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用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法.pdf

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文档编号：9166027

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1、(10)授权公告号 CN 102199224 B (45)授权公告日 2012.07.04 CN 102199224 B *CN102199224B* (21)申请号 201110069225.9 (22)申请日 2011.03.22 C08B 37/00(2006.01) C12S 3/02(2006.01) C07K 14/415(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (73)专利权人华中农业大学地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 (72)发明人王承明姚秀芬高洁芬 (74)专利代理机构武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人刘荣周宗贵。

2、 CN 101104647 A,2008.01.16, CN 1230965 A,1999.10.06, CN 1419837 A,2003.05.28, CN 101058822 A,2007.10.24, (54) 发明名称用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法 (57) 摘要本发明公开了一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法。该方法是将花生粕经粉碎、回流、酶解、灭酶、离心，取上清液，得到含花生多糖的溶液，离心后的沉淀残渣经干燥得到花生浓缩蛋白，将含花生多糖的溶液经浓缩、沉淀、洗涤、冷冻干燥，得到花生多糖干粉。花生多糖是具有特殊生物活性的多糖。

3、化合物，具有调节免疫、降血糖、抗疲劳、保肝的作用。本发明方法的提取条件简单方便，实现了低耗能、高效提取花生活性多糖的目的，同时极大地保留了原料中的蛋白质，有利于原料的综合利用，能大大提高花生的加工利用附加值，在工业上有很好的推广应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员丛丽晓权利要求书 1 页说明书 9 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 9 页 1/1 页 2 1. 一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 粉碎：将花生粕粉碎成粒径为 10 。

4、1000m 的微粉； (2) 回流：按 1g 5 10mL 的比例将花生粕微粉用体积百分比浓度不低于 90的石油醚或乙醇回流至脂肪含量低于 1，过滤，滤渣晾干； (3) 酶解： a. 按 1g 15 50mL 的比例将晾干的花生粕微粉加入含有 0 0.005mol/L 金属离子的水溶液中，所述金属离子为 K+、 Mg2+、 Al3+、 Ca2+、 Fe3+、 Cu2+或 Zn2+中的任一种或几种的混合物； b. 调节体系 pH 值：将 pH 值调节至 5.5 8.0，向水溶液中加入酶量为 50 500U/g 的 - 淀粉酶， 45 70条件下酶解 0.1 2h，。

5、得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.0 6.5，向水溶液中加入酶量为50500U/g的纤维素酶， 3065条件下酶解0.12h，得酶解液；或者将pH值调节至4.57.0，同时加入酶量为50300U/g的-淀粉酶和50300U/g 的纤维素酶， 30 70条件下酶解 0.1 1.5h，得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.5 7.0，加入酶量为 50 300U/g 的 - 淀粉酶， 30 70条件下酶解 0.1 1h 后，再加入酶量为 50 300U/g 的纤维素酶继续酶解 0.1 2h，得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.5 7.0，加入酶量为50300。

6、U/g的纤维素酶， 3070条件下酶解0.11h后，再加入酶量为50 300U/g 的 - 淀粉酶继续酶解 0.1 1.5h，得酶解液； (4) 灭酶：将酶解液于 80 100灭酶； (5) 离心：将灭酶后的酶解液离心，取上清液，得到含花生多糖的溶液，离心后的沉淀残渣经干燥即得到花生浓缩蛋白； (6) 浓缩：将含花生多糖的溶液真空浓缩至原体积的 1/10 1/2，然后冷却，得到浓缩液； (7) 沉淀、洗涤、干燥：以甲醇、乙醇、丙酮、饱和氯化钠溶液、饱和醋酸钾溶液、饱和硫酸钠溶液或饱和硫酸铵溶液中的任一种作为沉淀剂，按 1 2 6 的体。

7、积比将浓缩液与沉淀剂混合均匀，在 1 40条件下静置，离心，收集沉淀，用无水乙醇和丙酮充分洗涤，得到花生多糖沉淀，冷冻干燥，得到花生多糖干粉。 2. 根据权利要求 1 所述用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于：步骤 (5) 和步骤 (7) 中是在 2000 5000r/min、 1 40条件下离心。 3. 根据权利要求 1 所述用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于：步骤 (6) 中是在 30 70下真空浓缩。 4. 根据权利要求 1 所述用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于：步骤 (7) 中得到花生多糖沉淀以后。

8、，按 1 0.1 0.5 的质量比向花生多糖沉淀中加入水，在 -18 0条件下冷冻干燥。权利要求书 CN 102199224 B 2 1/9 页 3 用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法技术领域 0001 本发明涉及一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，属于花生粕综合利用技术领域。背景技术 0002 花生，又名金果、长寿果、长果、番豆、金果花生，是亚洲、非洲大部分地区的重要作物之一。花生的营养成分丰富且较全面，富含碳水化合物、蛋白氨基酸、卵磷脂、胆碱、油酸、脂肪酸、棕榈酸等，还含有 A、 B、 E、 K 等各种维生素和钙、。

9、磷、铁等矿物元素。花生粕是以脱壳花生果为原料，经压榨提炼油料后的副产品，多用作鱼类和家畜饲料，对花生粕中含有的很多有效成分并没有加以有效利用，造成了这种原料的极大浪费，从而难以提高花生的综合经济效益。现有的研究结果已表明，植物多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗心肌缺血、抗衰老、抗氧化、降血糖等多种生理功能，显示了非常广阔的应用前景。目前国内外对花生生物活性成分的研究主要集中在蛋白质和油脂方面，对其活性多糖的研究鲜有详细报道，如能发现并提取出花生粕中的活性多糖必将大大提高花生的加工利用的附加值。花生粕中含有大量的蛋白质，其次还含有可溶性糖、淀粉、。

10、灰分、粗脂肪、粗纤维等成分，其中碳水化合物含量为1023。花生粕中天然活性多糖提取的方法有：热水浸提法、醇水浸提法、酸浸提法、碱浸提法等，已有文献表明花生多糖具有调节免疫、降血糖、抗疲劳等作用。由于水作为溶剂难以完全溶出其中的多糖物质，需要多次浸提，操作时间长，提取率低；酸浸提法和碱浸提法由于酸、碱浓度高，易破坏天然活性多糖结构，不利于保护多糖的生理活性；醇水浸提法由于多糖在醇中的溶解度不高而难以溶出。以上方法的工艺对于多糖的制备难以取得好的效果，且纯化去除蛋白过程较为复杂。发明内容 0003 本发明的目的在于弥补上述现有技术之不足。

11、，提供一种用花生粕联产花生活性多糖和花生浓缩蛋白的方法。该方法采用非蛋白生物酶酶解技术提取花生粕中的活性多糖，并能较好保留原料中的蛋白质，不仅可以减化去除蛋白的复杂过程，而且有利于蛋白质的回收利用，成本低，周期短。 0004 实现本发明目的所采用的技术方案是：一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，包括以下步骤： 0005 (1) 粉碎：将花生粕粉碎成微粉； 0006 (2) 回流：按 1g 5 10mL 的比例将花生粕微粉用体积百分比浓度不低于 90 的石油醚或乙醇回流至脂肪含量低于 1，过滤，滤渣晾干； 0007 (3) 酶解： 0008 。

12、a. 按 1g 15 50mL 的比例将晾干的花生粕微粉加入含有 0 0.005mol/L 金属离子的水溶液中，所述金属离子为 K+、 Mg2+、 Al3+、 Ca2+、 Fe3+、 Cu2+或 Zn2+中的任一种或几种的混合物；说明书 CN 102199224 B 3 2/9 页 4 0009 b.调节体系pH值：将pH值调节至5.58.0，向水溶液中加入酶量为50500U/ g 的 - 淀粉酶， 45 70条件下酶解 0.1 2h，得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.0 6.5，向水溶液中加入酶量为 50 500U/g 的纤维素酶， 30 65条件下酶解 0.。

13、1 2h，得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.5 7.0，同时加入酶量为 50 300U/g 的 - 淀粉酶和 50 300U/g 的纤维素酶， 30 70条件下酶解 0.1 1.5h，得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.5 7.0，加入酶量为 50 300U/g 的 - 淀粉酶， 30 70条件下酶解 0.1 1h 后，再加入酶量为 50 300U/g 的纤维素酶继续酶解 0.1 2h，得酶解液；或者将 pH 值调节至 4.5 7.0，加入酶量为 50 300U/g 的纤维素酶， 30 70条件下酶解 0.1 1h 后，再加入酶量为 50 300U/g 的。

14、 - 淀粉酶继续酶解 0.1 1.5h，得酶解液； 0010 (4) 灭酶：将酶解液于 80 100灭酶； 0011 (5) 离心：将酶解液离心，取上清液，得到含花生多糖的溶液，离心后的沉淀残渣经干燥即得到花生浓缩蛋白； 0012 (6) 浓缩：将含花生多糖的溶液真空浓缩至原体积的 1/10 1/2，然后冷却，得到浓缩液； 0013 (7) 沉淀、洗涤、干燥：以甲醇、乙醇、丙酮、饱和氯化钠溶液、饱和醋酸钾溶液、饱和硫酸钠溶液或饱和硫酸铵溶液中的任一种作为沉淀剂，按 1 2 6 的体积比将浓缩液与沉淀剂混合均匀，在 1 40条件下静置。

15、，离心，收集沉淀，用无水乙醇和丙酮充分洗涤，得到花生多糖沉淀，冷冻干燥，得到花生多糖干粉。 0014 步骤 (1) 中是将花生粕粉碎成粒径为 10 1000m 的微粉。 0015 步骤 (5) 和步骤 (7) 中是在 2000 5000r/min、 1 40条件下离心。 0016 步骤 (6) 中是在 30 70下真空浓缩。 0017 步骤 (7) 中得到花生多糖沉淀以后，按 1 0.1 0.5 的质量比向花生多糖沉淀中加入水，在 -18 0条件下冷冻干燥。 0018 分别采用硫酸 - 苯酚法、 3， 5- 二硝基水杨酸法和 I2-KI 反应对采用本发明方法提取的物质进行定。

16、量、定性分析，可知该物质为非淀粉多糖类物质；本制备方法酶解过程中通过条件的控制和优化，使花生粕中蛋白质极大地保留，沉淀过程中已将单糖等小分子去除，这说明本发明制备的是多糖物质。 0019 本发明方法具有以下优点： 0020 (1) 本发明方法是以花生粕为原料，利用一种非蛋白酶生产方法从花生粕中提取分离出花生活性多糖，并使花生粕残渣成为花生浓缩蛋白的技术，大大提高了花生粕的综合利用价值。资源利用合理，开发利用更为经济。 0021 (2) 本发明利用酶技术处理花生粕，反应条件温和，能最大限度的保存原料中活性多糖的生理活性，使其营养性与功能性兼具，提取出的花生。

17、多糖除了具有调节免疫、降血糖、抗疲劳作用，还具有保肝生理活性。 0022 (3) 本发明方法通过制备条件的控制和优化，不仅有利于花生活性多糖的提取，同时极大地减少了制备过程中蛋白质的溢出 (80蛋白质保留率 100 )，简化了过程，使花生多糖的得率 ( 干基比 ) 大大提高，得率达 7 15。具体实施方式说明书 CN 102199224 B 4 3/9 页 5 0023 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。 0024 本发明实施例中采用以下方法：将花生粕粉碎、回流：将花生粕粉碎成粒径为 10 1000m 的微。

18、粉，按 1g 5 10mL 的比例将花生粕微粉用体积百分比浓度不低于 90的石油醚或乙醇回流 1 5 小时，过滤，滤渣晾干。 0025 将粉碎、回流后的花生粕微粉加入到含有00.005mol/L金属离子的水溶液中以后，体系的 pH 值为 6.33( 即 pH 自然 )，然后根据需要调节溶液的 pH 值。当 4 所需调节的 pH 值 6.33 时，采用盐酸或柠檬酸进行调节，当 6.33 所需调节的 pH 值 8 时，采用氢氧化钠或碳酸氢钠进行调节。 0026 得到花生多糖沉淀以后，按 1 0.1 0.5 的质量比向花生多糖沉淀中加入水，在 -18 0条件下冷冻干燥。。

19、0027 采用硫酸 - 苯酚法、 3， 5- 二硝基水杨酸法和 I2-KI 反应对本发明实施例提取的物质进行定量、定性分析。 0028 实施例 1 0029 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 25ml 含有 0.004molL-1的 Mg2+的水溶液中，调节 pH 7.0，加入酶量为 175U/g 的 - 淀粉酶和 105U/g 的纤维素酶，于 50酶解 60min，得到酶解液，酶解完成后于 95灭酶。将灭酶后的酶解液于 3000r/min、 25条件下离心 10min，取上清液，得到含花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定。

20、此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 12.16。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为86.63。将上清液(即含花生多糖的溶液)于30下真空浓缩至原体积的 1/4 后冷却，按 1 3 的体积比向浓缩液中加入体积百分比浓度为 95的乙醇， 25静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 3000r/min、 25条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得到花生多糖沉淀；冷冻干燥后得到花生多糖干粉。 0030 实施例 2 0031 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 15ml 含有 0.003molL-1的。

21、 Ca2+的水溶液中，调节 pH 6.5，加入酶量为 175U/g 的 - 淀粉酶和 105U/g 的纤维素酶，于 50酶解 45min，得到酶解液，酶解完成后于 80灭酶。将灭酶后的酶解液于 5000r/min、 4条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 12.17。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 94.07。将上清液 ( 即含花生多糖的溶液 ) 于 50下真空浓缩至原体积的1/10后冷却，按15的体积比向浓缩液中加入体积。

22、百分比浓度为95 的乙醇， 4静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 5000r/min、 4条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得到花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0032 实施例 3 0033 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 25ml 含有 0.003molL-1的 Zn2+的水溶液中，调节pH6.5，加入酶量为105U/g的纤维素酶，于70酶解30min ；再加入酶量为175U/ g 的 - 淀粉酶继续酶解 45min，得到酶解液，酶解完成后于 95灭酶。将灭酶后的酶解液说明书 CN 10219。

23、9224 B 5 4/9 页 6 于2000r/min、 4条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 12.59。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 98.59。将上清液 ( 即含花生多糖的溶液 ) 于 30下真空浓缩至原体积的 1/6 后冷却，按 1 3 的体积比向浓缩液中加入无水丙酮， 4静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 2000r/min、 4条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖。

24、沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0034 实施例 4 0035 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 45ml 水中，调节 pH 6.5，加入酶量为 105U/g 的纤维素酶，于 65酶解 15min，再加入酶量为 175U/g 的 - 淀粉酶继续酶解 75min，得到酶解液，酶解完成后于 100灭酶。将灭酶后的酶解液于 4000r/min、 40条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 10.79。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋。

25、白质保留率为98.47。将上清液(即含花生多糖的溶液)于60下真空浓缩至原体积的 1/2 后冷却，按 1 5 的体积比向浓缩液中加入无水甲醇， 40静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 4000r/min、 40条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0036 实施例 5 0037 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 40ml 含有 Cu2+和 Zn2+(Cu2+和 Zn2+的总浓度为 0.002molL-1) 的水溶液中， pH 自然，加入酶量为 175U/g 的 - 淀粉酶，于。

26、65酶解 30min，再加入酶量为 105U/g 的纤维素酶继续酶解 60min，得到酶解液；酶解完成后于 90 灭酶。将灭酶后的酶解液于 5000r/min、 25条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比)为13.04。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.35。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于70下真空浓缩至原体积的1/4后冷却，按12的体积比向浓缩液中加入饱和氯化钠溶液， 25静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 5000r/。

27、 min、 25条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0038 实施例 6 0039 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 35ml 含有 0.003molL-1的 Al3+的水溶液中，调节 pH 6.0，加入酶量为 90U/g 的 - 淀粉酶，于 30酶解 15min，再加入酶量为 180U/g 的纤维素酶继续酶解 105min，得到酶解液；酶解完成后于 85灭酶。将灭酶后的酶解液于 5000r/min、 4条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯。

28、酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 10.58。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为97.92。将上清液(即含有花生多糖的溶液 ) 于 50下真空浓缩至原体积的 1/8 后冷却，按 1 2 的体积比向浓缩液中加入饱和硫酸钠溶液， 4静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 5000r/min、 4条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。说明书 CN 102199224 B 6 5/9 页 7 0040 实施例 7 0。

29、041 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 25ml 含有 K+和 Ca2+(K+和 Ca2+的总浓度为 0.003molL-1) 的水溶液中，调节 pH 4.0，加入酶量为 400U/g 的纤维素酶，于 60酶解 60min，得到酶解液，酶解完成后于 100灭酶。将灭酶后的酶解液于 4000r/min、 25条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为8.68。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 99.00。将上清液 ( 即含有花生多。

30、糖的溶液 ) 于 40下真空浓缩至原体积的 1/2 后冷却，按 1 2 的体积比向浓缩液中加入饱和硫酸铵溶液， 25 静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 4000r/min、 25条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0042 实施例 8 0043 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 50ml 含有 0.002molL-1的 Fe3+的水溶液中，调节pH5.5，加入酶量为350U/g的-淀粉酶，于60酶解60min，得到酶解液；酶解完成后于95灭酶。将灭酶后的酶解液于2。

31、000r/min、 15下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3， 5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率为 11.53。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 98.04。将上清液 ( 即含有花生多糖的溶液 ) 于 60下真空浓缩至原体积的 1/10 后冷却，按 1 3 的体积比向浓缩液中加入无水丙酮， 15静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 2000r/min、 15条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0044 实施例 9 。

32、0045 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 15ml 含有 K+和 Zn2+(K+和 Zn2+的总浓度为 0.002mol L-1) 的水溶液中，调节 pH 8.0，加入酶量为 450U/g 的 - 淀粉酶，于 55酶解 90min，得到酶解液；酶解完成后于85灭酶。将灭酶后的酶解液于3000r/min、 25条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 10.65。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 88.24。将上清液。

33、( 即含有花生多糖的溶液 ) 于 40下真空浓缩至原体积的 1/6 后冷却，按 1 2 的体积比向浓缩液中加入饱和醋酸钾溶液， 25 静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 3000r/min、 25条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0046 实施例 10 0047 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 15ml 含有 0.002molL-1的 Ca2+的水溶液中，调节 pH 6.0，加入酶量为 250U/g 的 - 淀粉酶，于 50酶解 30min，再加入酶量为 200U/g 。

34、的纤维素酶继续酶解 90min，得到酶解液；酶解完成后于 100灭酶。将灭酶后的酶解液于 4000r/min、 25条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 12.14。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.29。将上清液(即含有花生多糖的溶液 ) 于 50下真空浓缩至原体积的 1/4 后冷却，按 1 3 的体积比向浓缩液中加入无水乙醇， 25静置 12h，使花生多糖充分沉淀，再于 4000r/min、 25条件下条件说明。

35、书 CN 102199224 B 7 6/9 页 8 下离心 15min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0048 实施例 11 0049 取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入25ml含有Ca2+和Cu2+(Ca2+和Cu2+的总浓度为 0.001molL-1) 的水溶液中，调节 pH 6.0，加入酶量为 250U/g 的 - 淀粉酶，于 50 酶解 30min，再加入酶量为 200U/g 的纤维素酶继续酶解 90min，得到酶解液；酶解完成后于 90灭酶，将灭酶后的酶解液于 4000r/min、 2。

36、5条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 12.98。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 98.17。将上清液 ( 即含有花生多糖的溶液 ) 于 50下真空浓缩至原体积的 1/8 后冷却，按12的体积比向浓缩液中加入饱和氯化钠溶液， 25静置12h，使花生多糖充分沉淀，再于 4000r/min、 25条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0050 实施例。

37、 12 0051 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 35ml 含有 0.005mol L-1的 K+的水溶液中，调节 pH 6.5，加入酶量为 300U/g 的纤维素酶，于 55酶解 45min，得到酶解液；酶解完成后于 100灭酶。将灭酶后的酶解液于 5000r/min、 15条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3， 5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 9.16。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 95.69。将上清液 ( 即含有花生多糖的溶液 ) 于 70下真。

38、空浓缩至原体积的 1/4 后冷却，按 1 2 的体积比向浓缩液中加入饱和醋酸钾溶液， 15静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 5000r/min、 15条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0052 实施例 13 0053 取 1g 粉碎、回流后的花生粕微粉，加入 40ml 含有 K+和 Ca2+(K+和 Ca2+的总浓度为 0.002mol L-1) 的水溶液中，调节 pH 6.5，加入酶量为 350U/g 的 - 淀粉酶，于 45酶解 45min，得到酶解液；酶解完成后于 1。

39、00灭酶。将灭酶后的酶解液于 4000r/min、 15条件下离心 10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚 - 硫酸法和 3， 5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率 ( 干基比 ) 为 10.98。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为 92.45。将上清液 ( 即含有花生多糖的溶液 ) 于 50 下真空浓缩至原体积的 1/4 后冷却，按 1 6 的体积比向浓缩液中加入体积百分比浓度为 95的乙醇， 15静置 8h，使花生多糖充分沉淀，再于 4000r/min、 15条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮。

40、反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。 0054 本发明的技术方案中所述金属离子为 K+、 Mg2+、 Al3+、 Ca2+、 Fe3+、 Cu2+或 Zn2+中的任几种的混合物时，对其中各离子之间的比例没有要求，只要总浓度为 0 0.005molL-1即可。 0055 下面将通过动物实验来说明本方法制备的花生多糖的保肝生理活性及其效果。 0056 一、四氯化碳模型说明书 CN 102199224 B 8 7/9 页 9 0057 1. 实验材料 0058 (1) 动物： SPF 级雄性昆明种小鼠，体重 20.02.0g，由湖北省疾病预防控制中心实。

41、验动物研究中心提供。 0059 (2) 试剂：四氯化碳 (CCl4)，国药集团化学试剂有限公司；谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。 0060 (3) 药品：联苯双酯滴丸，浙江医药股份有限公司新昌制药厂；花生多糖：由实施例 10 方法制备。 0061 2. 方法与结果 0062 (1) 方法 0063 小鼠正常饲养 2d，随机分成正常对照组、 CCl4模型组、花生多糖低、中、高剂量组及联苯双酯阳性对照组，每组 10 只。各组给药剂量如。

42、下：正常组及模型组给予生理盐水 0.5ml/ 只、花生多糖低剂量组：花生多糖成人剂量、花生多糖中剂量组：花生多糖 2 倍成人剂量、花生多糖高剂量组：花生多糖 4 倍成人剂量、联苯双酯阳性对照组： 2 倍成人每日剂量。各组连续灌胃给药15天，末次给药2h后，除正常对照组腹腔注射等量生理盐水0.5ml/ 只外，其余各组小鼠均腹腔注射 0.1的 CCl4花生油溶液 10ml/kg 1 次。各组均于末次给药后禁食不禁水 16h，然后小鼠摘除眼球取血，分离血清备测血清中 ALT、 AST 活性；同时处死小鼠，立即破腹取肝脏，称重，计算肝脏指数；。

43、称取肝脏右叶组织，以19(m/v)的生理盐水制成肝匀浆，分别测定肝组织中 MDA、蛋白质含量和 SOD 酶活力。 0064 (2) 结果 0065 表1结果显示，与正常组比较， CCl4肝损伤模型组肝脏中SOD含量极显著降低， MDA 含量和肝脏指数均极显著增高 (P 0.01)，说明 CCl4致小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组比较，花生多糖低、中、高剂量组和联苯双酯组均可提高 CCl4肝损伤小鼠肝脏中 SOD 的活性，并能抑制 MDA 含量和肝脏指数的升高，尤其是花生多糖中、高剂量组的效果极为显著 (P 0.01)，且花生多糖高剂量组的效果优于联苯双酯组。 00。

44、66 表 1 花生多糖对 CCl4肝损伤小鼠肝脏 SOD、 MDA 及肝脏指数的影响 0067 0068 注： *. 与正常组比较，差异极显著 (P 0.01) ； . 与模型组比较，差异显著 (P 0.05) ； . 与模型组相比，差异极显著 (P 0.01)。下同。 0069 花生多糖对 CCl4肝损伤小鼠血清转氨酶的影响结果如表 2 所示，模型组小鼠血清中的 ALT 与 AST 活性极显著地高于正常组 (P 0.01)。与模型组相比，花生多糖低、中、高剂量组，联苯双酯组的 ALT、 AST 活性下降均达到了极显著水平 (P 0.01)，且花生多糖中说明书 C。

45、N 102199224 B 9 8/9 页 10 剂量组的 ALT、 AST 活性下降水平均低于花生多糖低、高剂量组。 0070 表 2 花生多糖对 CCl4肝损伤小鼠血清转氨酶的影响 0071 0072 综合来看，表 1、 2 表明，花生多糖能显著抑制四氯化碳性急性肝损伤所引起的 MDA 含量、肝脏指数、 ALT 和 AST 活性的升高，有效地抑制肝脏中 SOD 活性的降低，说明花生多糖对四氯化碳性肝损害有较好的保护作用。 0073 二、酒精模型 0074 1. 实验材料 0075 (1) 动物： SPF 级雄性昆明种小鼠，体重 20.02.0g，由湖北省疾病预防控制中。

46、心实验动物研究中心提供。 0076 (2) 试剂： 56红星二锅头，北京红星股份有限公司；谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。 0077 (3) 药品：维生素 E， Sigma 公司；花生多糖：由实施例 10 方法制备。 0078 2. 方法与结果 0079 (1) 方法 0080 小鼠正常饲养 2d，随机分成正常对照组、酒精模型组、花生多糖低、中、高剂量组及维生素 E 阳性对照组，每组 10 只。各组给药剂量如下：正常组及模型组给。

47、予生理盐水 0.5ml/ 只、花生多糖低剂量组：花生多糖成人剂量、花生多糖中剂量组：花生多糖 2 倍成人剂量、花生多糖高剂量组：花生多糖 4 倍成人剂量、维生素 E 对照组： 2 倍成人每日剂量。各组连续灌胃给药 20 天，末次给药 2h 后，除正常对照组灌胃等量生理盐水外 0.5ml/ 只外，其余各组小鼠均灌胃 56红星二锅头 15ml/kg 1 次。各组均于末次给药后禁食不禁水 16h，然后小鼠摘除眼球取血，分离血清备测血清中 ALT、 AST 活性；同时处死小鼠，立即破腹取肝脏，称重，计算肝脏指数；称取肝脏右叶组织，以19(m/v)。

48、的生理盐水制成肝匀浆，分别测定肝组织中 MDA、蛋白质含量和 SOD 酶活力。 0081 (2) 结果 0082 与正常组比较，模型组小鼠肝脏中 SOD 活性降低， MDA 含量和肝脏指数水平明显升高，有极显著的统计学差异 (P 0.01)，说明酒精致小鼠急性肝损伤模型建立成功，结果见表 3。与模型组比较，花生多糖低、中剂量组与维生素 E 组均能提高小鼠酒精肝损伤的肝脏 SOD 活性，同时降低 MDA 的含量和肝脏指数，有显著差异 (P 0.05 0.01) ；花生多糖各剂量组的 SOD 活性水平高于维生素 E 组。 0083 表 3 花生多糖对酒精肝损伤小鼠肝脏。

49、 SOD、 MDA 及肝脏指数的影响 0084 说明书 CN 102199224 B 10 9/9 页 11 0085 表 4 显示，酒精致急性肝损伤模型组小鼠血清的 ALT、 AST 水平相对空白组有极显著升高 (P 0.01)。与模型组比较，花生多糖低、高剂量组、维生素 E 组均能极显著降低血清中 ALT、 AST 水平 (P 0.01)，随花生多糖剂量的增加，花生多糖各剂量组呈现出 ALT 水平逐渐下降的趋势，花生多糖中、高剂量组的小鼠血清 ALT 水平明显低于维生素 E 组。 0086 表 4 花生多糖对酒精肝损伤小鼠血清转氨酶的影响 0087 0088 综合来看，表 3、 4 表明，花生多糖能显著降低酒精性急性肝损伤所引起的 MDA 含量、肝脏指数、 ALT 和 AST 活性的升高，拮抗肝脏中 SOD 活性的降低，证明花生多糖对酒精性肝损害的保护作用明显。说明书 CN 102199224 B 11 。

摘要
申请专利号：	CN201110069225.9	申请日：	20110322
公开号：	CN102199224B	公开日：	20120704
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C08B37/00,C12S3/02,C07K14/415,C07K1/14	主分类号：	C08B37/00,C12S3/02,C07K14/415,C07K1/14
申请人：	华中农业大学
发明人：	王承明,姚秀芬,高洁芬
地址：	430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
优先权：	CN201110069225A
专利代理机构：	武汉华旭知识产权事务所	代理人：	刘荣;周宗贵
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内容摘要

本发明公开了一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法。该方法是将花生粕经粉碎、回流、酶解、灭酶、离心，取上清液，得到含花生多糖的溶液，离心后的沉淀残渣经干燥得到花生浓缩蛋白，将含花生多糖的溶液经浓缩、沉淀、洗涤、冷冻干燥，得到花生多糖干粉。花生多糖是具有特殊生物活性的多糖化合物，具有调节免疫、降血糖、抗疲劳、保肝的作用。本发明方法的提取条件简单方便，实现了低耗能、高效提取花生活性多糖的目的，同时极大地保留了原料中的蛋白质，有利于原料的综合利用，能大大提高花生的加工利用附加值，在工业上有很好的推广应用前景。

权利要求书

1.一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)粉碎：将花生粕粉碎成粒径为10～1000μm的微粉；(2)回流：按1g∶5～10mL的比例将花生粕微粉用体积百分比浓度不低于90％的石油醚或乙醇回流至脂肪含量低于1％，过滤，滤渣晾干；(3)酶解：a.按1g∶15～50mL的比例将晾干的花生粕微粉加入含有0～0.005mol/L金属离子的水溶液中，所述金属离子为K、Mg、Al、Ca、Fe、Cu或Zn中的任一种或几种的混合物；b.调节体系pH值：将pH值调节至5.5～8.0，向水溶液中加入酶量为50～500U/g的α-淀粉酶，45～70℃条件下酶解0.1～2h，得酶解液；或者将pH值调节至4.0～6.5，向水溶液中加入酶量为50～500U/g的纤维素酶，30～65℃条件下酶解0.1～2h，得酶解液；或者将pH值调节至4.5～7.0，同时加入酶量为50～300U/g的α-淀粉酶和50～300U/g的纤维素酶，30～70℃条件下酶解0.1～1.5h，得酶解液；或者将pH值调节至4.5～7.0，加入酶量为50～300U/g的α-淀粉酶，30～70℃条件下酶解0.1～1h后，再加入酶量为50～300U/g的纤维素酶继续酶解0.1～2h，得酶解液；或者将pH值调节至4.5～7.0，加入酶量为50～300U/g的纤维素酶，30～70℃条件下酶解0.1～1h后，再加入酶量为50～300U/g的α-淀粉酶继续酶解0.1～1.5h，得酶解液；(4)灭酶：将酶解液于80～100℃灭酶；(5)离心：将灭酶后的酶解液离心，取上清液，得到含花生多糖的溶液，离心后的沉淀残渣经干燥即得到花生浓缩蛋白；(6)浓缩：将含花生多糖的溶液真空浓缩至原体积的1/10～1/2，然后冷却，得到浓缩液；(7)沉淀、洗涤、干燥：以甲醇、乙醇、丙酮、饱和氯化钠溶液、饱和醋酸钾溶液、饱和硫酸钠溶液或饱和硫酸铵溶液中的任一种作为沉淀剂，按1∶2～6的体积比将浓缩液与沉淀剂混合均匀，在1～40℃条件下静置，离心，收集沉淀，用无水乙醇和丙酮充分洗涤，得到花生多糖沉淀，冷冻干燥，得到花生多糖干粉。 2.根据权利要求1所述用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于：步骤(5)和步骤(7)中是在2000～5000r/min、1～40℃条件下离心。 3.根据权利要求1所述用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于：步骤(6)中是在30～70℃下真空浓缩。 4.根据权利要求1所述用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，其特征在于：步骤(7)中得到花生多糖沉淀以后，按1∶0.1～0.5的质量比向花生多糖沉淀中加入水，在-18～0℃条件下冷冻干燥。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，属于花生粕综合利用技术领域。

背景技术

花生，又名金果、长寿果、长果、番豆、金果花生，是亚洲、非洲大部分地区的重要作物之一。花生的营养成分丰富且较全面，富含碳水化合物、蛋白氨基酸、卵磷脂、胆碱、油酸、脂肪酸、棕榈酸等，还含有A、B、E、K等各种维生素和钙、磷、铁等矿物元素。花生粕是以脱壳花生果为原料，经压榨提炼油料后的副产品，多用作鱼类和家畜饲料，对花生粕中含有的很多有效成分并没有加以有效利用，造成了这种原料的极大浪费，从而难以提高花生的综合经济效益。现有的研究结果已表明，植物多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗心肌缺血、抗衰老、抗氧化、降血糖等多种生理功能，显示了非常广阔的应用前景。目前国内外对花生生物活性成分的研究主要集中在蛋白质和油脂方面，对其活性多糖的研究鲜有详细报道，如能发现并提取出花生粕中的活性多糖必将大大提高花生的加工利用的附加值。花生粕中含有大量的蛋白质，其次还含有可溶性糖、淀粉、灰分、粗脂肪、粗纤维等成分，其中碳水化合物含量为10％～23％。花生粕中天然活性多糖提取的方法有：热水浸提法、醇水浸提法、酸浸提法、碱浸提法等，已有文献表明花生多糖具有调节免疫、降血糖、抗疲劳等作用。由于水作为溶剂难以完全溶出其中的多糖物质，需要多次浸提，操作时间长，提取率低；酸浸提法和碱浸提法由于酸、碱浓度高，易破坏天然活性多糖结构，不利于保护多糖的生理活性；醇水浸提法由于多糖在醇中的溶解度不高而难以溶出。以上方法的工艺对于多糖的制备难以取得好的效果，且纯化去除蛋白过程较为复杂。

发明内容

本发明的目的在于弥补上述现有技术之不足，提供一种用花生粕联产花生活性多糖和花生浓缩蛋白的方法。该方法采用非蛋白生物酶酶解技术提取花生粕中的活性多糖，并能较好保留原料中的蛋白质，不仅可以减化去除蛋白的复杂过程，而且有利于蛋白质的回收利用，成本低，周期短。

实现本发明目的所采用的技术方案是：一种用花生粕联产花生多糖和花生浓缩蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：将花生粕粉碎成微粉；

(2)回流：按1g∶5～10mL的比例将花生粕微粉用体积百分比浓度不低于90％的石油醚或乙醇回流至脂肪含量低于1％，过滤，滤渣晾干；

(3)酶解：

a.按1g∶15～50mL的比例将晾干的花生粕微粉加入含有0～0.005mol/L金属离子的水溶液中，所述金属离子为K+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe3+、Cu2+或Zn2+中的任一种或几种的混合物；

b.调节体系pH值：将pH值调节至5.5～8.0，向水溶液中加入酶量为50～500U/g的 α-淀粉酶，45～70℃条件下酶解0.1～2h，得酶解液；或者将pH值调节至4.0～6.5，向水溶液中加入酶量为50～500U/g的纤维素酶，30～65℃条件下酶解0.1～2h，得酶解液；或者将pH值调节至4.5～7.0，同时加入酶量为50～300U/g的α-淀粉酶和50～300U/g的纤维素酶，30～70℃条件下酶解0.1～1.5h，得酶解液；或者将pH值调节至4.5～7.0，加入酶量为50～300U/g的α-淀粉酶，30～70℃条件下酶解0.1～1h后，再加入酶量为50～300U/g 的纤维素酶继续酶解0.1～2h，得酶解液；或者将pH值调节至4.5～7.0，加入酶量为50～300 U/g的纤维素酶，30～70℃条件下酶解0.1～1h后，再加入酶量为50～300U/g的α-淀粉酶继续酶解0.1～1.5h，得酶解液；

(4)灭酶：将酶解液于80～100℃灭酶；

(5)离心：将酶解液离心，取上清液，得到含花生多糖的溶液，离心后的沉淀残渣经干燥即得到花生浓缩蛋白；

(6)浓缩：将含花生多糖的溶液真空浓缩至原体积的1/10～1/2，然后冷却，得到浓缩液；

(7)沉淀、洗涤、干燥：以甲醇、乙醇、丙酮、饱和氯化钠溶液、饱和醋酸钾溶液、饱和硫酸钠溶液或饱和硫酸铵溶液中的任一种作为沉淀剂，按1∶2～6的体积比将浓缩液与沉淀剂混合均匀，在1～40℃条件下静置，离心，收集沉淀，用无水乙醇和丙酮充分洗涤，得到花生多糖沉淀，冷冻干燥，得到花生多糖干粉。

步骤(1)中是将花生粕粉碎成粒径为10～1000μm的微粉。

步骤(5)和步骤(7)中是在2000～5000r/min、1～40℃条件下离心。

步骤(6)中是在30～70℃下真空浓缩。

步骤(7)中得到花生多糖沉淀以后，按1∶0.1～0.5的质量比向花生多糖沉淀中加入水，在-18～0℃条件下冷冻干燥。

分别采用硫酸-苯酚法、3，5-二硝基水杨酸法和I2-KI反应对采用本发明方法提取的物质进行定量、定性分析，可知该物质为非淀粉多糖类物质；本制备方法酶解过程中通过条件的控制和优化，使花生粕中蛋白质极大地保留，沉淀过程中已将单糖等小分子去除，这说明本发明制备的是多糖物质。

本发明方法具有以下优点：

(1)本发明方法是以花生粕为原料，利用一种非蛋白酶生产方法从花生粕中提取分离出花生活性多糖，并使花生粕残渣成为花生浓缩蛋白的技术，大大提高了花生粕的综合利用价值。资源利用合理，开发利用更为经济。

(2)本发明利用酶技术处理花生粕，反应条件温和，能最大限度的保存原料中活性多糖的生理活性，使其营养性与功能性兼具，提取出的花生多糖除了具有调节免疫、降血糖、抗疲劳作用，还具有保肝生理活性。

(3)本发明方法通过制备条件的控制和优化，不仅有利于花生活性多糖的提取，同时极大地减少了制备过程中蛋白质的溢出(80％＜蛋白质保留率＜100％)，简化了过程，使花生多糖的得率(干基比)大大提高，得率达7％～15％。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。

本发明实施例中采用以下方法：将花生粕粉碎、回流：将花生粕粉碎成粒径为 10～1000μm的微粉，按1g∶5～10mL的比例将花生粕微粉用体积百分比浓度不低于90％的石油醚或乙醇回流1～5小时，过滤，滤渣晾干。

将粉碎、回流后的花生粕微粉加入到含有0～0.005mol/L金属离子的水溶液中以后，体系的pH值为6.33(即pH自然)，然后根据需要调节溶液的pH值。当4≤所需调节的pH值＜6.33时，采用盐酸或柠檬酸进行调节，当6.33＜所需调节的pH值≤8时，采用氢氧化钠或碳酸氢钠进行调节。

得到花生多糖沉淀以后，按1∶0.1～0.5的质量比向花生多糖沉淀中加入水，在-18～0 ℃条件下冷冻干燥。

采用硫酸-苯酚法、3，5-二硝基水杨酸法和I2-KI反应对本发明实施例提取的物质进行定量、定性分析。

实施例1

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入25ml含有0.004mol·L-1的Mg2+的水溶液中，调节pH＝7.0，加入酶量为175U/g的α-淀粉酶和105U/g的纤维素酶，于50℃酶解60min，得到酶解液，酶解完成后于95℃灭酶。将灭酶后的酶解液于3000r/min、25 ℃条件下离心10min，取上清液，得到含花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为12.16％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为86.63％。将上清液(即含花生多糖的溶液) 于30℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷却，按1∶3的体积比向浓缩液中加入体积百分比浓度为95％的乙醇，25℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于3000r/min、25℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得到花生多糖沉淀；冷冻干燥后得到花生多糖干粉。

实施例2

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入15ml含有0.003mol·L-1的Ca2+的水溶液中，调节pH＝6.5，加入酶量为175U/g的α-淀粉酶和105U/g的纤维素酶，于50℃酶解45min，得到酶解液，酶解完成后于80℃灭酶。将灭酶后的酶解液于5000r/min、4 ℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为12.17％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为94.07％。将上清液(即含花生多糖的溶液)于50℃下真空浓缩至原体积的1/10后冷却，按1∶5的体积比向浓缩液中加入体积百分比浓度为95％的乙醇，4℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于5000r/min、4℃ 条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得到花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例3

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入25ml含有0.003mol·L-1的Zn2+的水溶液中，调节pH＝6.5，加入酶量为105U/g的纤维素酶，于70℃酶解30min；再加入酶量为175U/g的α-淀粉酶继续酶解45min，得到酶解液，酶解完成后于95℃灭酶。将灭酶后的酶解液于2000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为 12.59％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.59％。将上清液(即含花生多糖的溶液)于30℃下真空浓缩至原体积的1/6后冷却，按1∶3的体积比向浓缩液中加入无水丙酮，4℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于2000r/min、4 ℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例4

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入45ml水中，调节pH＝6.5，加入酶量为105 U/g的纤维素酶，于65℃酶解15min，再加入酶量为175U/g的α-淀粉酶继续酶解75min，得到酶解液，酶解完成后于100℃灭酶。将灭酶后的酶解液于4000r/min、40℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为10.79％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.47％。将上清液(即含花生多糖的溶液)于60 ℃下真空浓缩至原体积的1/2后冷却，按1∶5的体积比向浓缩液中加入无水甲醇，40℃ 静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于4000r/min、40℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例5

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入40ml含有Cu2+和Zn2+(Cu2+和Zn2+的总浓度为0.002mol·L-1)的水溶液中，pH自然，加入酶量为175U/g的α-淀粉酶，于65 ℃酶解30min，再加入酶量为105U/g的纤维素酶继续酶解60min，得到酶解液；酶解完成后于90℃灭酶。将灭酶后的酶解液于5000r/min、25℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为13.04％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.35％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于70℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷却，按1∶2的体积比向浓缩液中加入饱和氯化钠溶液，25℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于5000r/min、25℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例6

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入35ml含有0.003mol·L-1的Al3+的水溶液中，调节pH＝6.0，加入酶量为90U/g的α-淀粉酶，于30℃酶解15min，再加入酶量为 180U/g的纤维素酶继续酶解105min，得到酶解液；酶解完成后于85℃灭酶。将灭酶后的酶解液于5000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为 10.58％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为97.92％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于50℃下真空浓缩至原体积的1/8后冷却，按1∶2的体积比向浓缩液中加入饱和硫酸钠溶液，4℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于 5000r/min、4℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例7

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入25ml含有K+和Ca2+(K+和Ca2+的总浓度为0.003mol·L-1)的水溶液中，调节pH＝4.0，加入酶量为400U/g的纤维素酶，于60 ℃酶解60min，得到酶解液，酶解完成后于100℃灭酶。将灭酶后的酶解液于4000r/min、 25℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为8.68％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为99.00％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于40℃下真空浓缩至原体积的1/2后冷却，按1∶2的体积比向浓缩液中加入饱和硫酸铵溶液，25℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于4000r/min、25℃条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例8

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入50ml含有0.002mol·L-1的Fe3+的水溶液中，调节pH＝5.5，加入酶量为350U/g的α-淀粉酶，于60℃酶解60min，得到酶解液；酶解完成后于95℃灭酶。将灭酶后的酶解液于2000r/min、15℃下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率为11.53％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.04％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于60℃下真空浓缩至原体积的1/10 后冷却，按1∶3的体积比向浓缩液中加入无水丙酮，15℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于2000r/min、15℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例9

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入15ml含有K+和Zn2+(K+和Zn2+的总浓度为0.002mol·L-1)的水溶液中，调节pH＝8.0，加入酶量为450U/g的α-淀粉酶，于55 ℃酶解90min，得到酶解液；酶解完成后于85℃灭酶。将灭酶后的酶解液于3000r/min、 25℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为10.65％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为88.24％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于40℃下真空浓缩至原体积的1/6后冷却，按1∶2的体积比向浓缩液中加入饱和醋酸钾溶液，25℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于3000r/min、25℃条件下离心 20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例10

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入15ml含有0.002mol·L-1的Ca2+的水溶液中，调节pH＝6.0，加入酶量为250U/g的α-淀粉酶，于50℃酶解30min，再加入酶量为200U/g的纤维素酶继续酶解90min，得到酶解液；酶解完成后于100℃灭酶。将灭酶后的酶解液于4000r/min、25℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比) 为12.14％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.29％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于50℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷却，按1∶3 的体积比向浓缩液中加入无水乙醇，25℃静置12h，使花生多糖充分沉淀，再于 4000r/min、25℃条件下条件下离心15min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例11

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入25ml含有Ca2+和Cu2+(Ca2+和Cu2+的总浓度为0.001mol·L-1)的水溶液中，调节pH＝6.0，加入酶量为250U/g的α-淀粉酶，于50℃酶解30min，再加入酶量为200U/g的纤维素酶继续酶解90min，得到酶解液；酶解完成后于90℃灭酶，将灭酶后的酶解液于4000r/min、25℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为12.98％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为98.17％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于50℃下真空浓缩至原体积的1/8后冷却，按1∶2的体积比向浓缩液中加入饱和氯化钠溶液，25℃静置 12h，使花生多糖充分沉淀，再于4000r/min、25℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例12

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入35ml含有0.005mol·L-1的K+的水溶液中，调节pH＝6.5，加入酶量为300U/g的纤维素酶，于55℃酶解45min，得到酶解液；酶解完成后于100℃灭酶。将灭酶后的酶解液于5000r/min、15℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5-二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为9.16％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为95.69％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于70℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷却，按1∶2的体积比向浓缩液中加入饱和醋酸钾溶液，15℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于5000r/min、15℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

实施例13

取1g粉碎、回流后的花生粕微粉，加入40ml含有K+和Ca2+(K+和Ca2+的总浓度为0.002mol·L-1)的水溶液中，调节pH＝6.5，加入酶量为350U/g的α-淀粉酶，于45 ℃酶解45min，得到酶解液；酶解完成后于100℃灭酶。将灭酶后的酶解液于4000r/min、 15℃条件下离心10min，取上清液，得到含有花生多糖的溶液，采用苯酚-硫酸法和3，5- 二硝基水杨酸法测定此条件下花生多糖的得率(干基比)为10.98％。离心后的沉淀残渣经干燥即得花生浓缩蛋白，其蛋白质保留率为92.45％。将上清液(即含有花生多糖的溶液)于50℃下真空浓缩至原体积的1/4后冷却，按1∶6的体积比向浓缩液中加入体积百分比浓度为95％的乙醇，15℃静置8h，使花生多糖充分沉淀，再于4000r/min、15 ℃条件下离心20min，收集沉淀；沉淀依次用无水乙醇和丙酮反复洗涤数次，得花生多糖沉淀，冷冻干燥得花生多糖干粉。

本发明的技术方案中所述金属离子为K+、Mg2+、Al3+、Ca2+、Fe3+、Cu2+或Zn2+中的任几种的混合物时，对其中各离子之间的比例没有要求，只要总浓度为0～0.005 mol·L-1即可。

下面将通过动物实验来说明本方法制备的花生多糖的保肝生理活性及其效果。

一、四氯化碳模型

1.实验材料

(1)动物：SPF级雄性昆明种小鼠，体重20.0±2.0g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物研究中心提供。

(2)试剂：四氯化碳(CCl4)，国药集团化学试剂有限公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

(3)药品：联苯双酯滴丸，浙江医药股份有限公司新昌制药厂；花生多糖：由实施例10方法制备。

2.方法与结果

(1)方法

小鼠正常饲养2d，随机分成正常对照组、CCl4模型组、花生多糖低、中、高剂量组及联苯双酯阳性对照组，每组10只。各组给药剂量如下：正常组及模型组给予生理盐水0.5ml/只、花生多糖低剂量组：花生多糖成人剂量、花生多糖中剂量组：花生多糖 2倍成人剂量、花生多糖高剂量组：花生多糖4倍成人剂量、联苯双酯阳性对照组：2 倍成人每日剂量。各组连续灌胃给药15天，末次给药2h后，除正常对照组腹腔注射等量生理盐水0.5ml/只外，其余各组小鼠均腹腔注射0.1％的CCl4花生油溶液10ml/kg 1次。各组均于末次给药后禁食不禁水16h，然后小鼠摘除眼球取血，分离血清备测血清中 ALT、AST活性；同时处死小鼠，立即破腹取肝脏，称重，计算肝脏指数；称取肝脏右叶组织，以1∶9(m/v)的生理盐水制成肝匀浆，分别测定肝组织中MDA、蛋白质含量和SOD酶活力。

(2)结果

表1结果显示，与正常组比较，CCl4肝损伤模型组肝脏中SOD含量极显著降低， MDA含量和肝脏指数均极显著增高(P＜0.01)，说明CCl4致小鼠急性肝损伤造模成功。与模型组比较，花生多糖低、中、高剂量组和联苯双酯组均可提高CCl4肝损伤小鼠肝脏中SOD的活性，并能抑制MDA含量和肝脏指数的升高，尤其是花生多糖中、高剂量组的效果极为显著(P＜0.01)，且花生多糖高剂量组的效果优于联苯双酯组。

表1 花生多糖对CCl4肝损伤小鼠肝脏SOD、MDA及肝脏指数的影响

注：*.与正常组比较，差异极显著(P＜0.01)；△.与模型组比较，差异显著(P＜0.05)；△ △.与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)。下同。

花生多糖对CCl4肝损伤小鼠血清转氨酶的影响结果如表2所示，模型组小鼠血清中的ALT与AST活性极显著地高于正常组(P＜0.01)。与模型组相比，花生多糖低、中、高剂量组，联苯双酯组的ALT、AST活性下降均达到了极显著水平(P＜0.01)，且花生多糖中剂量组的ALT、AST活性下降水平均低于花生多糖低、高剂量组。

表2 花生多糖对CCl4肝损伤小鼠血清转氨酶的影响

综合来看，表1、2表明，花生多糖能显著抑制四氯化碳性急性肝损伤所引起的 MDA含量、肝脏指数、ALT和AST活性的升高，有效地抑制肝脏中SOD活性的降低，说明花生多糖对四氯化碳性肝损害有较好的保护作用。

二、酒精模型

1.实验材料

(1)动物：SPF级雄性昆明种小鼠，体重20.0±2.0g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物研究中心提供。

(2)试剂：56°红星二锅头，北京红星股份有限公司；谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

(3)药品：维生素E，Sigma公司；花生多糖：由实施例10方法制备。

2.方法与结果

(1)方法

小鼠正常饲养2d，随机分成正常对照组、酒精模型组、花生多糖低、中、高剂量组及维生素E阳性对照组，每组10只。各组给药剂量如下：正常组及模型组给予生理盐水0.5ml/只、花生多糖低剂量组：花生多糖成人剂量、花生多糖中剂量组：花生多糖 2倍成人剂量、花生多糖高剂量组：花生多糖4倍成人剂量、维生素E对照组：2倍成人每日剂量。各组连续灌胃给药20天，末次给药2h后，除正常对照组灌胃等量生理盐水外0.5ml/只外，其余各组小鼠均灌胃56°红星二锅头15ml/kg 1次。各组均于末次给药后禁食不禁水16h，然后小鼠摘除眼球取血，分离血清备测血清中ALT、AST活性；同时处死小鼠，立即破腹取肝脏，称重，计算肝脏指数；称取肝脏右叶组织，以1∶9(m/v) 的生理盐水制成肝匀浆，分别测定肝组织中MDA、蛋白质含量和SOD酶活力。

(2)结果

与正常组比较，模型组小鼠肝脏中SOD活性降低，MDA含量和肝脏指数水平明显升高，有极显著的统计学差异(P＜0.01)，说明酒精致小鼠急性肝损伤模型建立成功，结果见表3。与模型组比较，花生多糖低、中剂量组与维生素E组均能提高小鼠酒精肝损伤的肝脏SOD活性，同时降低MDA的含量和肝脏指数，有显著差异(P＜0.05～0.01)；花生多糖各剂量组的SOD活性水平高于维生素E组。

表3 花生多糖对酒精肝损伤小鼠肝脏SOD、MDA及肝脏指数的影响

表4显示，酒精致急性肝损伤模型组小鼠血清的ALT、AST水平相对空白组有极显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，花生多糖低、高剂量组、维生素E组均能极显著降低血清中ALT、AST水平(P＜0.01)，随花生多糖剂量的增加，花生多糖各剂量组呈现出 ALT水平逐渐下降的趋势，花生多糖中、高剂量组的小鼠血清ALT水平明显低于维生素E组。

表4 花生多糖对酒精肝损伤小鼠血清转氨酶的影响

综合来看，表3、4表明，花生多糖能显著降低酒精性急性肝损伤所引起的MDA 含量、肝脏指数、ALT和AST活性的升高，拮抗肝脏中SOD活性的降低，证明花生多糖对酒精性肝损害的保护作用明显。