水溶性聚合物与所述马来酰 亚胺试剂接触，其可采用本领域普通技术人员已知的任何方法来实 现。例如，可将包括胺封端的水溶性聚合物的组合物与包括马来酰 亚胺试剂的组合物在反应容器中结合。但是，该结合步骤的实施是 使引入的水减到最少。
继结合步骤之后，用于制备取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物的方法任选地包括分离所述取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物的步骤。
当预期分离所述取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物(并由此 实施分离所述取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物的任选步骤) 时，可以使用任何本领域已知的技术来分离所述取代的马来酰胺酸 封端的水溶性聚合物，并且在这点上本发明不受到限制。例如，可 以使用选自由色谱法(如，硅胶色谱法、HPLC色谱法、亲合色谱法、 离子交换色谱法，等等)、电泳、沉淀(例如，包括重结晶)和提 取组成的组的分离技术，来分离所述取代的马来酰胺酸封端的水溶 性聚合物。优选的分离技术是可以采用本领域已知的方法(比如添 加过量的异丙醇、二乙醚、MTBE、庚烷、THF、己烷等，以使产物沉 淀)实现的沉淀。沉淀技术将获得干燥的取代的马来酰胺酸封端的 水溶性聚合物。也可以使用其他技术来得到干燥的取代的马来酰胺 酸封端的水溶性聚合物。
所述取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物可以采用任何数目 的形式。优选的形式是取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物，其 包括以下结构：
(式I)
其中：
POLY是水溶性聚合物；
(b)是0或1；
其中存在的X1是间隔部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
(a)是从1至20的整数；
在各种情况下，R1独立地为H或有机基；
在各种情况下，R2独立地为H或有机基；
在各种情况下，R3独立地为H或有机基；和
在各种情况下，R4独立地为H或有机基。
优选的，以分离的形式提供取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物是指组合物，其中在所述组合物的所有聚合物物质中，有至少约 70％(更优选至少80％，最优选至少90％)为取代的马来酰胺酸封端 的水溶性聚合物形式(而不是胺封端的水溶性形式或马来酰亚胺封 端的水溶性聚合物形式)。
在使用任何分离的取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物之前， 通常进行再溶解所述分离的(一般为干燥的)取代的马来酰胺酸封 端的水溶性聚合物的另外步骤，以在非水液体系统中复原所述马来 酰胺酸封端的水溶性聚合物。
所述方法用来制备马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的步骤通常 在有机溶剂中进行。虽然可以使用任何的有机溶剂并且本发明在这 点上不受到限制，但是示例性的有机溶剂包括那些选自由以下组成 的组的溶剂：卤代的脂肪族烃、醇、芳香烃、醇、卤代的芳香烃、 酰胺(包括DMF)、腈(包括乙腈)、酮(包括丙酮)、乙酸酯(包 括乙酸乙酯)、醚、环醚，及其组合。优选的有机溶剂的实例包括 选自由以下组成的组的那些：亚甲基氯(或二氯甲烷)、氯仿、辛 醇、甲苯、甲基叔丁基醚、THF(四氢呋喃)、乙酸乙酯、碳酸二乙 酯、丙酮、乙腈、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO、二甲基乙酰胺、N- 环己基吡咯烷酮、环己烷及其组合。
除了别的以外，用于制备取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物 的方法具有提供用于形成马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的中间体 的效用(如本文所讨论的)。通过施行此方法，有可能从胺封端的 水溶性聚合物得到更高的、可再现收率的取代的马来酰胺酸封端的 水溶性聚合物，从而提供更纯的中间体，并由其形成更纯的马来酰 亚胺封端的聚合物的组合物和相应的轭合物组合物。此外，针对组 合物提供了使组合物中具有更少的基于马来酰胺酸的杂质的方法。
用于制备马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的方法
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了用于制备马来酰亚胺 封端的水溶性聚合物的方法，所述方法包括：
a)在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚 胺试剂结合，以形成取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物；和
b)在大体上非水的条件下，将所述马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物暴露于消除条件，从而得到马来酰亚胺封端的水溶性聚合物。
在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚胺 试剂结合，以形成取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物的所述步 骤，可以如以上就用于制备取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物 的方法所描述的进行。
所述结合步骤一经实施，当前用于制备马来酰亚胺封端的水溶性 聚合物的方法还包括分离和再溶解取代的马来酰胺酸封端的水溶性 聚合物的任选步骤。这些任选的步骤中的每一项(任选的分离步骤 和任选的再溶解步骤)均可如以上就用于制备取代的马来酰胺酸封 端的水溶性聚合物的方法所描述的进行。
当前用于制备马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的方法的步骤包 括将马来酰胺酸封端的水溶性聚合物暴露于消除条件的步骤，该步 骤包括加热所述马来酰胺酸封端的水溶性聚合物。可以使用本领域 已知的任何消除条件，并且在这点上本发明不受限制。例如，合适 的消除条件包括在大于至少约35℃，更优选至少约40℃的温度回流 酸封端的水溶性聚合物。
暴露于消除条件还可以包括从所述反应介质中除去水，其通过例 如将所述马来酰胺酸封端的水溶性聚合物暴露于干燥剂(如，添加 Na HCO3、Na2CO3、CaCl2、CaSO4、MgSO4、KOH、Na2SO4、K2CO3、KHCO3及其组合)、分子筛(如，硅酸铝)、共沸蒸馏及任何前述的组合。
还可使用催化剂来促进所述方法的动力学。基于这点考虑，优选 在催化剂(如非亲核的胺催化剂或碱性催化剂)存在下，实施当前 用于制备马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的方法。就非亲核的胺催 化剂而言，优选空间位阻的非亲核的胺催化剂。非亲核的胺催化剂 的实例包括选自由以下组成的组的那些：DMAP(N，N-二甲基-4-氨基 吡啶)、DBU(1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯)、DABCO(1，4- 二氮杂双环[2.2.2]辛烷)、二异丙基乙胺、三乙胺、正甲基吗啉。 空间位阻的非亲核的胺催化剂的实例包括DMAP(N，N-二甲基-4-氨基 吡啶)、DBU(1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯)、DABCO(1，4- 二氮杂双环[2.2.2]辛烷)和二异丙基乙胺。碱性催化剂的实例包括 碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾。
所述方法用来制备马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的步骤通常 在有机溶剂中进行。虽然可以使用任何的有机溶剂并且本发明在这 点上不受到限制，但是示例性的有机溶剂包括那些选自由以下组成 的组的溶剂：卤代的脂肪族烃、醇、芳香烃、醇、卤代的芳香烃、 酰胺(包括DMF)、腈(包括乙腈)、酮(包括丙酮)、乙酸酯(包 括乙酸乙酯)、醚、环醚，及其组合。优选的有机溶剂的实例包括 选自由以下组成的组的那些：亚甲基氯(或二氯甲烷)、氯仿、辛 醇、甲苯、甲基叔丁基醚、THF、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、丙酮、乙 腈、DMF、DMSO、二甲基乙酰胺、N-环己基吡咯烷酮、环己烷及其组 合。
马来酰亚胺封端的水溶性聚合物可以具有多种结构，并且将取决 于衍生其的取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物的结构。依据本 方法制备的示例性马来酰亚胺封端的水溶性聚合物应具有以下结 构：
(式V)
其中每一POLY、X2和(c)如式II所给的定义，每一R3和R4如式III 所给的定义。
特别优选的马来酰亚胺封端的水溶性聚合物应包括以下结构：
(式VI)
其中(n)是从2至约4000的整数。
含有马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的组合物
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了含有马来酰亚胺封端 的水溶性聚合物的组合物，所述组合物由包括以下的方法产生：
a)在大体上非水的条件下，将胺封端的水溶性聚合物与马来酰亚 胺试剂结合，以形成马来酰胺酸封端的水溶性聚合物；和
b)在大体上非水的条件下，将所述马来酰胺酸封端的水溶性聚合 物暴露于消除条件，从而得到含有马来酰亚胺封端的水溶性聚合物 的组合物。
因此，包括在本发明内的是依据所提供的方法形成的马来酰亚胺 封端的水溶性聚合物的组合物。认为由该方法得到的组合物的纯度 比先前已知的方法得到的更高。具体地，含有马来酰亚胺封端的水 溶性聚合物的组合物具有相对低百分比的马来酰胺酸封端的水溶性 聚合物(如，一般小于4％，经常小于2％)。此外，含有马来酰亚胺 封端的水溶性聚合物的组合物大体上不含呋喃，优选完全不含呋喃。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有马来酰亚胺封端的水 溶性聚合物的组合物，这样的组合物包括聚合物物质，其中在所述 组合物中，有至少70％的所述聚合物物质为马来酰亚胺封端的水溶性 聚合物，并且进一步地，其中所述组合物包括开环的酯聚合物物质。 所述开环的酯聚合物物质具有以下结构
(式Ia)
其中每一POLY、X1、(a)、(b)、R1、R2、R3、R4、Y1和Y2如就式I所 定义的。未发现这种“开环的酯”与用于制备马来酰亚胺封端的水 溶性聚合物的基于含水的N-烷氧羰基马来酰亚胺途径有关。
用于制备含有轭合物的组合物的方法
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了用于制备含有轭合物 的组合物的方法，所述方法包括(在反应容器中)将含有巯基的生 物活性剂(如含有半胱氨酸的蛋白质或多肽)与本文所提供的马来 酰亚胺封端的水溶性聚合物的组合物结合，从而得到含有轭合物的 组合物。尽管已经描述了用于将马来酰亚胺封端的水溶性聚合物与 含有巯基的生物活性剂共轭的方法，但是示例性的方法包括将所述 马来酰亚胺封端的水溶性聚合物溶解于去离子水中，以制备10％的试 剂溶液，并与含有巯基的生物活性剂结合(聚合物与含有巯基的生 物活性剂相比，摩尔数过量5至20倍)且充分混合。在室温下反应 大约1小时后，冷却反应管形瓶并混合约12小时，以确保充分的反 应时间。该反应的pH可以控制在约7。
因此，包括在本发明内的是采用本发明具创造性的马来酰亚胺封 端的水溶性聚合物的组合物来制备含有轭合物的组合物的方法。含 有巯基的活性剂可以是含有半胱氨酸残基的任何蛋白质，所述半胱 氨酸残基不参与蛋白质内的二硫化物结合。
含有轭合物的组合物
在本发明的一个或多个实施方案中，提供了含有轭合物的组合 物，所述组合物由包括以下的方法产生：将含有巯基的活性剂与本 文所提供的含有马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的组合物结合。
因此，包括在本发明内的是依据所提供的用于制备含有轭合物的 组合物的方法形成的含有轭合物的组合物。认为由该方法得到的组 合物的纯度比先前已知的方法得到的更高。与用来生成它们的马来 酰亚胺封端的水溶性聚合物的组合物一样，所述含有轭合物的组合 物具有相对低百分比的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物(如，一般 小于4％，经常小于2％)。此外，含有轭合物的组合物大体上不含呋 喃，优选完全不含呋喃。
水溶性聚合物(“POLY”)
如本文所使用的术语“水溶性聚合物”包括那些生物相容的和非 免疫原性的水溶性聚合物，其明确地排除了不是生物相容的和不是 非免疫原性的任何水溶性聚合物片段。就生物相容性而言，如果通 过临床医生(如内科医生)的评价，物质单独使用或与另一种物质 (如活性剂)一起使用在活组织(如，施用于患者)方面相关的有 益效果优于任何有害的效果，那么就认为该物质是生物相容的。就 非免疫原性而言，如果物质在体内的预期使用不产生不期望的免疫 反应(如，形成抗体)，或者即使产生免疫反应，这样的反应通过 临床医生的评价认为不是临床显著或重要的，那么就认为该物质是 非免疫原性的。特别优选的是，本文描述的水溶性聚合物片段以及 轭合物是生物相容的和非免疫原性的。
当提及聚合物时，应理解的是，所述聚合物可以是任何数目的水 溶性和非肽的聚合物，比如本文所描述的适用于本发明的那些。优 选地，所述聚合物为聚(乙二醇)(即PEG)。术语PEG包括的聚(乙二 醇)具有任何数目的几何形状或形式，其包括有待在下文更充分描述 的直链形式、支链形式或多臂形式(如叉状的PEG或与多元醇中心 相连的PEG)、侧链(pendant)PEG或其中具有可降解的键的PEG。
聚合物带有的官能团数目和官能团的位置可以改变。通常，所述 聚合物包括1至约25个官能团，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个官能团。诸如PEG聚合物的直链聚合物，通常包括位于聚合 物链末端的一个或两个官能团。如果PEG聚合物是单官能的(即， 直链mPEG)，则该聚合物应包括一个官能团。如果PEG聚合物是双 官能的，则该聚合物可以包括两个独立选定的官能团，每个官能团 位于聚合物链的每个末端。同样应理解的是，多臂或支链的聚合物 可包括更多数目的官能团。
还可以将诸如美国专利第5,932,462号中所描述的那些多臂或 支链的PEG分子用作PEG聚合物。一般而言，多臂或支链的聚合物 具有从中央支点伸出的两个或多个聚合物“臂”。例如，示例性的 支链PEG聚合物具有以下结构：
其中PEG1和PEG2是本文描述的任何形式或几何形状的PEG聚合物， 并且其可以相同或不同，L′是水解稳定的键。示例性的支链PEG具 有以下结构：
其中polya和polyb是PEG骨架，如甲氧基聚(乙二醇)；R″是非反应 性部分，如H、甲基或PEG骨架；P和Q是非反应性键。在优选的实 施方案中，支链的PEG聚合物是甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸。
支链的PEG结构可以与如下显示的第三低聚物或聚合物链相连：
其中PEG3是第三PEG低聚物或聚合物链，其与PEG1和PEG2相同或不 同。
PEG聚合物可选地包括叉状的PEG。一般而言，具有叉状结构的 聚合物的特征是具有聚合物链，所述聚合物链经由从聚合物中水解 稳定的支点伸出的共价键与两个或多个官能团相连。叉状的PEG的 例子由PEG-YCHZ2表示，其中Y是连接基团，Z是用于共价连接生物 活性剂的活化的末端基团。Z基团通过所定义长度的原子链与CH相 连。美国专利第6,362,254号公开了能够用于本发明的各种叉状的 PEG结构。将Z官能团(如羟基)与用作系留基团(tethering group) 的分支碳原子相连的原子链可包括，例如烷基链、醚键、酯键、酰 胺键，或其组合。
PEG聚合物可包括具有反应性基团(如羟基)的侧链PEG分子， 所述反应性基团沿着PEG骨架的长度而不是在PEG链的端部共价相 连。侧链的反应性基团可直接或通过连接部分(如亚烷基)来与PEG 骨架相连。
除了以上描述的PEG形式之外，所述聚合物(包括以上描述的聚 合物中的任何一种)还可制备成在聚合物骨架中具有一个或多个水 解稳定的或可降解的键。例如，可将PEG制备成在聚合物骨架中具 有经受水解的酯键。如下所示，这种水解导致聚合物裂解为低分子 量的片段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O→-PEG-CO2H+HO-PEG-
在聚合物骨架内用作可降解的键的其他水解可降解的键包括碳 酸酯键、由例如胺与醛反应得到的亚胺键(参见，如Ouchi等， Polymer Preprints，38(1)：582-3(1997))、由例如醇与磷酸基团 反应形成的磷酸酯键、通常由酰肼与醛反应形成的腙键、通常由醛 与醇之间的反应形成的缩醛键、由例如酸衍生物与醇之间的反应形 成的原酸酯键，以及由例如聚合物端部的亚磷酰胺基团与寡核苷酸 的5′羟基形成的寡核苷酸键。由于多种不稳定的键与胺基的亲核反 应性，而使得上述多种可降解的键的使用是次优的。
本领域技术人员应理解的是，术语聚(乙二醇)或PEG代表或包括 上述所有形式的PEG。
本发明还可使用包括其他非肽和水溶性聚合物链的多种其他聚 合物中的任何一种。所述聚合物可以是直链的，或者可以是上述形 式中的任何一种(如，支链的、叉状的，等等)。合适的聚合物的 实例包括，但不限于如美国专利第5,629,384号所描述的其它聚(烷 撑二醇)、乙二醇和丙二醇的二元共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯 烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖 类)、聚(α-羟基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑 啉、聚(N-丙烯酰吗啉)及其二元共聚物、三元共聚物和混合物。
尽管所述水溶性聚合物的分子量可以根据所希望的应用、聚合物 结构的构型、分支的程度等等而改变，但是该分子量应满足以下值 中的一种或多种：大于100道尔顿、大于200道尔顿、大于400道 尔顿、大于500道尔顿、大于750道尔顿、大于900道尔顿、大于 1,000道尔顿、大于1,400道尔顿、大于1,500道尔顿、大于1,900 道尔顿、大于2,000道尔顿、大于2,200道尔顿、大于2,500道尔 顿、大于3,000道尔顿、大于4,000道尔顿、大于4,900道尔顿、 大于5,000道尔顿、大于6,000道尔顿、大于7,000道尔顿、大于 7,500道尔顿、大于9,000道尔顿、大于10,000道尔顿、大于11,000 道尔顿、大于14,000道尔顿、大于15,000道尔顿、大于16,000道 尔顿、大于19,000道尔顿、大于20,000道尔顿、大于21,000道尔 顿、大于22,000道尔顿、大于25,000道尔顿和大于30,000道尔顿。 应理解的是，本文给定的任何有用的水溶性聚合物片段的分子量最 高限值是小于约300,000道尔顿。
所述聚合物的分子量通常会落入以下的至少一种范围：约100 道尔顿至约100,000道尔顿、约200道尔顿至约60,000道尔顿、约 300道尔顿至约40,000道尔顿。
水溶性聚合物的示例性分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、 约300道尔顿、约350道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约 550道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800 道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200 道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约 4,400道尔顿、约5,000道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、 约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道 尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约 14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道 尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约 40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿和约75,000道 尔顿。
就支链形式的聚合物而言，聚合物合适的总分子量大小(基本上 基于两种水溶性聚合物部分的合并重量)的示例性范围包括以下： 约200道尔顿至约100,000道尔顿、约1,000道尔顿至约80,000道 尔顿、约2,000道尔顿至约50,000道尔顿、约4,000道尔顿至约 25,000道尔顿和约10,000道尔顿至约40,000道尔顿。更特别地， 本发明支链形式的聚合物的总重均分子量对应于以下的一种：400、 1,000、1,500、2,000、3000、4,000、10,000、15,000、20,000、 30,000、40,000、50,000、60,000或80,000。
就PEG而言，其中提供了包括重复的环氧乙烷单体，如 “-(CH2CH2O)n-”或“-(OCH2CH2)n”的结构，(n)的优选值包括：约3 至约3,000、约10至约3,000、约15至约3,000、约20至约3,000、 约25至约3,000、约30至约3,000、约40至约3,000、约50至约 3,000、约55至约3,000、约75至约3,000、约100至约3,000和 约225至约3,000。
间隔部分(“X1”、“X2”等等)
任选地，间隔部分可以将水溶性聚合物连接于马来酰亚胺，和/ 或从所述马来酰亚胺基部分连接于含有巯基的活性剂的残基。示例 性的间隔部分包括以下：-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、 -C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、 -CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、 -CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、 -CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、 -CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、 -CH2-CH2-CH2-CH 2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C( O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C( O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、 -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2- C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C( O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-C H2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-C H2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-N H-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-C H2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH- CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、 -CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-C H2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C( O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)- CH2-、-CH2-CH 2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-N H-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-、-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-N H-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-O-C(O)-CH2-、-O-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)- CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-C H2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二价的环烷基、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、O-C(O)-NH-[CH2]f-(OCH2CH2)n- 及任何前述中的两种或多种的组合，其中(f)是0至6，(n)是0至 20(优选0至10，如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优 选4)。此外，每一前述的含有碳的间隔部分具有与其相连的支链烷 基。二价环烷基(如，环亚烷基)的非限制性实例包括C3-8环烷基， 如环丙二基(cyclopropadiyl)(如，1，1-、顺式-11、2-或反式-1，2-环 丙烯)、环丁二基(cyclobutadiyl)、环戊二基(cyclopentadiyl)、 环己二基(cyclohexadiyl)和环庚二基(cycloheptadiyl)的各种 异构体。所述环亚烷基可以被一个或多个烷基取代，优选被C1-C6烷 基取代。
生物活性轭合物
本发明还包括稳定的生物活性轭合物，所述轭合物包括能够通过 琥珀酰亚胺环键进行迈克尔加成而共价连接于反应性聚合物的亲核 生物活性分子。该生物活性剂优选为含有巯基或氨基的蛋白质。
合适的生物活性剂可选自，例如安眠药和镇静药、精神兴奋剂、 安定药、呼吸系统药物、抗惊厥药、肌肉松弛药、抗帕金森剂(多 巴胺拮抗剂(antagnonists))、镇痛药、抗炎药、抗不安药(抗 焦虑药)、食欲抑制剂、抗偏头痛药、肌肉收缩剂、抗感染药(抗 生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)、抗关节炎药、抗疟疾药、止 吐药、抗癫痫药(anepileptics)、支气管扩张药、细胞活素类、 生长因子、抗癌剂、抗血栓药、抗高血压药、心血管药、抗心率失 常药、抗氧化剂(antioxicants)、平喘剂、激素类药物(包括避 孕药)、拟交感神经药、利尿药、调血脂药、抗雄激素剂、抗寄生 虫药、抗凝血药、肿瘤剂(neoplastics)、抗肿瘤药、降血糖药、 营养剂和营养添加剂、生长添加剂、抗肠炎剂、疫苗、抗体、诊断 用药和对比剂。
适合用来与本发明的反应性聚合物共价连接的活性剂的实例包 括，但不限于降钙素、红细胞生成素(EPO)、因子VIII、因子IX、 西利酶(ceredase)、伊米苷酶(cerezyme)、环孢菌素、粒细胞 集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(TPO)、o-1蛋白酶抑制剂、 依降钙素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、生长激素、人 生长激素(HGH)、生长激素释放激素(GHRH)、肝素、低分子量肝 素(LMWH)、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白细胞介素-1受体、 白细胞介素-2、白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-3、白细胞 介素-4、白细胞介素-6、促黄体激素释放激素(LHRH)、因子IX、 胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(如美国专利第5,922,675号所 描述的单乙酰代的胰岛素)、糊精、C-肽、促生长素抑制素、促生 长素抑制素类似物(包括奥曲肽)、加压素、滤泡刺激激素(FSH)、 胰岛素样生长因子(IGF)、促胰岛素激素(insulintropin)、巨 噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、组织生长 因子、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经胶质生长因子(GGF)、 肿瘤坏死因子(TNF)、内皮生长因子、甲状旁腺素(PTH)、高血 糖素样肽胸腺素α-1、IIb/IIIa抑制剂、α-1胰蛋白酶抑制药、磷 酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4抑制剂、二磷酸盐类、呼吸道合胞 病毒抗体、囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)基因、脱氧核糖核酸 酶(deoxyreibonuclease)(DNA酶)、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、 抗-CMV抗体、13-顺式视黄酸；大环内酯类，如红霉素、竹桃霉素、 醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、环酯红霉素(davercin)、阿 奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、 柱晶白霉素、米卡霉素、罗他霉素、andazithromycin和swinolide A；氟喹诺酮类，如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、 阿拉曲沙星、moxifloxicin、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加 替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、 氟罗沙星、托氟沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙 星和西他沙星；氨基葡糖苷，如庆大霉素、奈替米星、草履虫素、 妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、链霉素、万古霉素、替 考拉宁、rampolanin、麦地拉宁、粘菌素、达托霉素、短杆菌肽、 粘菌素甲烷磺酸钠；多粘菌素，如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、 表霉烯；青霉素，包括青霉素酶敏感的药剂，如青霉素G、青霉素V， 青霉素酶耐受的药剂，如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西 林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴性微生物活性剂，如氨苄西林、 阿莫西林、海他西林、cillin和galampicillin；抗假单胞青霉素 样羧苄青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢 菌素样头孢泊肟、头孢罗齐、头孢布坦(ceftbuten)、头孢唑肟、 头孢曲松、头孢金素、头孢匹林、头孢氨苄、cephradrine、头孢西 丁、头孢孟多、头孢唑林、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头 孢菌素III、头孢呋辛、头孢雷特、头孢噻肟、头孢曲秦、头孢乙腈、 头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、 头孢他啶、氯碳头孢、拉氧头孢和单环β-内酰胺类样氨曲南；碳青 霉烯类，如亚胺培南、美罗培南、依西酸戊双脒(pentamidine isethiouate)、沙丁胺醇、利多卡因、硫酸间羟异丙肾上腺素、二 丙酸倍氯米松(beclomethasone diprepionate)、曲安西龙乙酰胺 (triamcinolone acetamide)、布地奈德丙酮化物(budesonide acetonide)、氟替卡松、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠、麦角 胺；以及上述可应用的类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂和药学上 可接受的盐形式。提及肽和蛋白质时，本发明预期包括合成形式、 天然形式、糖基化的形式、未糖基化的形式、聚乙二醇化的形式， 及其生物活性片段和类似物。
本发明还包括药物制剂，所述药物制剂包括本文所提供的轭合物 和药物赋形剂。一般而言，所述轭合物本身为固体形式(如，沉淀)， 其可与固体或液体形式的合适的药物赋形剂结合。
示例性的赋形剂包括，但不限于选自由碳水化合物、无机盐、抗 微生物剂、抗氧化剂、缓冲剂、酸、碱及其组合组成的组的那些。
碳水化合物(如糖)、衍生化的糖(如糖醇、糖醛酸、酯化的糖) 和/或糖聚合物可作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括， 例如：单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨 糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子 糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；以及糖醇，如甘露 糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、 吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。
所述赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸、氯化钠、氯化 钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，及其组合。
所述制剂还可包括用于预防或抑制微生物生长的抗微生物剂。适 用于本发明的抗微生物菌的非限制性实例包括苯扎氯铵、苄索氯铵、 苯甲醇、西吡氯铵、三氯叔丁醇、酚、苯乙醇、硝酸苯汞、硫柳汞 (thimersol)，及其组合。
抗氧化剂也可存在于制剂中。抗氧化剂用来预防氧化，从而防止 所述制剂中的轭合物或其他组分降解。适合用于本发明的抗氧化剂 包括，例如抗坏血酸棕榈酸盐、丁羟茴香醚、丁羟甲苯、次磷酸、 硫代甘油、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸钠、偏重亚硫 酸钠，及其组合。
表面活性剂可作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山 梨醇酯，如“吐温20”和“吐温80”，和普卢兰类，如F68和F88 (两者均可从BASF，Mount Olive，New Jersey获得)；山梨糖酯； 脂质，如磷脂(比如卵磷脂)和其他的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺 (虽然优选为非脂质形式)、脂肪酸和脂肪酯；甾族化合物，如胆 固醇；螯合剂，如EDTA、锌和其他此类合适的阳离子。
酸或碱可作为赋形剂存在于所述制剂中。可使用的酸的非限制性 实例包括那些选自由以下组成的组的酸：盐酸、乙酸、磷酸、柠檬 酸、苹果酸、乳酸、甲酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、 富马酸，及其组合。合适的碱的实例包括，但不限于选自由以下组 成的组的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、氢氧化钾、乙酸铵、 乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、 富马酸钾(potassium fumerate)及其组合。
药物制剂包括所有类型的剂型，特别是适用于注射的那些，如可 重新溶解的粉末，以及悬浮液和溶液。组合物中轭合物(即，在本 文所描述的活性剂与聚合物之间形成的轭合物)的量将根据多种因 素而改变，但当该组合物在单位剂量容器(如，管形瓶)中贮存时 最佳的是治疗有效剂量。此外，所述药物制剂可封装在注射器中。 治疗有效剂量在实验上可通过重复施用递增量的轭合物以测定哪一 量产生临床上所希望的终点而确定。
组合物中任何一种赋形剂的量将根据所述赋形剂的活性和该组 合物的特定需求而改变。通常，任何一种赋形剂的最佳量通过常规 的实验确定，即，通过制备含有不同量赋形剂(范围从低到高)的 组合物，考察该组合物的稳定性和其他参数，然后确定获得最佳性 能而无显著副作用的范围。
然而，一般而言，所述赋形剂在组合物中存在的量为约1％至约 99％重量，优选约5％-98％重量，更优选约15-95％重量，其中最优选 小于30％重量的浓度。
这些前述的药物赋形剂连同其他赋形剂一起在″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″，19thed.，Williams & Williams， (1995)，the″Physician′s Desk Reference″，52nded.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd Edition，American Pharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000.中描述。
虽然不是必须的，但是本发明的药物制剂通常经由注射施用，因 而一般在施用之前即刻配制为液体溶液或悬浮液。所述药物制剂还 可采用其他的形式，如糖浆、乳膏、软膏剂、片剂、散剂，等等。 其他的施用方式还可包括，如肺部、直肠、经皮、经粘膜、口服、 膜内、皮下、动脉内等。
如前所述，所述轭合物可通过静脉内注射，或者次优地通过肌内 注射或通过皮下注射来进行胃肠外施用。除了别的以外，适合用于 胃肠外施用的剂型包括容易用于注射的溶液、在使用前与溶剂结合 的干燥粉末、容易用于注射的悬浮液、在使用前与载体结合的不溶 性干燥组合物、在施用前进行稀释的乳剂和液体浓缩物。
本发明还提供了用于将本文所提供的轭合物施用于患有响应于 轭合物治疗的病征(condition)的患者的方法。所述方法包括施用 (一般经由注射)治疗有效量的轭合物(优选作为药物制剂的一部 分提供)。该施用方法可用来治疗通过施用特定的轭合物可减轻或 预防的任何病征。本领域的普通技术人员应了解具体的轭合物可有 效治疗哪一种病征。有待施用的实际剂量将根据患者的年龄、体重、 大体状况，以及所治疗的病征的严重性、健康护理专业人员的判断 和所施用的轭合物而改变。治疗有效量为本领域技术人员已知和/或 在相关的参考教科书和参考文献中描述。通常，治疗有效量的范围 为约0.001mg至100mg，优选剂量为0.01mg/天至75mg/天，更 优选的剂量为0.10mg/天至50mg/天。
任何给定轭合物的单位剂量(再次声明，优选作为药物制剂的一 部分提供)可根据临床医生的判断、患者的需求等，以多种给药时 间表进行施用。具体的给药时间表应为本领域普通技术人员已知， 或可使用常规的方法通过实验确定。示例性的给药时间表包括，但 不限于每天施用5次、每天施用4次、每天施用3次、每天施用2 次、每天施用1次、每周3次、每周2次、每周1次、每月2次、 每月1次，及其任何组合。一旦到达临床终点，停止组合物的给药。
应理解的是，尽管本发明已连同其优选的具体实施方案一起进行 描述，但是前述的描述和随后的实施例只预期进行说明而不限制本 发明的范围。本发明范围内的其他方面、优势和改进对于本发明所 属领域的技术人员是显而易见的。尽管本文采用了具体的术语，但 是它们只属于通用和描述性的并且不用于限制的目的。
实验
除非另有说明，本发明的实施将采用有机合成、生物化学、蛋白 质纯化等常规技术，其均为所属领域的技术。这样的技术在文献中 均有充分的解释。参见，例如先前的J.March，Advanced Organic Chemistry：Reactions Mechanisms and Structure，第4版.(New York：Wiley-Interscience，1992)。
在以下的实施例中，努力确保所使用数字(如，量、温度等)的 准确度，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另有说明，温度为摄 氏度，压力为海平面的大气压或接近海平面的大气压。认为以下每 一实施例对本领域普通技术人员实施本文所描述的一个或多个实施 方案具有启示。所有1H NMR数据均由Bruker制造的300或400MHz NMR波谱仪产生。在实施例5至12中，所使用的商品级mPEG(20k Da)- 胺具有以下特征：胺的取代百分数为94.6％至100％；羟基mPEG杂质 的百分数为0％至4.2％；二聚物(由两个官能化的PEG物质相互反应 形成的物质)的百分数为0.6％至2.1％；三聚物(由三个官能化的PEG 物质相互反应形成的物质)的百分数为0％至0.3％。
实施例1
取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物的制备
将N-甲氧羰基马来酰亚胺(0.80g，0.0051mol)添加到mPEG (20k Da)-胺(Nektar Therapeutics，50.0g，0.0025mol)的 无水二氯甲烷(350ml)溶液中，并将该溶液在氩氛下室温搅拌1 小时。添加N，N-二异丙基乙胺(1.0ml)并将该混合物在氩氛下室 温搅拌过夜。其次通过馏出～200ml的二氯甲烷而浓缩该反应混合 物，并使用乙醚对产物进行沉淀。干燥后产量为46.3g。NMR(d6-DMSO)： 3.24ppm(s，PEG-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，3.86ppm(s， CH3O-NH-)，6.20ppm(m，-CH＝CH-)，8.46ppm(-NH).
实施例2
mPEG(20k Da)马来酰亚胺的制备
将N，N-二异丙基乙胺(10ml)添加到实施例1制备的取代的马 来酰胺酸封端的水溶性聚合物(10.0g)的无水乙腈(100ml)溶 液中，并将该反应混合物在氩氛下室温搅拌44小时。接下来，通过 馏出～80ml的乙腈而浓缩所述混合物，并使用乙醚对产物进行沉 淀得到8.5g的mPEG(20K Da)马来酰亚胺。NMR(d6-DMSO)：3.24ppm(s， PEG-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，7.01ppm(s，-CH＝CH-，马 来酰亚胺)；93.5％取代.
实施例3
用于制备取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物的实验方案
其中(就式II而论)：
POLY是水溶性聚合物(优选直链或支链的，且优选为 CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-，其中当POLY为直链时，(n)是2至4000)；
(c)是0或1(优选0)；和
其中存在的X2是间隔部分，
其中(就式III而论)：
Y1是O或S；
Y2是O或S；
(a)是从1至20的整数；
在各种情况下，R1独立地为H或有机基；
在各种情况下，R2独立地为H或有机基；
在各种情况下，R3独立地为H或有机基；和
在各种情况下，R4独立地为H或有机基，
其中(就式I而论)：
POLY是水溶性聚合物；
(b)是0或1；
其中存在的X1是间隔部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
(a)是从1至20的整数；
在各种情况下，R1独立地为H或有机基；
在各种情况下，R2独立地为H或有机基；
在各种情况下，R3独立地为H或有机基；和
在各种情况下，R4独立地为H或有机基。
将胺封端的水溶性聚合物(式II)溶解于二氯甲烷中(20％wt/v 溶液)，并在40℃减压蒸馏直到除去所有的二氯甲烷为止。这将形 成与水的共沸混合物，并有效地从剩余的聚合物中除去水。将该步 骤重复一次。如果需要，将其在真空下放置直至完全干燥为固体(并 非必须)。
在惰性气氛下，将聚合物重新溶解于无水二氯甲烷中(20％wt/v 溶液)。加入1.5当量的马来酰亚胺试剂(式III)。一旦溶解， 即逐滴加入0.5当量的二异丙基乙胺。使其在惰性气氛下室温搅拌 至少1小时(过夜最佳，但可能形成闭环的马来酰亚胺)。
在25-30℃减压馏出溶剂，直至得到浓稠的油状溶液为止(根据 分子量，大约0.5-1.5mL溶液/g水溶性聚合物)。向搅拌的溶液中 缓慢地添加异丙醇(大约25mL/g水溶性聚合物)。使其在室温搅 拌至少30分钟。滤掉液体。重新添加足量的异丙醇以便得到水溶性 聚合物的浆，然后再次滤掉液体。在真空下干燥固体直到除去所有 的异丙醇为止。
实施例4
用于制备马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的实验方案
其中(就式I而论)：
POLY是水溶性聚合物；
(b)是0或1；
其中存在的X1是间隔部分；
Y1是O或S；
Y2是O或S；
(a)是从1至20的整数；
在各种情况下，R1独立地为H或有机基；
在各种情况下，R2独立地为H或有机基；
在各种情况下，R3独立地为H或有机基；和
在各种情况下，R4独立地为H或有机基，
其中(就式V而论)POLY、X2和(c)各自如式II所给的定义，R3和 R4各自如式III所给的定义。
将来自实施例3的取代的马来酰胺酸封端的水溶性聚合物溶解 于无水二氯甲烷中，以制备10％wt/v的溶液。加入无水硫酸钠(0.5 g/g PEG)。加入无水碳酸钠(0.5g/g水溶性聚合物)。在 惰性气氛(约40℃)下加热回流。回流搅拌5小时。除热并使其冷 却至低于35℃。滤出固体。在25-40℃减压馏出溶剂，直至得到 浓稠的油状溶液为止。与实施例3一样，使用异丙醇进行沉淀。
实施例5
马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的非水制备
将共沸的mPEG(20k Da)-胺、0.01wt％丁羟甲苯(BHT)和二 氯甲烷在40℃混合。采用旋转蒸发仪蒸发更多的挥发性成分。检测 含水量，发现为56ppm(需要低于100ppm)。向每g这样的混合 物中分别加入0.5g磨碎的碳酸钠和粒状的硫酸钠。添加磨碎的碳 酸钠和粒状的硫酸钠之后，搅拌该混合物并冷却至5℃以形成冷的 PEG溶液。
单独地将3当量(0.56g)的N-甲氧羰基马来酰亚胺溶解于二 氯甲烷中以制备3％(w/v)的溶液。将所得的混合物涡旋30秒。涡 旋的混合物具有混浊的外观。将涡旋的混合物加入所述冷的PEG溶 液，并在5℃或约5℃搅拌21小时。
继搅拌之后，将该混合物逐渐地加热到大约40℃，并回流超过 45分钟。此后，取出样品通过H NMR来确定反应完全。
回流8.5小时后，使混合物冷却至室温，通过celite床过滤， 随后采用旋转蒸发仪在30℃的水浴中除去二氯甲烷溶剂，从而生成 油。产物通过使用异丙醇(IPA)进行沉淀而回收(搅拌30分钟)。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例6
马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的非水制备
重复实施例5的过程，除了以下的例外事项/注释。继添加磨碎 的碳酸钠和粒状的硫酸钠之后，冷却该混合物至5℃，持续10小时。 进行7小时回流(在第6小时显示有6％的前体)。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例7
马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的非水制备
重复实施例5的过程，除了以下的例外事项/注释。继添加磨碎 的碳酸钠和粒状的硫酸钠之后，搅拌并冷却该混合物至5.7℃，持 续9.5小时。在回流之前将该混合物在室温搅拌45分钟，而不是先 加热再回流。进行6.5小时回流(在第5小时显示有6％的前体)。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例8
马来酰亚胺封端的水溶性聚合物的非水制备
重复实施例5的过程，除了以下的例外事项/注释。继添加磨碎 的碳酸钠和粒状的硫酸钠之后，起初搅拌并冷却该混合物至5.75℃， 然后在2小时内逐渐冷却至5℃，总共搅拌15小时。在回流之前将 该混合物在室温搅拌1小时，而不是先加热再回流。进行8小时回 流(在第6小时显示有12％的前体)。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例9(对比实施例)
“含水的N-烷氧羰基马来酰亚胺途径”
将mPEG胺(20k Da)在7.6％(w/v)碳酸氢钠溶液中的17.5％ (w/v)溶液冷却至6℃。添加10％(w/v)N-甲氧羰基马来酰亚胺 (3当量，5.3％)的乙腈溶液，并将混合物搅拌15分钟。向该溶液 中加入足量的蒸馏水，使得体积增倍。首先将溶液冷却，然后允许 其在45分钟内升温至13℃。
使用磷酸将溶液的pH调节至3.0，然后加入足量的氯化钠以提 供15％(w/v)的氯化钠盐溶液。搅拌所述盐溶液15分钟，然后用等 体积的二氯甲烷萃取，从而得到二氯甲烷溶液。
使用硫酸钠(3.5g/100mL)干燥所述二氯甲烷溶液，并蒸发 得到油。用异丙醇(17.5mL/g)沉淀，过滤并干燥得到白色固体。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例10(对比实施例)
“含水的N-烷氧羰基马来酰亚胺途径”
将mPEG胺(20k Da)在7.6％(w/v)碳酸氢钠溶液中的17.5％ (w/v)溶液冷却到3.8℃至5.9℃。由于冷凝器的问题而使得温度 向室温偏离过夜。添加10％(w/v)N-甲氧羰基马来酰亚胺(3当量， 4.4％)的乙腈溶液，并将混合物搅拌15分钟。向该溶液中加入足 量的蒸馏水，使得体积增倍。首先将溶液冷却，然后允许其在45分 钟内升温至13℃。
使用磷酸将溶液的pH调节至3.0，然后加入足量的氯化钠以提 供15％(w/v)的氯化钠盐溶液。搅拌所述盐溶液15分钟，然后用等 体积的二氯甲烷萃取，从而得到二氯甲烷溶液。
使用硫酸钠(3.5g/100mL)干燥所述二氯甲烷溶液，并蒸发 得到油。用异丙醇(17.5mL/g)沉淀，过滤并干燥得到白色固体。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例11(对比实施例)
“含水的N-烷氧羰基马来酰亚胺途径”
将mPEG胺(20k Da)在7.6％(w/v)碳酸氢钠溶液中的17.5％ (w/v)溶液冷却到4℃。添加10％(w/v)N-甲氧羰基马来酰亚胺 (3当量，5.4％)的乙腈溶液，并将混合物搅拌15分钟。向该溶液 中加入足量的蒸馏水，使得体积增倍。首先将溶液冷却，然后允许 其在45分钟内升温到8℃至9℃。
使用磷酸将溶液的pH调节至3.0，然后加入足量的氯化钠以提 供15％(w/v)的氯化钠盐溶液。搅拌所述盐溶液15分钟，然后用等 体积的二氯甲烷萃取，从而得到二氯甲烷溶液。
使用硫酸钠(3.5g/100mL)干燥所述二氯甲烷溶液，并蒸发 得到油。用异丙醇(17.5mL/g)沉淀，过滤并干燥得到白色固体。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例12(对比实施例)
“含水的N-烷氧羰基马来酰亚胺途径”
将mPEG胺(20k Da)在7.6％(w/v)碳酸氢钠溶液中的17.5％ (w/v)溶液冷却到6℃。添加10％(w/v)N-甲氧羰基马来酰亚胺 (3当量，5.3％)的乙腈溶液，并将混合物搅拌15分钟。向该溶液 中加入足量的蒸馏水，使得体积增倍。首先将溶液冷却，然后允许 其在45分钟内升温至13℃。
使用磷酸将溶液的pH调节至3.0，然后加入足量的氯化钠以提 供15％(w/v)的氯化钠盐溶液。搅拌所述盐溶液15分钟，然后用等 体积的二氯甲烷萃取，从而得到二氯甲烷溶液。
使用硫酸钠(3.5g/100mL)干燥所述二氯甲烷溶液，并蒸发 得到油。用异丙醇(17.5mL/g)沉淀，过滤并干燥得到白色固体。
与本实施例相关的分析示于表1和表2，并在实施例13中进行 讨论。
实施例13
采用HPLC、GFC和1H NMR对实施例5至12获得的产物进行分析。 高效液相色谱(HPLC)使用Agilent 1100 HPLC系统(Agilent)进 行，该系统使用Shodex蛋白质KW-803 GFC柱和使用RI检测器，其 中流动相为10mM HEPES，流速为1.0mL/min，温度为25℃(产物 经羧酸官能化的巯基物质衍生物，并通过比较衍生化和未衍生化的 波谱而确定取代)。GFC使用Shodex蛋白质KW-803 GFC柱和使用 RI检测器进行，其中流动相为1×磷酸缓冲盐水，流速为1.0 mL/min，温度为25℃。结果示于表1和表2。就表1而言，“％二马 来酰亚胺基物质”是指分子量与所希望的马来酰亚胺产物大约相同 的聚合物，但其具有两个马来酰亚胺基末端；就表2而言，“％MAL 二聚物”是指由两个官能化的PEG物质相互反应形成的物质，％MAL 三聚物是指由三个官能化的PEG物质相互反应形成的物质，以及“％ MW高于三聚物(Timer)”是指由四个或多个官能化的PEG物质相互 反应形成的物质。
表1
实施例5至12的产物的HPLC分析
*包括mPEG-马来酰胺酸峰，但不包括未反应的物质
***经历温度偏移的实施例
表2
实施例5至12的产物的GFC和1H NMR分析以及
实施例5至8的产物的收率和批量大小
**不能定量，而且所提供的值为预期值
***经历温度偏移的实施例
从表1清楚地看到，实施例5至8中所采用的一般方法得到的组 合物与依据对比实施例9至12所采用的基于含水的方法得到的组合 物相比，具有更高的马来酰亚胺取代。通常，实施例5至8所采用 的一般方法提供的马来酰亚胺取代大于86％。此外，表1证实了实 施例5至8所采用的一般方法得到的组合物具有的含有马来酰胺酸 (“mPEG-马来酰胺酸”)的聚合物百分数小于4％，甚至小于2％， 其比对比实施例9至12所采用的基于含水的方法得到的更佳。
从表2看，似乎除了通过气相过滤色谱分析的分子量较高的物质 (％马来酰亚胺二聚物；％马来酰亚胺三聚物和其他高分子量的物 质)之外，诸如M-MAL 20k前体百分数和开环的酯杂质百分数等参 数在所测试的实施例中相当一致。
最后，从表1和表2可清楚地看到，当与对比实施例所采用的一 般方法进行比较时，实施例5至8所采用的一般方法提供了一致和 良好的收率。