酸性芦荟多糖及其制备纯化方法和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101724089 B (45)授权公告日 2011.08.24 CN 101724089 B *CN101724089B* (21)申请号 200910183529.0 (22)申请日 2009.09.23 C08B 37/00(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (73)专利权人 南京大学 地址 210097 江苏省南京市汉口路 22 号 (72)发明人 徐琛 阮小明 李洪森 郭彬歆 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 胡锡瑜 (54) 发明名称 酸性芦荟多糖及其制备纯化方法。

2、和应用 (57) 摘要 本发明属于生物制药技术领域， 具体涉及一 种酸性芦荟多糖的制备、 纯化以及其在抗幽门螺 旋杆菌及大肠杆菌药物中的应用。实验证明， 本 发明所涉及的以中华芦荟为原料， 采用热水提取， 乙醇沉淀的方法得到粗提物， 通过热水溶解， 三 氯乙酸除蛋白， 乙醇沉淀后得到粗多糖， 再经过 DEAE-52 离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖 的方法具有产物纯度高、 产率较大、 设备要求简 单、 重现性较好的特点 ( 见摘要附图 )。本发明的 酸性芦荟多糖可以有效降低幽门螺旋杆菌对 MKN 45 细胞黏附率。此外， 对于大肠杆菌黏附 LOVO 细 胞也有显著的抑制作用。说明此酸性芦荟多。

3、糖是 一种广谱的抗黏附剂， 并可以在制备抗幽门螺旋 杆菌黏附药物以及治疗幽门螺旋杆菌感染引起的 相关疾病中应用。 (51)Int.Cl. 审查员 张娜 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 CN 101724089 B1/1 页 2 1. 一种酸性芦荟多糖， 其特征是采用水提醇沉法从中华芦荟中提取并经 DEAE-52 阴 离子交换树脂纯化的方法制备得到的酸性芦荟多糖， 分子量为 29.39KDa， 单糖组成主要有 37半乳糖、 15.3阿拉伯糖、 9鼠李糖、 7.1甘露糖、 3.7葡萄糖以及 1.4木糖， 并含 有 25.6的。

4、糖醛酸。 2. 根据权利要求 1 所述酸性芦荟多糖的制备纯化方法， 其特征是由以下步骤构成 ： (1) 新鲜的芦荟叶片切碎后， 经过热水提取， 乙醇沉淀后得到粗提物， 芦荟多糖粗提物， 用 50 70乙醇浸泡 2 次， 每次 24 48h， 残渣挥干溶剂后， 溶于蒸馏水中， 离心除去不溶 物质， 上清液中加入三氯乙酸除蛋白， 静置过夜后离心取上清液， 并重复上述操作， 上清液 减压浓缩后加入 95乙醇静置过夜后离心， 沉淀烘干后得白色或浅黄色块状固体， 即为芦 荟粗多糖 ； (2) 芦荟粗多糖经过离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖， 采用 DEAE-52 阴离子交 换树脂， 首先使用蒸馏水洗脱。

5、， 之后采取0.10.4M NaCl溶液洗脱， 收集洗脱液后， 苯酚硫 酸法测定每管洗脱液中多糖含量， 合并洗脱液， 浓缩、 透析、 冻干即得本发明的精制酸性芦 荟多糖。 3. 根据权利要求 1 所述的酸性芦荟多糖在制备抗幽门螺旋杆菌黏附药物以及治疗幽 门螺旋杆菌感染引起的相关疾病药物中的应用。 4. 根据权利要求 1 所述的酸性芦荟多糖在制备针对大肠杆菌及其他革兰氏阴性菌的 抗黏附药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101724089 B1/3 页 3 酸性芦荟多糖及其制备纯化方法和应用 一、 技术领域 0001 本发明属于生物制药技术领域， 具体涉及酸性芦荟多糖的制备、 纯化以及在制。

6、备 抗幽门螺旋杆菌黏附药物和治疗幽门螺旋杆菌引起的相关疾病中的应用。 二、 背景技术 0002 芦荟自古以来就被作为一种药食两用植物而广泛应用。 现代药理研究表明芦荟具 有杀菌、 消炎、 泻下、 抗氧化、 抗辐射、 抗溃疡以及抗肿瘤等作用。据国内外的研究报道， 芦 荟所含的活性成分有两大类， 一类是存在于芦荟叶片底部及表皮附近的芦荟素等蒽醌类物 质， 另一类是从芦荟鲜叶薄壁管胞中分离出的芦荟凝胶， 其中约 98.5是天然水分， 而碳水 化合物粘多糖则约占总固体量的60以上。 作为芦荟凝胶的主要有效成分之一的芦荟 多糖， 其药理学研究也逐渐活跃。 近年来的研究表明， 芦荟多糖具有抗衰老、 抗辐射。

7、、 抗胃溃 疡、 抗肿瘤、 免疫调节等多种药理作用。因此， 芦荟多糖对于这些相关疾病具有潜在的预防 或治疗作用。但目前尚未见其在抵抗幽门螺旋杆菌等细菌黏附方面的研究报道。 0003 幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 是一种革兰氏阴性、 S 形或弧形弯曲的细菌。 许多证据显示胃十二指肠疾病和幽门螺杆菌之间有紧密联系， 可诱发人类的慢性胃炎、 消 化性溃疡、 胃粘膜相关性淋巴样组织淋巴瘤、 肠性胃癌。 世界卫生组织已将幽门螺杆菌列为 I 类致癌物， 它是胃癌的主要诱发因子。目前幽门螺旋杆菌的治疗方案主要是采用三联疗 法， 但随着抗生素的广泛应用， 耐药菌株的发生率逐渐增加导致。

8、治疗失败。 0004 研究证明， 细菌对宿主细胞的黏附是引起后期一系列病理变化并引发相关疾病的 关键步骤。抗黏附剂可阻断这一关键步骤， 从而预防和治疗细菌感染造成的疾病。与传统 杀菌剂相比， 抗黏附剂不直接杀死细菌， 这样就有效防止了耐药菌株的产生。 本发明中的酸 性芦荟多糖阻断幽门螺旋杆菌与宿主细胞的黏附过程， 与传统的抗菌治疗相比具有不易产 生耐药菌株的特点， 是一种治疗或预防幽门螺旋杆菌引起的相关疾病的新手段。 同时， 它也 可以抑制大肠杆菌的黏附， 显示出一定的广谱抗黏附效果。 三、 发明内容 0005 本发明需要解决的问题 ： 0006 本发明致力解决酸性芦荟多糖的制备、 纯化以及在。

9、制备抗幽门螺旋杆菌黏附药物 和治疗幽门螺旋杆菌感染引起的相关疾病中的应用。 0007 本发明的技术方案 ： 0008 (1) 本发明所述的酸性芦荟多糖， 是采用水提醇沉法从中华芦荟中提取并经 DEAE-52 阴离子交换树脂纯化的方法制备得到， 其分子量约为 29.39KDa， 单糖组成主要有 37半乳糖、 15.3阿拉伯糖、 9鼠李糖、 7.1甘露糖、 3.7葡萄糖以及 1.4木糖， 并含 有 25.6的糖醛酸 ； 0009 (2) 酸性芦荟多糖制备纯化方法是以中华芦荟为原料， 采用热水提取， 乙醇沉淀的 方法得到粗提物， 通过热水溶解， 三氯乙酸除蛋白， 乙醇沉淀后得到粗多糖。 再经过DEA。

10、E-52 说 明 书 CN 101724089 B2/3 页 4 离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖 ； 0010 (3) 本发明中的酸性芦荟多糖可以显著降低幽门螺旋杆菌对 MKN 45 细胞的黏附 率， 并呈一定的剂量相关， 可在开发抗幽门螺旋杆菌黏附药物以及治疗幽门螺旋杆菌感染 引起的相关疾病中应用。 0011 (4) 本发明中的酸性芦荟多糖还可以显著降低大肠杆菌对 LOVO 细胞的黏附率， 显示本发明中的多糖具有广谱的抗黏附效果， 可以在制备针对其他细菌的抗黏附药物中应 用。 0012 本发明与现有技术相比， 其有益效果是 ： 0013 (1) 本发明以中华芦荟为原料， 采用热水提取， 。

11、乙醇沉淀的方法得到粗提物， 通过 热水溶解， 三氯乙酸除蛋白， 乙醇沉淀后得到粗多糖。再经过 DEAE-52 离子交换柱层析纯化 得到酸性芦荟多糖， 该方法具有产物纯度高、 产率较大、 设备要求简单、 重现性较好的特点， 为酸性芦荟多糖的进一步应用提供了基础和依据 ； 0014 (2) 本发明以制备的酸性芦荟多糖为研究对象， 综合运用药理学、 生物学方法， 揭 示了酸性芦荟多糖可以显著降低幽门螺旋杆菌对 MKN 45 细胞的黏附率， 并呈一定的剂量 相关， 可在开发抗幽门螺旋杆菌及大肠杆菌黏附药物中应用。并能成为一种潜在的抗细菌 黏附药物。 0015 (3) 此外， 本发明中的酸性芦荟多糖还可。

12、以显著降低大肠杆菌对 LOVO 细胞的黏附 率， 显示本发明中的多糖具有广谱的抗黏附效果。 并能成为一种潜在的广谱性抗黏附药物。 四、 附图说明 0016 图 1 ： 酸性芦荟多糖提取、 分离及纯化流程图。 0017 图 2 ： 酸性芦荟多糖对幽门螺旋杆菌黏附 MKN45 细胞的抑制效果。对照组未经酸 性芦荟多糖处理， 其幽门螺旋杆菌黏附率作为 100。其他组分别与对照组相比， 得到相对 黏附率 ( )。数据经过 T 检验， 与对照组相比， p 0.05 被认为存在显著性差异。其中， *p 0.05，*p 0.01，*p 0.001。 0018 图 3 ： 酸性芦荟多糖对大肠杆菌黏附 LOVO。

13、 细胞的抑制效果。对照组未经酸性 芦荟多糖处理， 其大肠杆菌黏附率作为 100。其他组分别与对照组相比， 得到相对黏附 率 ( )。数据经过 T 检验， 与对照组相比， p 0.05 被认为存在显著性差异。其中， *p 0.001。 五、 具体实施方式 0019 通过以下实施例进一步详细说明本发明， 但应注意本发明的范围并不受这些实施 例的任何限制。 0020 材料与来源 ： 0021 试剂 ： 乙醇(南京化学试剂公司) ； 苯酚(天津市化学试剂一厂) ； 三氯乙酸(上海 凌峰化学试剂有限公司) ； 硫酸(南京化学试剂有限公司) ； FITC(SIGMA公司) ； 氯化钠(南 京化学试剂公司)。

14、 ； 1640培养基(Gibco公司) ； Columbia培养基(biomrieux， France) ； 琼 脂粉 ( 上海医药化工集团 ) ； 酵母浸膏 ( 南京大治生物技术有限公司 )。 0022 材料 ： 幽门螺旋杆菌(美国菌种保存中心) ； 大肠杆菌(南京大学功能生物分子研 说 明 书 CN 101724089 B3/3 页 5 究所 )。 0023 器材 ： UV-2201紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司) ； 高速冷冻离心机(日 本 Hitachi 公司 ) ； 旋转蒸发器 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) ； BSZ-100 自动部份收集器 ( 上海 沪西分析仪器厂有限。

15、公司 ) ； 酶标仪 (TECAN 公司 )。 0024 实施例 1 酸性芦荟多糖的制备和纯化 0025 (1) 新鲜的芦荟叶片切碎后， 经过热水提取， 乙醇沉淀后得到粗提物。称取适量的 粗提物， 用 50 70乙醇浸泡两次， 每次 24 48h， 残渣挥干溶剂后， 搅拌溶于适量蒸馏 水， 离心除去不溶物质。上清液中加入三氯乙酸除蛋白， 静置过夜后离心取上清， 重复上述 操作。上清减压浓缩后加入 95乙醇静置过夜后离心， 沉淀烘干后得白色或浅黄色块状固 体， 即为芦荟粗多糖 ； 0026 (2) 芦荟粗多糖经过离子交换柱层析纯化得到酸性芦荟多糖。采用 DEAE-52 阴离 子交换树脂， 首先使。

16、用蒸馏水洗脱， 之后采取0.10.4M NaCl洗脱， 收集洗脱液， 苯酚硫酸 法测定每管洗脱液中多糖含量， 合并洗脱液， 浓缩、 透析、 冻干即得本发明的精制酸性芦荟 多糖。该法重现性好、 产率稳定， 可为后续试验提供样品。流程图见附图 1。 0027 实施例 2 酸性芦荟多糖对幽门螺旋杆菌黏附 MKN 45 细胞的抑制作用 0028 (1) 幽门螺旋杆菌划线法接种在哥伦比亚琼脂培养基上 ( 含有 7新鲜羊血 )， 于 37微需氧环境下培养 3 天。之后刮取菌落置于灭菌的生理盐水中， 调菌液为适当浓度。 向调制好浓度的菌液中加入 FITC-DMSO 溶液， 室温孵育 1 3h。然后将标记好的。

17、菌悬液离 心， 倒出上清， 加入含有吐温 -20 的 D-Hanks 溶液反复吹打数次， 继续离心， 重复以上操作 2 次， 洗去未标记上的 FITC。 0029 (2) 将培养在 96 孔板中的 MKN45 细胞原培养液弃去， 换上含有 2小牛血清及不 同浓度酸性芦荟多糖的1640培养液。 每12个孔一组， 酸性芦荟多糖的含量分别为0、 0.01、 0.1、 0.5、 1.0mg/ml， 37中预孵 1h。之后， 在避光条件下向对应的孔中每孔加入 50l 的 已经标记的菌液轻轻摇晃混匀， 37避光孵育 1h。然后， 弃去含有菌和药物的培养液， 洗 去未黏附的细菌， 于荧光酶标仪测定每孔的荧光。

18、量， 其中激发波长为 485nm， 而发射波长为 528nm。实验结果见图 2。 0030 图 2 结果表明， 与对照组相比， 酸性芦荟多糖在浓度为 0.1、 0.5、 以及 1.0mg/ml 时 幽门螺旋杆菌对MKN45细胞的黏附率分别降至88(p0.05)， 76(p0.01)以及64 (p 0.001)。 0031 实施例 3 酸性芦荟多糖对大肠杆菌黏附 LOVO 细胞的作用 0032 LOVO 细胞用含有 10小牛血清的 1640 培养基培养 48h 后， 种 96 孔板培养。大 肠杆菌用 LB 培养基培养 24h 后刮取菌落， 按照上述方法用 FITC 标记。将在 96 孔板中培 养。

19、 24h 后的 LOVO 细胞原培养液弃去， 每 12 孔一组， 分别加入酸性芦荟多糖含量分别为 0、 0.01、 0.1、 0.5、 1.0mg/ml 并含有 2小牛血清的 1640 培养基， 孵育 1h。之后加入 FITC 标记 的大肠杆菌孵育 1h 后， 洗去未黏附的细菌， 酶标仪测定荧光值。结果见图 3。 0033 图 3 结果表明， 与对照组相比， 酸性芦荟多糖在浓度为 0.5 和 1.0mg/ml 时大肠杆 菌对 LOVO 细胞的黏附率分别降至 78 (p 0.001) 和 68 (p 0.001)。 说 明 书 CN 101724089 B1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101724089 B2/2 页 7 图 3 说 明 书 附 图 。