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1、(10)授权公告号 CN 101490092 B (45)授权公告日 2011.11.09 CN 101490092 B *CN101490092B* (21)申请号 200780026826.3 (22)申请日 2007.02.28 194965/2006 2006.07.14 JP C08B 37/00(2006.01) A23K 1/16(2006.01) A23L 1/30(2006.01) A61K 8/02(2006.01) A61K 8/60(2006.01) A61K 8/99(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61Q 19/10(2006.01) C。
2、12P 19/04(2006.01) A61K 35/74(2006.01) (73)专利权人 生物医学研究集团有限公司 地址 日本东京 专利权人 自然免疫应用技研株式会社 杣源一郎 (72)发明人 杣源一郎 河内千惠 稻川裕之 西泽孝志 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 陈昕 JP 特开昭 58-4724 A,1983.01.11,149. US 5236709 A,1993.08.17,说明书第2栏第 18 至 26 行 , 摘要 . Takashi NISHIZAWA, et al.Homeostasis as regulated by a。
3、ctivated macrophage. .L ipopolysaccharide(LPS) from wheat flour: isolation, purification and some biological activities. Chem. Pharm. Bull. .1992, 第 40 卷 ( 第 2 期 ),479-483. Takashi NISHIZAWA, et al.Homeostasis as regulated by activated macrophage. .L ipopolysaccharide(LPS) from wheat flour: isolatio。
4、n, purification and some biological activities. Chem. Pharm. Bull. .1992, 第 40 卷 ( 第 2 期 ),479-483. (54) 发明名称 鲎-阳性糖脂的生产方法， 鲎-阳性糖脂以及 含鲎 - 阳性糖脂的组合物 (57) 摘要 现已发现鲎 - 阳性糖脂存在于来源于黄单胞 菌属的黄原胶中， 可从市场上买到并已食用多年， 经过提纯， 发现这种鲎 - 阳性糖脂具有免疫增强 作用。本申请提供一种安全且廉价生产含高浓度 免疫增强剂的鲎 - 阳性糖脂的方法。用于生产本 发明的鲎 - 阳性糖脂的方法， 包括从黄原胶提取 鲎-阳性。
5、糖脂。 含有鲎-阳性糖脂的鲎-阳性糖脂 组合物可用于各种用途如药物、 动物用药物、 准药 物、 化妆品、 食品、 功能性食品、 饲料以及沐浴剂。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2009.01.14 (86)PCT申请的申请数据 PCT/JP2007/053742 2007.02.28 (87)PCT申请的公布数据 WO2008/007476 JA 2008.01.17 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 安娜 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101490092 B1/1 页 2 1. 鲎 -。
6、 阳性糖脂的生产方法， 包括从黄原胶提取鲎 - 阳性糖脂。 2.根据权利要求1的鲎-阳性糖脂的生产方法获得的鲎-阳性糖脂， 其中， 鲎-阳性糖 脂的分子量分布于 2000 4000Da。 3. 鲎 - 阳性糖脂组合物， 含有权利要求 2 的鲎 - 阳性糖脂。 4.根据权利要求3的鲎-阳性糖脂组合物， 其中所述鲎-阳性糖脂组合物是药物、 化妆 品、 食品、 饲料或沐浴剂。 5. 根据权利要求 3 的鲎 - 阳性糖脂组合物， 其中所述鲎 - 阳性糖脂组合物是动物用药 物。 6. 根据权利要求 3 的鲎 - 阳性糖脂组合物， 其中所述鲎 - 阳性糖脂组合物是功能性食 品。 权 利 要 求 书 CN 。
7、101490092 B1/6 页 3 鲎-阳性糖脂的生产方法， 鲎-阳性糖脂以及含鲎-阳性糖 脂的组合物 技术领域 0001 本发明涉及一种适合于黄原胶鲎 - 阳性糖脂的生产方法， 所述鲎 - 阳性糖脂是一 种免疫增强剂并且在用于植物和动物如包括人在内的哺乳动物 ( 特别是家畜、 宠物动物 等 )、 鸟类 ( 特别是家禽、 宠物鸟等 )、 两牺动物、 爬虫类、 鱼 ( 特别是宠物鱼等 ) 和无脊椎动 物的药物、 准药物、 化妆品、 功能性食品、 饲料、 肥料以及沐浴剂中添加时是安全的， 本发明 还涉及一种含鲎 - 阳性糖脂的组合物。 背景技术 0002 现在有一个急迫的问题是， 制定疾病预防和。
8、治疗的方法包括感染预防技术， 用于 包括人类在内的哺乳动物 ( 特别是家畜、 宠物动物等 )、 鸟类 ( 特别是家禽、 宠物鸟等 )、 两 牺动物、 爬虫类、 鱼 ( 特别是宠物鱼等 ) 和无脊椎动物。此外， 为了达到此目的， 强烈要求决 不使用化学品， 没有环境污染， 不产生耐性菌并且不在人体内积累的方法。 本发明人早已发 现由天然产物衍生的免疫增强剂能安全地实现疾病的预防和治疗效果的上述问题 ( 非专 利文献 1)。作为它的一个例子， 有可能使用由在小麦粉的情况下是常有微生物的稻谷病原 细菌 (Pantoea agglomerans) 获得的脂多糖 ( 非专利文献 1)。已知鲎 - 阳性糖。
9、脂具有潜在 的免疫增强活性 ( 非专利文献 2)。这种鲎 - 阳性糖脂包括所谓的脂多糖。早已了解脂多糖 是革兰氏阴性菌细胞外壁的主要成分同时是 Coley s 疫苗的主要成分且具有潜在的免疫 增强活性 ( 非专利文献 3)。 0003 本发明人已经发现鲎 - 阳性糖脂存在于小麦粉中， 其部分在小麦情况下是共生的 常有微生物的脂多糖， 它们强烈地增强先天性免疫(非专利文献4)。 加之， 上述两种安全而 有效地增效先天性免疫并且对于包括传染性疾病的各种疾病通过经皮或口服给药能显示 防护和治疗的效果 ( 非专利文献 5)。此外， 本发明人报道了一种新型的免疫增强剂的发酵 小麦提取物， 不仅使该提取物。
10、中来源于稻谷病原细胞的脂多糖含量提高了， 而且使该提取 物还含有通过在稻谷病原细胞情况下发酵小麦粉来源于小麦的成分， 稻谷病原细胞是在小 麦情况下共生的常有微生物， 对预防感染行使安全的作用和代替抗菌素物质的无麻烦的天 然物质或在动物产业和水产养殖领域内化学品的作用。 0004 脂多糖的基本结构包含称作类脂A的脂类以及与之共价键结合的各种糖(多糖)。 在类脂A之后的部分包含就相关种类而言具有比较均匀结构的R核心和具有依据种类而定 的不同结构的 O- 抗原多糖部分 ( 非专利文献 7)。O- 抗原具有与 LPS( 脂多糖 ) 相同的低 聚糖特征的重复结构 ( 非专利文献 1)。此外， 脂多糖通常。
11、形成具有多个分子量的混合物。 还已知脂多糖具有依据其来源微生物而不同的结构。例如， 来源于沙门氏菌的脂多糖和来 源于大肠杆菌的脂多糖不仅在结构上而且在生物活性上都不同。 然而， 一般说来， 不容易确 定脂多糖的结构。因此， 对在许多革兰氏阴性细菌中的脂多糖结构和功能的细节至今并不 了解。因此， 已被说明的是脂多糖基于其功能差异而具有的新型结构。 0005 此外， 在近来的研究中证实了脂多糖是通过 TLR4 激活先天性免疫的 ( 非专利文 说 明 书 CN 101490092 B2/6 页 4 献 6)。现已发现脂多糖的类脂 A 部分对与 TLR4 的结合是重要的而且多糖部分极大地影响 TLR4。
12、 细胞内信号传导的效率。从上， 可以推测脂多糖细胞应答的差异被认为是结构差异所 造成的。 0006 重要的是制定能证实脂多糖经皮或口服给药是安全且无麻烦的脂多糖有用性。 在 古代用于生产和发酵食品的革兰氏阴性细菌就已得到了注意。也就是说， 当鲎 - 阳性糖脂， 特别是用来生产食物或为人类消耗提供发酵产品的脂多糖存在于革兰氏阴性细菌中时， 这 一事实证实了食用鲎 - 阳性糖脂或脂多糖的经验。这是一种发现， 既强有力地证明脂多糖 经皮或口服给药是安全的且无麻烦， 又促进了新型健康护理产品如化妆品和食物， 以及使 用这些物质的药品的发展。 0007 非专利文献 1Chie Kohchi 等人，“发酵。
13、小麦提取物的先天性免疫调节作 用” (“Innate Immunity Regulatory Action of FermentedWheat Extract” )， New Food Industry(2006)Vol.48， p.19-27。 0008 非专利文献 2Ulmer， A.J. 等人，“脂多糖 ： 结构、 生物活性、 受体和信号 传导” (“Lipopolysaccharide ： Structure， Bioactivity， Receptors， and Signal Transduction” )， Trends in Glycoscienceand Glycotechn。
14、ology， (2000)Vol.14， p.53-68。 0009 非 专 利 文 献 3Starnes， C.O.，“Coley s Toxins inPerspective” ， Nature， (1992)Vol.357， p.11-12。 0010 非 专 利 文 献 4Nishizawa， T. 等 人， Chem.Pharm.Bull.， (1992)Vol 40， p 479-483。 0011 非专利文献 5Hiroyuki Inagawa 等人，“具有巨噬细胞活性作用且来源于小麦 的脂多糖 (LPSw) 的各种病害治疗与预防效果” ， Biotherapy， (1991)V。
15、ol.5， p.617-621。 0012 非 专 利 文 献 6Kiyoshi Takeda 等 人，“Toll-like Receptorsin Innate Immunity” ， International Immunology， Vol.17， p.1-14。 0013 非专利文献 7 生化学事典第二版 (1990)， 东京化学同人， p.1949。 发明内容 0014 本发明拟解决的问题 0015 为了对人或动物口服或经皮给药， 安全性必须得到食用经验的支持。 例如， 用于制 造醋的醋酸菌是革兰氏阴性细菌， 其微生物细胞成分被包括在其发酵产物中， 因此可以说 已经食用多年。稻谷病原。
16、细胞提供黑面面包乳酸生长所需的叶酸， 当黑面面包被吃下时其 相当数量的微生物细胞成分被消化。 0016 黄原胶是由来自革兰氏阴性细菌的野油菜黄单胞菌 (Xanthomonascampestris) 产生的多糖， 并且包含甘露糖、 葡萄糖和葡糖醛酸。在黄原胶中， -1， 4- 结合的葡萄糖是 主链， 而在侧链中相对于主链中的每隔 1 个葡萄糖残基， 甘露糖两个分子和葡糖醛酸结合。 黄原胶具有很高的粘度， 对于酸、 盐和加热来说是稳定的， 广泛用作食品的增稠剂。日本大 约在 30 年前引入， 目前年消耗黄原胶 1300 吨或更多。以此， 黄原胶是用革兰氏阴性细菌发 酵的产物， 已食用多年。 001。
17、7 在本申请中， 发现直到现在尚未了解的鲎 - 阳性糖脂存在于来源于黄单胞菌属的 黄原胶中， 从市场上可以买到并已食用多年， 经过提纯， 可以发现这种鲎 - 阳性糖脂具有免 说 明 书 CN 101490092 B3/6 页 5 疫增强作用。 0018 用于解决问题的手段 0019 本发明鲎 - 阳性糖脂的生产方法包括从黄原胶提取鲎 - 阳性糖脂。 0020 本发明的鲎 - 阳性糖脂是通过上述生产鲎 - 阳性糖脂的方法获得的。 0021 本发明的鲎 - 阳性糖脂组合物含有上述鲎 - 阳性糖脂。 0022 鲎 - 阳性糖脂组合物是药物、 动物用药物、 准药物、 化妆品、 食品、 功能性食品、 饲。
18、 料或沐浴剂。 0023 本发明的效果 0024 按照本发明， 有可能获得无麻烦且安全的鲎-阳性糖脂， 因为已经发现鲎-阳性糖 脂存在于可从市场上买到且已食用多年的黄原胶中。这种鲎 - 阳性糖脂可以用于各种用途 如健康护理产品和含有该糖脂的药物， 因为该鲎 - 阳性糖脂已被提纯且被发现其具有免疫 增强的效果。 0025 本说明书引入了作为本申请优先权基础的日本专利申请号 2006-194965 说明书 和附图中所公开的内容。 具体实施方式 0026 鲎 - 阳性糖脂从黄原胶中的提取 0027 实施例 0028 1) 鲎 - 阳性糖脂从黄原胶中的提取 0029 把黄原胶 (1.00g)( 大日本。
19、住友制药 ) 加到 1 升的磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 中， 以 10 分钟在规格 6 使用 polytron 匀化。把多粘菌素 B(polymyxin B) 固化树脂 (5ml)( 由 加利弗尼亚的 BIO-RAD 提供 Affiprep polymyxin 载体 ) 加到所得到的 0.1 (w/v ) 黄 原胶的 PBS 溶液中， 该溶液用电磁搅拌器搅拌 4 小时。现已知道多粘菌素 B 与分子如具有 高脂质 - 溶解度的类脂 A 结合。搅拌后， 把溶液转移至 50ml 的离心管中， 该管再于室温 下以 2000rpm 离心 10 分钟。在完成离心之后， 弃掉上清液， 并收集作为沉淀的 。
20、Affiprep polymyxin载体。 往沉淀中添加10ml的PBS， 搅拌， 再于室温下以2000rpm的离心收集沉淀。 往沉淀中添加5ml的0.02N氢氧化钠水溶液， 搅拌1分钟， 再于室温下以2000rpm离心10分 钟。完成离心后， 把上清液收集到另外一个容器中。再次往沉淀中添加 0.02N 氢氧化钠水 溶液 5ml， 搅拌 1 分钟， 并于室温下以 2000rpm 离心 10 分钟。完成离心后， 把两份上清液合 并。立即加入 1ml 的 1 摩尔 / 升 (M) 三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris hydrochloride)， pH 7.0 以中和上清液。借助于苯酚 - 硫酸。
21、法鉴定所获得的溶液含糖。这样， 使该溶液制成 从黄原胶提取的含鲎 - 阳性糖脂的溶液。 0030 使用Endospecy(由生化学工业供应的 ； 不与-1， 3-葡聚糖反应的鲎试验)测定 鲎-阳性糖脂， 并且大约有4mg的鲎-阳性糖脂存在。 因为在黄原胶中含有约5mg的鲎-阳 性糖脂， 所以收率大约为 80。 0031 2) 鲎 - 阳性糖脂免疫增强作用的测量 0032 把鲎-阳性糖脂加入培养的小鼠巨噬细胞谱系细胞株的RAW264.7中， 并测量从细 胞中产生的一氧化氮。 0033 因为 RAW264.7 细胞是弱粘性的细胞， 所以细胞通过移液从培养瓶收集并使用培 说 明 书 CN 10149。
22、0092 B4/6 页 6 养液调节细胞浓度在 8105细胞 / 毫升。将细胞悬浮液 (100l) 转移至 96- 孔平底板的 各孔中， 当细胞几乎附着的 6 小时后用来检验。 0034 调节鲎 - 阳性糖脂浓度相当于脂多糖在稻谷病原细胞中的浓度为 4000ng/ml。进 一步完成以 10 倍 5 种比例的系列稀释。用所述培养液把各个稀释过的溶液再稀释两倍， 并 且使各稀释溶液用含 40g/ml 多粘菌素 B 的介质进一步稀释两倍。把所获得的溶液作为 加入已加入细胞的孔的标品使用。 0035 同时， 还检验从野油菜黄单胞菌提纯的脂多糖 (LPSx)， 把 100l 的各种标品加到 预先已在 9。
23、6- 孔平底板中加了细胞的每一个孔中。于 37下在 5二氧化碳气体培养器中 培养细胞 20 小时。培养完成后， 收集 50m 的培养悬浮液。按照标准方法使用 Griess 试 剂测量培养液中的一氧化氮代谢物的亚硝酸量。 0036 测量结果列于表 1 和 2 中。来自 100ng/ml 或更高浓度的黄原胶的鲎 - 阳性糖脂 提取溶液显示 NO 由 RAW264.7 细胞的产生。LPSx 的 NO 产生能力当在 7.0M 下对比时高 于鲎 - 阳性糖脂 22 倍 ( 为获得 7.0M 的亚硝酸浓度需要加入的鲎 - 阳性糖脂的数量为 2.8ng/ml， 由此 LPSx 的数量为 61.2ng/ml，。
24、 61.2/2.8 22)。在添加多粘菌素 B 组中， 通过 两种 100ng/ml 的样品未观察到 NO 的产生。因此， 可以鉴定它们具有与多粘菌素 B 结合的 结构。 0037 表 1 来源于黄原胶的鲎 - 阳性糖脂诱导 RAW264.7 细胞产生 NO 的能力。 0038 0039 各测量值皆用 4 例的平均值 标准偏差表示。 0040 表 2 来自用多粘菌素 B 预处理过的黄原胶的鲎 - 阳性糖脂诱导 RAW264.7 细胞 产生 NO 的能力。 0041 说 明 书 CN 101490092 B5/6 页 7 0042 各个测量值皆用 4 例的平均值 标准偏差表示。 0043 根据上。
25、述结果， 可以发现来自黄原胶的鲎-阳性糖脂具有诱导巨噬细胞产生NO的 作用， 但是生物活性不同于来自黄单胞菌属微生物细胞所获得的脂多糖 (LPSx)。这些结果 表示在它们之间存在着结构的差异。 0044 3) 测量从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂的分子量 0045 检测从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂的分子量。于是， 使 4g 的鲎 - 阳性糖脂与 样品缓冲液混合， 再使用三 ( 羟甲基 ) 甲基甘氨酸 (tricin) 完成十二烷基硫酸钠聚丙烯 酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。电泳后， 为了用肉眼观测脂多糖的分子通过 Sil-Best Stain Kit(Cat.No.30642-41， N。
26、acalai Tesque， Japan) 完成银着色。把 Prestained Protein Marker， Broad Range(Premixed Format)(Cat.No.7708L， NEW ENGLAND Biolabs) 作为分子 量大小标记器使用。结果， LPSx 样品在 2000 4500 道尔顿 (Da) 和 30 80kDa 中显示许 多梯形带。 在从黄原胶提取的鲎-阳性糖脂中， 检测出20004000Da中的带。 从黄原胶提 取的鲎 - 阳性糖脂的分子量是 2000 4000Da 而 LPSx 的分子量是 2000 4000Da 和 30 80kDa。这一结果证明。
27、了在它们之间存在结构的差异。 0046 4) 在从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂和 LPSx 之间的抗原性差异 0047 当从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂与从黄单胞菌属微生物细胞获得的脂多糖 (LPSx) 之间存在结构差异时， 抗原性差异出现并且抗体的反应性好象不同。于是， 将从黄 原胶提取的鲎 - 阳性糖脂对照 LPSx 用单克隆抗体染色。将鲎 - 阳性糖脂滴在聚偏氟乙烯 (PVDF)膜(由BIO-RAD提供)上， 接着于室温下通过使PVDF膜在含3牛血清白蛋白(BSA) 的 PBS 中培育来阻断非 - 特异反应 30 分钟 ( 阻断 )。接着， 用含 0.05吐温 20(Tween 20) 。
28、的 Tris 缓冲生理盐水 (TBS ： 20mM TrisHCl， pH 7.5， 150mM NaCl)。洗涤之后， 把含有对从 黄单胞菌属微生物细胞获得的脂多糖特异的抗体的培养液 5ml 作为初级抗体加入并于室 温下反应 60 分钟。 0048 ( 如下制作对黄单胞菌属脂多糖特异的单克隆抗体。使加热并杀死的黄单胞菌属 细胞与完全 Freund s 调节剂混合， 再按每只小鼠 1108细菌经腹腔内引入至 BALB/c 鼠。 以两周的时间间隔重复经腹腔内引入三次。在最终引入后的三天， 收集脾脏的细胞， 使用 50聚乙二醇 ( 平均分子量 ： 1000) 与骨髓瘤细胞 (P3U1) 融合。把融。
29、合的细胞悬浮于含有 10 FBS( 牛胎儿血清 ) 的 HAT 培养基中， 并于 37下的 5 CO2中在 96- 孔底平板上培养 并静置 7 天。通过公众已知的并且通用的 ELISA( 酶联免疫吸附试验法 ) 使用黄单胞菌属 脂多糖作为抗原检测取自菌落已形成的各孔中的培养上清液。 通过公众已知且通用的限制 稀释法克隆上面获得的生产单克隆抗体的细胞。结果， 抗黄单胞菌属脂多糖获得了 21 种鼠 性单克隆 IgG 抗体。) 0049 接着， 用含有 0.05吐温 20 的 Tris 缓冲生理盐水 (TBS ： 20mMTris HCl， pH 7.5， 150Mm NaCl)清洗PVDF膜5遍。。
30、 洗涤后， 使用含1BSA的PBS稀释1000倍的5ml碱性磷酸 酶 - 标识的抗鼠 IgM 山羊免疫球蛋白 (A9688， Sigma)， 使膜于室温下反应 60 分钟。随后， 用 含0.05吐温20的TBS洗涤膜5次， 洗涤之后， 加入含有产色物质， 0.01655-溴-4-氯-3 吲哚磷酸酯 (025-08651， 和光纯药， 日本 ) 和 0.033氮蓝四唑 (N-6876， Sigma) 的碱性磷 酸酶缓冲液(50mM TrisHCl， pH 9.5， 1mM MgCl2)5ml， 在此之后将PDVF膜转移至蒸馏水中以 终止反应。结果， 通过所有 21 种抗体检测 LPSx， 然而来。
31、自黄原胶的鲎 - 阳性糖脂与所述 20 说 明 书 CN 101490092 B6/6 页 8 种抗体不起反应， 而只与一种抗体起反应。用这种方法， 发现了从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖 脂具有与来自黄单胞菌属的脂多糖不同的抗原性。根据这一结果， 证明了从黄原胶提取的 鲎 - 阳性糖脂的结构与来自黄单胞菌属的脂多糖 (LPSx) 结构是不同的。 0050 5) 从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂的功能性食品实施例 0051 生产含有从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂的糖果 0052 在砂糖、 淀粉糖浆和水中通过把 1) 中生产的从黄原胶提取的鲎 - 阳性糖脂以 5 5 5 1 的比例添加所获得的混合物作为原料加热并于 120 140下蒸稠， 之后于 不锈钢板上冷却， 拉长成为棒状再模铸成小圆形约1g以便产生含有从黄原胶提取的鲎-阳 性糖脂的糖果。 0053 把适量的这种糖果加入 20ml 的水中借助加热使其溶解。测量在这种溶液中从黄 原胶提取的鲎 - 阳性糖脂质量， 其量为 6g/g。这种糖果为已感冒咽喉疼痛的 6 名男人和 女人摄取。之后马上就进行针对咽喉疼痛征求意见。所有 6 名成员都感觉他们的有关疼痛 已减退 ( 一种样品试验信号 ： p 0.03)。 0054 本说明书引证的所有出版物、 专利和专利说明书都作为参考直接引入本说明书。 说 明 书 。