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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410333962.9 (22)申请日 2014.07.14 (73)专利权人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民 北路2999号 (72)发明人 朱利民巫寒冰权静 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 (51)Int.Cl. C08G 73/04(2006.01) C12N 15/63(2006.01) 审查员 杨欣 (54)发明名称 一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种易于DNA结。
2、合的转染试剂的 制备方法， 包括： 将聚乙烯亚胺PEI加入三蒸水 中， 水浴加热搅拌至溶解， 得到溶液A； 其中聚乙 烯亚胺PEI和三蒸水的比例为3g： 15ml； 将二氧化 碳通入溶液A中， 室温条件下， 持续鼓泡3-5h， 搅 拌， 得到溶液B； 然后冷冻干燥、 研磨， 得到改性聚 乙烯亚胺； 将上述B和质粒DNA按照不同N/P比加 入HBS缓冲溶液中， 迅速震荡， 得到PEI-CO2/pDNA 复合体。 本发明快速、 简捷、 高效、 低毒、 廉价并且 操作方便， 可用于基因转染方面， 具有广阔的应 用前景。 权利要求书1页 说明书3页 附图4页 CN 104163920 B 2016.0。
3、8.17 CN 104163920 B 1.一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 包括： (1)将聚乙烯亚胺PEI加入三蒸水中， 水浴加热搅拌至溶解， 得到溶液A； 其中聚乙烯亚 胺PEI和三蒸水的比例为3g： 15mL； (2)将二氧化碳通入溶液A中， 室温条件下， 持续鼓泡3-5h， 搅拌， 得到溶液B； 然后冷冻 干燥、 研磨， 得到改性聚乙烯亚胺； (3)将上述改性聚乙烯亚胺和质粒DNA按照不同N/P比加入HBS缓冲溶液中， 迅速震荡， 得到易于DNA结合的转染试剂PEI-CO2/pDNA复合体； 其中N/P比为2-70。 2.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备。
4、方法， 其特征在于： 所述 步骤(1)中聚乙烯亚胺PEI的重均分子量为25000。 3.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(1)中水浴加热搅拌具体为： 用数显磁力恒温搅拌器， 水浴温度控制在35-40， 加热搅 拌10-20min。 4.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(2)中冷冻干燥为先在-80冷冻， 然后在冻干机中干燥， 冷冻干燥时间为2-3d。 5.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(2)中改性聚乙烯亚胺中， 每个聚乙烯亚胺PEI分。
5、子中有40-55的氨基被酰胺化。 6.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(3)中质粒DNA是由SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提大肠杆菌中的质粒所得。 7.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(3)中HBS缓冲溶液是由20mMHEPES， 150mMNaCl组成， 并且pH调到7.4。 8.根据权利要求1所述的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(3)中迅速震荡为用微型旋涡混合仪震荡使两种物质充分混合缠绕缩合成复合物。 9.根据权利要求1所述的一种易于。
6、DNA结合的转染试剂的制备方法， 其特征在于： 所述 步骤(3)中N/P为50-70。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104163920 B 2 一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法 技术领域 0001 本发明属于转染试剂制备方法领域， 特别涉及一种易于DNA结合的转染试剂的制 备方法。 背景技术 0002 基因治疗可用十先天性遗传疾病(血友病、 肌肉萎缩症、 囊胞性纤维症等)和严重 后天获得性疾病(心血管疾病、 创伤、 感染性疾病和癌症等)的治疗。 但是缺乏高效低毒的基 因运送载体成为基因治疗的主要障碍。 近年来， 非病毒载体受到关注， 由于非病毒载体是病 毒载体的重要补充途径,转染效。
7、率较低， 但一般比病毒载体安全， 体内可反复应用。 基于表 达质粒的转染,目前人们努力改善非病毒载体。 非病毒载体通常利用多价阳离子聚合物或 脂质体来包裹质粒DNA或反义寡核苷酸， 利用表面多余的阳离子电荷粘附在细胞表面,进入 细胞。 近几十年， 非病毒载体有了很大的提高， 所用阳离子聚合物基因载体由十具有无基因 尺寸限制、 可大量生产且产品质量重复性好、 价格低、 使用简单方便、 易于修饰等优点， 受到 研究者的广泛关注。 其中， 聚乙烯亚胺(Polyethylenimine， PEI)由于具有较高的电荷密度 以及良好的质子缓冲能力而受到广泛的关注， 是目前研究最多的阳离子聚合物基因载体之 。
8、一： 25kDa支化PEI(25kDabPEI)和22kDa线性PEI(22kDa1PEI)在目前的高分子基因载体领 域被称作 “黄金标准” 。 然而这两种PEI的分子量较高、 其复合物表面电荷密度较高， 具有较 高的细胞毒性， 其最主要原因是表面有大量氨基， 导致细胞毒性很大， 因此PEI在基因转染 方面受到很大的限制， 由于PEI对CO2有很强的吸附作用， 而且吸附后相对稳定， 分解温度在 100200。 鉴于以上原因， 这种改性后的PEI衍生物显得意义重大。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 该 方法快速、 简便、 低毒、 高效、。
9、 廉价并且操作方便； 该发明所使用的原材料易得， 具有良好的 生物相容性， 具有应用其做后相关实验分析的潜力。 0004 本发明的一种易于DNA结合的转染试剂的制备方法， 包括： 0005 (1)将聚乙烯亚胺PEI加入三蒸水中， 水浴加热搅拌至溶解， 得到溶液A； 其中聚乙 烯亚胺PEI和三蒸水的比例为3g： 15ml； 0006 (2)将二氧化碳通入溶液A中， 室温条件下， 持续鼓泡3-5h， 搅拌， 得到溶液B； 然后 冷冻干燥、 研磨， 得到改性聚乙烯亚胺； 0007 (3)将上述改性聚乙烯亚胺和质粒DNA按照不同N/P比加入HBS缓冲溶液中， 迅速震 荡， 得到PEI-CO2/pDNA。
10、复合体； 其中N/P比为0-70； 0008 (4)所述步骤(1)中聚乙烯亚胺PEI的重均分子量为25000。 0009 所述步骤(1)中水浴加热搅拌具体为： 用数显磁力恒温搅拌器， 水浴温度控制在 35-40， 加热搅拌10-20min。 0010 所述步骤(2)中冷冻干燥为先在-80冷冻， 然后在冻干机中干燥， 冷冻干燥时间 说明书 1/3 页 3 CN 104163920 B 3 为2-3d。 0011 所述步骤(2)中改性聚乙烯亚胺中， 每个聚乙烯亚胺PEI分子中有40-55的氨 基被酰胺化。 0012 所述步骤(3)中质粒DNA是由SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提大肠杆。
11、菌 中的质粒所得。 0013 所述步骤(3)中HBS缓冲溶液是由20mMHEPES， 150mMNaCl组成， 并且pH调到7.4。 0014 所述步骤(3)中迅速震荡为立刻用WH-2微型旋涡混合仪震荡使两种物质充分混合 缠绕缩合成复合物。 0015 所述步骤(3)中N/P比的计算公式为： N/PratioM/(Q*3)(M为改性后PEI中N原子 的数量(nmol)， Q为DNA的质量( g)。 0016 所述步骤(3)中N/P比为0-70是当PEI-CO2含量达到N/P为2时才能压缩DNA形成复 合物， N/P小于2时不能形成复合物， 当N/P为50-70时形成的复合物最稳定。 0017 本。
12、发明利用pDNA与改性后PEI很好缩合的特点， 得到了一种更简单、 更省时、 更低 毒、 更快速的用于转染的基因复合物的方法。 0018 有益效果 0019 (1)本发明方法快速、 简捷、 低毒、 高效、 廉价并且操作方便； 0020 (2)本发明所使用的原材料廉价易得， 具有良好的生物相容性， 具有应用其做后相 关实验分析的潜力。 附图说明 0021 图1为分别将超支化PEI和所制备的黄色粉末PEI-CO2溶于氘代水， 所示的核磁共 振碳谱图； 0022 图2为超支化PEI和所制备的黄色粉末PEI-CO2分别与pDNA在不同N/P比下的凝胶 电泳结果； 0023 图3为超支化PEI和所制备的。
13、黄色粉末PEI-CO2的酸碱缓冲能力图； 0024 图4为超支化PEI和所制备的黄色粉末PEI-CO2的蛋白质吸附对比图； 0025 图5为超支化PEI和所制备的黄色粉末PEI-CO2的细胞毒性对比图。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0027 实施例1 0028 (1)将3g支化PEI加入15mL三蒸水中加热搅拌使其迅速溶解， 得到溶液A； 0。
14、029 (2)将二氧化碳(CO2)通入A溶液中， 室温下， 持续鼓泡5h， 并搅拌使反应充分， 得到 溶液B。 将溶液B取2mL与EP管中， 冷冻干燥， 研磨， 即得改性后的黄色固体粉末。 依照以上步 骤所得到黄色粉末和支化PEI分别取80mg溶于1.5mL的D2O， 做核磁共振碳谱， 所得到结果如 图1所示。 说明书 2/3 页 4 CN 104163920 B 4 0030 实施例2 0031 (1)凝胶电泳实验用于评价载体与基因结合的能力， 取1 gpDNA与适当实施例1的 黄色粉末和超支化PEI， 制备不同N/P比(N/P0、 0.5、 1、 1.5、 2、 3、 4、 5)的含复合物。
15、的PBS溶 液并调控最终的体积为3 L,并加入1ul含嗅酚蓝的6X上样缓冲液(50甘油+0.25嗅酚 蓝)。 0032 (2)配置0.8琼脂糖的Tris-boricacid-EDTA(TBE)缓冲溶液pH8.3， 待琼脂糖 凝胶冷却凝固后， 将上述的配置好的混合溶液加入上样孔。 120V的电压持续电泳30分钟， 取 出凝胶并将其用EB浓度为0.5 g/mL的TBE溶液染色。 0033 (3)用GelDocXR+成像系统(BioradLaboratories,Hercules,CA)进行考察。 所 得到结果如图2所示 0034 实施例3 0035 (1)将实施例1的黄色粉末和超支化PEI配置30。
16、mL聚合物浓度为0 .2mg/mL的 150mMNaCI水溶液， 用0.1M的HCl溶液将聚合物溶液的pH值调节至2附近。 快速搅拌下， 将聚 合物溶液在室温下用0.1M的NaOH溶液滴定， 采用SartoriusPB-10pH计测试溶液的pH值。 0036 (2)用Origin8.0将测得的pH值绘制成随着0.1M的NaOH体积增加的变化曲线， 所 得到结果如图3所示 0037 实施例4 0038 (1)将1mL实施例1的黄色粉末和超支化PEI(1mg/mL)溶液与1mL的牛血清白蛋白溶 液(2mg/mL)混合， 在37摇匀30分钟。 30分钟后， 将溶液离心并小心提取上清液， 利用紫外 一。
17、可见分光光度计测试其在280nm的紫外吸收。 上清液中BSA的浓度可以通过已知的BSA标 准曲线计算出， 进而计算出牛血清白蛋白的吸附值A 0039 (2)将吸附值A用Origin8.0作图， 所得到结果如图4所示 0040 实施例5 0041 (1)将Hela细胞接种在96孔板， 每孔细胞数为1104个。 37,5CO2环境下将细胞 培养24小时后， 用预热后的PBS缓冲液冲洗， 加入1640培养基。 在孔板中加入不同浓度的实 施例1的黄色粉末及PEI25K溶液， 每个浓度设置5个重复样， 细胞培养48小时后用PBS冲洗， 更换含0.5mg/mLMTT的1640培养基， 继续培养4小时后弃去培养基， 每孔加入150 L的DMSO 溶液以溶解所生成的沉淀物。 用TheretoMK3的ELISA酶标仪记录溶液在570nm处的OD值， 计 算细胞的存活率。 0042 (2)将计算的存活率用Origin8.0作图， 所得到结果如图5所示。 说明书 3/3 页 5 CN 104163920 B 5 图1 说明书附图 1/4 页 6 CN 104163920 B 6 图2 说明书附图 2/4 页 7 CN 104163920 B 7 图3 图4 说明书附图 3/4 页 8 CN 104163920 B 8 图5 说明书附图 4/4 页 9 CN 104163920 B 9 。