ABCA3基因在制备先天性CCMC诊断制品中的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310468448.1 (22)申请日 2013.10.09 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 山东省眼科研究所 地址 266071 山东省青岛市市南区燕儿岛路 5 号 专利权人 深圳华大基因研究院 (72)发明人 陈鹏 代云海 谢立信 王晔 肖晶晶 张清岩 管李萍 王俊 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 (54) 发明名称 ABCA3 基因在制备先天性 CCMC 诊断制品中的 应用 (57) 摘要 本发明的目的是提供一种。

2、 ABCA3 基因在制备 检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)诊断制 品中的应用， 本发明提供了 ABCA3 基因的新的用 途， 从而提供了一种有效的进行先天性 CCMC 疾病 基因诊断、 产前基因筛查及遗传咨询的途径， 应用 效果表明本发明所提供的基因的 SNP 位点及检测 引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水 进行 ABCA3 基因突变位点的快速检测。 (51)Int.Cl. 审查员 马艳林 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图4页 CN 103589787 B 2016.06.01 CN 103589787 B 。

3、1.一种ABCA3基因的SNP位点的应用， 其特征在于， 所述的应用是制备先天性白内障-小 角膜综合征(CCMC)的诊断制品； 其中SNP位点为NCBI编号为NM_001089的ABCA3基因编码区 域由起始密码子起第4393位,其碱基为G或A。 2.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的诊断制品为PCR检测引物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103589787 B 2 ABCA3基因在制备先天性CCMC诊断制品中的应用 技术领域 0001 本发明属于基因诊断与产前基因诊断的相关技术领域， 具体涉及ATP连接盒 （ABC） 转运子A3 （ABCA3） 在制备检测先天性白内障-小角。

4、膜综合征(CCMC)基因诊断制品中的应用。 0002 发明背景 0003 先天性白内障是导致儿童低视力和致盲的常见眼病， 发病率约为0.01%0.06%， 其中约50%与遗传有关， 其遗传方式以常染色体显性遗传最为常见。 先天性白内障可独立发 生， 也可作为眼部或全身综合征的伴发症状， 其中12%-18%的先天性白内障患者常发生合并 小角膜症状。 白内障-小角膜综合征(Cataract-microcorneasyndrome,CCMC,OMIM116200) 是一种先天发育异常性眼病， 常累及双眼， 表现为不同表型的白内障及角膜横径小于10mm， 常伴发眼前节发育不良， 如虹膜缺损、 Pete。

5、rs异常、 瞳孔异位及眼球震颤等， 这些多发畸形 常使大多数患者丧失视力， 是先天性致盲的重要原因之一。 并且和单纯先天性白内障相比， 伴发小角膜的患者更易患青光眼， 并造成不可逆转的视觉损害。 目前对于CCMC治疗手段有 限、 致盲率很高， 给全社会带来沉重的经济负担。 0004 先天性CCMC的病因及病理机制尚不清楚， 目前世界上研究较少。 国内外的遗传学 研究结果表明该病很大程度上是由于遗传因素导致的。 迄今为止， 已有7个致病基因被证实 （详见表1)。 0005 表1： 白内障-小角膜综合征致病基因定位及克隆情况 0006 0007 CCMC具有显著的遗传异质性， 存在多个候选致病基因。

6、。 到目前为止对CCMC的致病 基因的了解仍然有限， 迄今为止7个已知基因仅能解释不到30%的患者的发病。 这已经成为 CCMC的发病机制的研究以及针对病因的诊断和治疗研究的瓶颈。 这种现状促使进一步去发 现和了解该病新的致病基因， 为后续的基因诊断、 产前诊断及基因治疗提供基础。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种ABCA3基因在制备检测先天性白内障-小角膜综合征 说明书 1/8 页 3 CN 103589787 B 3 (CCMC)诊断制品中的应用， 从而弥补现有技术的不足。 0009 申请人发现了一个4代呈常染色体显性遗传的CCMC家系， 经过候选基因测序， 排除 了已知的7个候。

7、选基因突变致病的可能； 同时， 进一步对该家系的核心成员进行了外显子组 测序， 找到了该家系的致病基因ATP连接盒 （ABC） 转运子A3 （ABCA3） ， 从而促成了本发明。 0010 本发明首先提供ABCA3基因新的用途， 是在制备用于检测先天性白内障-小角膜综 合征(CCMC)诊断制品中的应用； 0011 本发明还提供一种用于检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)的引物对， 所述 的引物对的上下游引物序列为SEQIDNO:1-38， 其引物信息如下： 0012 ABCA3-1L:AGAAATGGAAAGTGACTCCTCT SEQIDNO:1 0013 ABCA3-1R:GTCTG。

8、TGGGTTACTGGAAGTT SEQIDNO:2 0014 ABCA3-2L:AACTTCCAGTAACCCACAGAC SEQIDNO:3 0015 ABCA3-2R:AGAGTGGAGTCAGAATCAAGGT SEQIDNO:4 0016 ABCA3-3L:ACCTTGATTCTGACTCCACTCT SEQIDNO:5 0017 ABCA3-3R:GAAAGAGTCCTAGCACATCAGA SEQIDNO:6 0018 ABCA3-4L:AGCTTTAGCTCATTACCTTGTC SEQIDNO:7 0019 ABCA3-4R:CCTGGTCAATCAGACAGAATTA SE。

9、QIDNO:8 0020 ABCA3-5L:ACATCAGAGCTGATTCTGTGAC SEQIDNO:9 0021 ABCA3-5R:ATAGTTTATGTCTCCTGGATGC SEQIDNO:10 0022 ABCA3-6L:CGTACAGTGGGAGACCATC SEQIDNO:11 0023 ABCA3-6R:CACTAATCCAGTGTCTCACCTT SEQIDNO:12 0024 ABCA3-7L:GCTGGGACACTCACTATATTTC SEQIDNO:13 0025 ABCA3-7R:CTGATGAACTTCTTCTTCTTGG SEQIDNO:14 0026 ABC。

10、A3-8L:GTTCTCGTAGAAACTGCTGACT SEQIDNO:15 0027 ABCA3-8R:GTCTGAGGACCTCCAAATG SEQIDNO:16 0028 ABCA3-9L:CATTTGGAGGTCCTCAGAC SEQIDNO:17 0029 ABCA3-9R:ATTGTCACATGGTCAGCATAG SEQIDNO:18 0030 ABCA3-10L:ACTCTGTCACATCTGACTTTGG SEQIDNO:19 0031 ABCA3-10R:GAGACACTGATGAGTGAGGAAASEQIDNO:20 0032 ABCA3-11L:GTGAGTCAGAT。

11、ACGTGCTTCTCSEQIDNO:21 0033 ABCA3-11R:CTTCCTAGAACCACACCATAACSEQIDNO:22 0034 ABCA3-12L:GTTGCACAGTACAGTCAGAGGTSEQIDNO:23 0035 ABCA3-12R:GACTGTGTCTCTCCCTCCAGSEQIDNO:24 0036 ABCA3-13L:CGCTGAGATGGTGTTAAAGSEQIDNO:25 0037 ABCA3-13R:AGAAAGCACTCAGAAACGAGTASEQIDNO:26 0038 ABCA3-14L:GTTGAGGTTCAGGTCTCTGACSEQIDNO。

12、:27 0039 ABCA3-14R:ATCTAGTGTGTCTGCTGGTTGTSEQIDNO:28 0040 ABCA3-15L:GAGGTAAAAGGCACTACAGAAGSEQIDNO:29 0041 ABCA3-15R:AACTTTGTGGTCAGAGACTTCASEQIDNO:30 0042 ABCA3-16L:CTAAATTACGCTGACTTTCCTCSEQIDNO:31 说明书 2/8 页 4 CN 103589787 B 4 0043 ABCA3-16R:GACATAGTAAGACCCTGTCGAASEQIDNO:32 0044 ABCA3-17L:AGGAGTGACTGC。

13、TATTGACTTGSEQIDNO:33 0045 ABCA3-17R:TGTTAAGGAGTGTCCAGATGATSEQIDNO:34 0046 ABCA3-18L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGTSEQIDNO:35 0047 ABCA3-18R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACATSEQIDNO:36 0048 ABCA3-19L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGTSEQIDNO:37 0049 ABCA3-19R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACATSEQIDNO:38。 0050 本发明还提供一种用于检测先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)的试。

14、剂盒， 包含 有上述的引物对中的任一种或几种。 0051 本发明还提供一种与先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)疾病相关的SNP位点,为 ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393位,其碱基为G或A； 0052 本发明还提供另一种与先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)疾病相关的SNP位点, 为ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408位， 其碱基为C或T； 0053 本发明还提供另一种与先天性白内障-小角膜综合征(CCMC)疾病相关的SNP位点, 为ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253位， 其碱基为A或T； 0054 本发明提供了ABCA3基因的新的用途， 从而提供了一种。

15、有效的进行先天性CCMC疾 病基因诊断、 产前基因筛查及遗传咨询的途径， 应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位 点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行ABCA3基因突变位点的的快 速检测。 附图说明 0055 图1： ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393位SNP位点信息,其碱基为G或A。 0056 图2： ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408位SNP位点信息， 其碱基为C或T。 0057 图3： ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253位SNP位点信息， 其碱基为A或T。 0058 图4： 实施例1的白内障-小角膜综合征家系内患者及正常人ABCA3。

16、测序图， 其中A- C:患者； D-F:正常人。 该家系中三名患者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393个碱 基发生了杂合突变， 由G突变为A， 其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变， 由C突变 为T。 0059 图5： 实施例2的白内障-小角膜综合征家系内患者及正常人ABCA3测序结果。 A-E: 患者； F-J:正常人。 该家系中五名患者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第2408个碱基 发生了杂合突变， 由C突变为T， 其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变， 由G突变为 A。 0060 图6： 实施例3的一名白内障-小角膜综合征患者及其母亲 （正常人） ABCA3测。

17、序结 果。 A:患者； B:正常人。 该患者ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253个碱基发生了杂 合突变， 由A突变为T， 其反向引物的测序结果显示该位点为杂合突变， 由T突变为A。 具体实施方式 0061 本发明的申请人在一个先天性的CCMC家系中发现ABCA3基因的突变位点， 并在另 一个先天性的CCMC家系及多名散发患者中证实该基因的突变是该病的致病基因， 从而促成 说明书 3/8 页 5 CN 103589787 B 5 了本发明。 0062 ABCA3属于ABC转运子家族中ABCA亚家族的成员， 其基因由超过80000个核苷酸碱 基组成， 位于16p13.3， 可转录成大约6。

18、500bp的mRNA （NM_001089） ， 直接翻译形成1704个氨基 酸组成的蛋白质。 0063 下面对本发明进行详细的描述。 0064 一、 先天性CCMC家系中发现ABCA3基因的突变位点的筛选 0065 实施例1： 从先天性CCMC家系中筛选ABCA3基因的突变位点 0066 1、 提取外周血基因组DNA： 0067 在符合国家相关政策规定， 并在取样对象同意的基础上， 抽取第一个家系成员外 周静脉血2-5ml， 放入EDTA抗凝管内， -80冻存备用； 冻存的EDTA抗凝血在室温融化后， 取 500 L放于离心管， 加入等体积TE(pH8.0)， 混匀， 4， 10000rpm。

19、离心10分钟， 弃上清。 0068 加入180 LTE、 20 LSDS(10%)、 8 L蛋白酶K(l0mg/ml)混匀， 置于37水浴过夜。 从 水浴中取出样品， 瞬时离心沉淀样本。 在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300 L)， 充 分混匀， 室温下10000rpm离心10分钟， 吸取上清液(约300 L)至一新离心管中。 重复酚抽提 一次， 吸取上清液至一新离心管中。 0069 加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、 氯仿各150 L)， 混匀， 室温10000rpm离 心10分钟， 转移上清液至一新离心管。 0070 加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚。

20、、 氯仿、 异戊醇各100 L)， 混匀， 室温10000rpm离心10分钟， 转移上清液至一新离心管。 0071 加入l/10体积3mol/L、 pH5.2醋酸钠(约30 L)， 2倍体积预冷100%乙醇， 轻轻混合， 可见白色絮状沉淀。 室温10000rpm离心10分钟， 使DNA沉淀于管底， 弃上清。 0072 向DNA沉淀加入70%乙醇， 漂洗一次， 室温7000rpm离心5分钟， 弃上清， 置于室温中 挥发剩余乙醇， 最后加入50 LTE(pH8.0)， 4过夜溶解DNA。 0073 对提取的DNA行琼脂糖胶电泳， 并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色， 检测 DNA纯度。

21、及浓度。 0074 2.外显子组测序： 外显子组测序(ExomeSequencing)是一种新型的基因组分析技 术,只需针对全基因外显子(exon)区域的DNA即可,取该家系中3名患者的基因组DNA， 由深 圳华大基因科技有限公司应用NimbleGen(44Mb)targetenrichmentsystem收集人类基因 组的外显子区域， 应用IlluminaGenomeAnalyzerII平台对富集的外显子文库进行 IlluminaGA高通量测序， 共捕获了18357个目的基因中的18283(99.6%)个。 将这些突变滤 过4个正常人数据库： 单核苷酸多态性数据库(dbSNP129,http。

22、:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/SNP/snp_summary.cgi/),千人基因组计划(February28,2011releasesfor SNPs,andFebruary16,2011releasesforindelshttp:/www.1000genome.org/), Hapmap8数据库(http:/hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/),及炎黄数据库， 进一步筛选出3名患 者共有的非同义未知突变位点106个， 应用直接测序法在该家系内筛选到与致病单倍体型 共分离的致病基因ABCA3， 并在200例正常当地人群外周血基因组DNA样本中。

23、进行该位点的 突变筛查,未发现该突变。 0075 3.直接测序法验证该家系内患者ABCA3基因的突变 0076 PCR扩增目的片段： 反应条件与反应体系： 说明书 4/8 页 6 CN 103589787 B 6 0077 (1)PCR反应条件： 943min； 9440sec， 55340se,7260sec， 30-35cycles； 7210min。 0078 （2） 反应体系：（TAKARALATaqpolymerase） 0079 0080 应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该ABCA3引物的扩增 反应。 0081 PCR产物测序： 应用常规Sanger测序法对上。

24、述PCR产物进行测序， 该家系中三名患 者的ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4393个碱基发生了杂合突变， 由G突变为A， 其反 向引物的测序结果显示该位点为杂合突变， 由C突变为T(图4)， 引起ABCA3蛋白第1465位由 天冬氨酸突变为天冬酰胺， 应用点突变预测程序SIFT(SortingIntolerantFrom Tolerant)预测发现， 该突变导致了ABCA3蛋白功能 “damaging” 级的损坏， 从而引起了该家 系中CCMC的发生。 多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。 在200 例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位。

25、点的突变筛查,未 发现该突变。 0082 通过上述的分析， 证明ABCA3基因可以用来检测患者是否具有潜在患CCMC的危险。 通过将检测者的ABCA3基因的各外显子片段于正常的对应片段比较， 确定待检测者的患病 风险。 0083 根据ABCA3的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对， 其正反引物的序列信息 如下： 0084 ABCA3-1L:AGAAATGGAAAGTGACTCCTCT 0085 ABCA3-1R:GTCTGTGGGTTACTGGAAGTT 0086 ABCA3-2L:AACTTCCAGTAACCCACAGAC 0087 ABCA3-2R:AGAGTGGAGTCAGAATCAA。

26、GGT 0088 ABCA3-3L:ACCTTGATTCTGACTCCACTCT 0089 ABCA3-3R:GAAAGAGTCCTAGCACATCAGA 0090 ABCA3-4L:AGCTTTAGCTCATTACCTTGTC 0091 ABCA3-4R:CCTGGTCAATCAGACAGAATTA 说明书 5/8 页 7 CN 103589787 B 7 0092 ABCA3-5L:ACATCAGAGCTGATTCTGTGAC 0093 ABCA3-5R:ATAGTTTATGTCTCCTGGATGC 0094 ABCA3-6L:CGTACAGTGGGAGACCATC 0095 ABCA3-。

27、6R:CACTAATCCAGTGTCTCACCTT 0096 ABCA3-7L:GCTGGGACACTCACTATATTTC 0097 ABCA3-7R:CTGATGAACTTCTTCTTCTTGG 0098 ABCA3-8L:GTTCTCGTAGAAACTGCTGACT 0099 ABCA3-8R:GTCTGAGGACCTCCAAATG 0100 ABCA3-9L:CATTTGGAGGTCCTCAGAC 0101 ABCA3-9R:ATTGTCACATGGTCAGCATAG 0102 ABCA3-10L:ACTCTGTCACATCTGACTTTGG 0103 ABCA3-10R:GAGACA。

28、CTGATGAGTGAGGAAA 0104 ABCA3-11L:GTGAGTCAGATACGTGCTTCTC 0105 ABCA3-11R:CTTCCTAGAACCACACCATAAC 0106 ABCA3-12L:GTTGCACAGTACAGTCAGAGGT 0107 ABCA3-12R:GACTGTGTCTCTCCCTCCAG 0108 ABCA3-13L:CGCTGAGATGGTGTTAAAG 0109 ABCA3-13R:AGAAAGCACTCAGAAACGAGTA 0110 ABCA3-14L:GTTGAGGTTCAGGTCTCTGAC 0111 ABCA3-14R:ATCTAGTG。

29、TGTCTGCTGGTTGT 0112 ABCA3-15L:GAGGTAAAAGGCACTACAGAAG 0113 ABCA3-15R:AACTTTGTGGTCAGAGACTTCA 0114 ABCA3-16L:CTAAATTACGCTGACTTTCCTC 0115 ABCA3-16R:GACATAGTAAGACCCTGTCGAA 0116 ABCA3-17L:AGGAGTGACTGCTATTGACTTG 0117 ABCA3-17R:TGTTAAGGAGTGTCCAGATGAT 0118 ABCA3-18L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGT 0119 ABCA3-18R:CACA。

30、AAAGAAGGTGAGAGACAT 0120 ABCA3-19L:GCCTTTTACAGGTTGAAGTAGT 0121 ABCA3-19R:CACAAAAGAAGGTGAGAGACAT 0122 分别应用上述的每一对引物进行ABCA3基因的检测。 0123 实施例2： 从另一个先天性CCMC家系中筛选ABCA3基因的突变位点 0124 1.提取外周血基因组DNA： 应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从家系内各成员外 周血中提取基因组DNA。 0125 2.PCR扩增目的片段： 反应条件与反应体系： 0126 (1)PCR反应条件： 943min； 9440sec， 55340se,7260s。

31、ec， 30-35cycle； 72 10min。 0127 （2） 反应体系：（TAKARALATaqpolymerase） 说明书 6/8 页 8 CN 103589787 B 8 0128 0129 应用该反应体系分别进行每名患者的基因组DNA模板分别与ABCA3基因的19对引 物的扩增反应。 0130 3.PCR产物测序： 应用常规Sanger测序法对家系内患者的基因组DNA模板分别与 ABCA3基因的19对引物的扩增产物进行测序， 结果表明该家系中五名患者的ABCA3基因编码 区域由起始密码子起第2408个碱基发生了杂合突变， 由C突变为T， 其反向引物的测序结果 显示该位点为杂合突。

32、变， 由G突变为A(图5)， 引起ABCA3蛋白第803位由苏氨酸突变为甲硫氨 酸， 应用点突变预测程序SIFT预测发现， 该突变导致了ABCA3蛋白功能 “damaging” 级的损 坏， 从而引起了该家系中CCMC的发生。 重复结果证明了该位点的真实性。 并在200例正常当 地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突 变。 0131 实施例3： 从另2名先天性散发CCMC患者中筛选ABCA3基因的突变位点 0132 收集散发CCMC患者： 在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院共收集2例诊断明确的 CCMC散发患者。 0133 提取外周血基因组DNA： 01。

33、34 分别抽取2例散发CCMC患者的外周静脉血2-5ml， 放入EDTA抗凝管内， -80冻存备 用； 冻存的EDTA抗凝血在室温融化后， 取500 L放于离心管， 应用实施例1中说述的常规酚氯 仿法从家系内各成员外周血中提取基因组DNA。 0135 PCR扩增目的片段： 反应条件与反应体系： 0136 (1)PCR反应条件： 943min； 9440sec， 55340se,7260sec， 30-35cycles； 7210min。 0137 （2） 反应体系：（TAKARALATaqpolymerase） 说明书 7/8 页 9 CN 103589787 B 9 0138 0139 应用。

34、该反应体系分别进行每名患者的基因组DNA模板分别与ABCA3基因的19对引 物的扩增反应。 0140 PCR产物测序： 应用常规Sanger测序法对每名患者的基因组DNA模板分别与ABCA3 基因的19对引物的扩增产物进行测序， 在2名散发患者中均检测到了ABCA3基因的杂合突 变： ABCA3基因编码区域由起始密码子起第4253个碱基发生了杂合突变， 由A突变为T， 其反 向引物的测序结果显示该位点为杂合突变， 由T突变为A(图6)， 引起ABCA3蛋白第1418位由 天门冬酰胺突变为异亮氨酸， 应用点突变预测程序SIFT预测发现， 该突变导致了ABCA3蛋白 功能 “damaging” 级。

35、的损坏， 从而引起了患者CCMC的发生。 并在200例正常当地人群及该家系 中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。 说明书 8/8 页 10 CN 103589787 B 10 0001 序列表 1/6 页 11 CN 103589787 B 11 0002 序列表 2/6 页 12 CN 103589787 B 12 0003 序列表 3/6 页 13 CN 103589787 B 13 0004 序列表 4/6 页 14 CN 103589787 B 14 0005 序列表 5/6 页 15 CN 103589787 B 15 0006 序列表 6/6 页 16 CN 103589787 B 16 图1 图2 说明书附图 1/4 页 17 CN 103589787 B 17 图3 图4 说明书附图 2/4 页 18 CN 103589787 B 18 图5 说明书附图 3/4 页 19 CN 103589787 B 19 图6 说明书附图 4/4 页 20 CN 103589787 B 20 。