技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种雨生红球藻培养基。
背景技术
虾青素(Astaxanthin) 是具有广泛应用价值和开发前景的脂溶性类胡萝卜素，具有两大特点：一是具有极强的生物活性和生理功能，是自然界已知抗氧化剂最强的一种，其抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍、维生素E的100-550 倍，被誉为“超级维生素E”；二是颜色鲜红，有很强的着色能力。研究表明，虾青素具有强大的清除自由基和抗氧化能力，同时具有明显的保护血管、改善视网膜、防止光损伤、抗衰老、防癌和增强肌体免疫力等功效。因此，虾青素在保健品、药品和化妆品制造，食品和饮料加工，水产品、家禽和家畜饲料加工等领域都具有广泛应用前景。
虾青素的主要生产方法包括人工合成和天然提取两类。人工合成虾青素分子结构与天然虾青素存在差异，生物活性远不及天然虾青素，生物应用上仅被允许用于动物着色。天然提取的虾青素主要通过培养雨生红球藻获得，可广泛用于食品、保健以及日化行业等领域，我国在2010年将雨生红球藻列入新资源食品目录（卫生部第17号公告），为天然虾青素在国内市场的发展奠定基础。
目前，虾青素产量远不能满足市场需要，导致国际市场价格昂贵，仅合成品的原料高达2500美金/公斤（专利号：200910300402.2），而天然虾青素的产品价格则更高。雨生红球藻是一种单细胞绿藻，可在特定条件下大量积累虾青素，达藻体干重的1%—3%，是潜在虾青素生产的最好生物资源。雨生红球藻细胞生长周期复杂，在目前工程培养过程中，较低的细胞繁殖生长速率成为限制该藻资源开发的主要限制因子。如何有效提高藻细胞繁殖速率，以期在单位时间内获得较大的生物量产率是红球藻生物资源开发的核心之一。
目前的红球藻培养基研究中，主要利用无机磷作为细胞构建所需的培养基磷源，例如，专利：磷酸二氢钾（钠）（发明专利：申请号 201310038104.7）、磷酸氢二钾（钠）(发明专利：申请号 02138827.X)；偏磷酸或正磷酸（发明专利：申请号 201210560096.8）。而关于有机磷对红球藻影响的研究罕有报道。主要原因：一、无机磷源通常被认为是植物主要吸收利用的磷形态；二、除了小分子的有机磷可以直接通过藻体吸收利用，对于较大分子有机磷则需经碱性磷酸酶等水解后才能被吸收利用[黄邦钦,黄世玉,洪华生,等.溶解态磷在海洋微藻碱性磷酸酶活力变化中的调控作用[J].海洋学报, 1999,21(1):55-60]。
近期研究发现，许多浮游植物都能够利用有机磷化合物作为营养物质来源，但具体到不同藻株其利用效果存在差异[JB Cotner and RG Wetzel. Uptake of dissolved inorganic and organic phosphorus by phytoplankton and baterioplankton [J]. Limnol Oceanogr, 1992,37(2): 232-243；杨维东,钟娜,刘洁生,等.不同磷源及浓度对利玛原甲藻生长和产毒的影响研究[J]. 环境科学, 2008, 29(10): 2760-2765；王艳,唐海溶.不同形态的磷源对球形棕囊藻生长及碱性磷酸酶的影响[J]. 生态科学，2006, 25(1): 38-40；钱善勤,孔繁翔,史小丽等. 不同形态磷酸盐对铜绿微囊藻和蛋白核小球藻生长的影响[J]. 湖泊科学, 2008, 20(6):796-801]。中肋骨条藻和东海原甲藻均既可利用无机磷酸盐又能利用有机磷化合物生长繁殖，且有机磷化合物的作用比无机磷酸盐的作用稍高[赵艳芳,俞志明,宋秀贤,等.不同磷源形态对中肋骨条藻和东海原甲藻生长及磷酸酶活性的影响，环境科学, 2009, 30(3): 693-699]。金相灿和郑朔方(2006)研究发现，一定有机磷源存在条件下，可以维持铜绿微囊藻较长的指数增长时间，从而有利于形成更高的生物量[金相灿,郑朔方, 有机磷和无机磷对铜绿微囊藻生长的影响及动力学分析, 环境科学研究, 2006, 19(5): 40-44]。
但至今，尚未见有机磷源对红球藻生长作用的研究，也没有将无机磷源和有机磷源搭配调节红球藻的细胞生长的探讨。通过开展上述工作，寻找促进红球藻细胞生长的合适的有机磷源浓度，无疑可应用于生产加快该产业发展步伐。
发明内容
为实现上述目的本发明采用的培养基配方如下：
一种雨生红球藻培养基，其特征在于：每升培养基中含有：
NaNO3 0.30~0.40 g
KNO3 0.10~0.20 g
MgSO4·7H2O 0.07 ~ 0.18 g
Na2SO3 0.03 ~ 0.06 g
C6H5Na3O7 0.10 ~ 0.30 g
无机磷 0.02 g
有机磷 0.005 ~ 0.02 g
CaCl2 0.03 ~ 0.09 g
EDTA-NaFe 0.0002 ~ 0.0003 g
FeSO4 0.001 ~ 0.003 g
ZnSO4 0.0015 ~ 0.0045 g
MnCl2 0.00006 ~ 0.00018 g
CoCl2 0.00003 ~ 0.0001 g
H3BO3 0.0001 ~ 0.0003 g
CuSO4 0.00006 ~ 0.00018 g
(NH4)Mo7O24 0.00002 ~ 0.00006 g
3-IBA 0.002 g
6-BA 0.0003 g
Vb12 0.000025~0.00005 g。
作为优选项：
所述无机磷为KH2PO4。
所述有机磷为β甘油磷酸钠(G-P)、三磷酸腺苷二钠盐(ATP)或6-磷酸葡萄糖(G-6-P)其中的一种或几种的混合物。
所述有机磷/（有机磷+无机磷）的质量比为20%~50%。
所述有机磷/（有机磷+无机磷）的质量比为42%~50%。
本发明培养的雨生红球藻使其在绿色游动阶段快速进入指数增长期，比生长速率达到0.49~0.53，生物量较传统的培养基提高1倍以上，有效的提高了雨生红球藻在绿色阶段的产量，具有广阔的应用前景。
本发明的培养基用于光合自养培养雨生红球藻，能够显著促进雨生红球藻的生长，可使雨生红球藻迅速进入指数生长期，在短时间内达到较高的生长密度并保持其种群的优势地位，从而有助于在野外扩大培养过程中最大程度降低外来杂菌、杂藻和原生动物的污染几率，缩短生长周期，提高培养的成功几率。
附图说明
图1为实施例1、实施例2、实施例3、实施例4中使用本发明对雨生红球藻进行培养后的生长曲线图；
图2为实施例5、实施例6、实施例7、实施例8中使用本发明对雨生红球藻进行培养后的生长曲线图。
具体实施方式
本发明通过下列非限制的实施实例进一步加以说明，但非用以限制本发明的范围。
实施例1
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.32 g、KNO3 0.17 g、MgSO4·7H2O 0.07g、Na2SO3 0.032g、C6H5Na3O7 0.11 g、KH2PO4 0.02 g、G-P 0.015 g、CaCl2 0.03 g、EDTANaFe 0.0002 g、FeSO4 0.001 g、ZnSO4 0.0015 g、MnCl2 0.00006 g、CoCl2 0.00003 g、H3BO3 0.0001 g、CuSO4 0.00006 g、(NH4)Mo7O24 0.00002 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2）在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株I，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图1）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到86%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.515（图1），显著高于传统培养基BG11（0.368）和改良的SM培养基（0.363）。
实施例2
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.35 g、KNO3 0.15 g、MgSO4·7H2O 0.14 g、Na2SO3 0.05 g、C6H5Na3O7 0.20 g、KH2PO4 0.02 g、G-P 0.010 g、CaCl2 0.06 g、EDTANaFe 0.00025 g、FeSO4 0.002 g、ZnSO4 0.0030 g、MnCl2 0.00012 g、CoCl2 0.00007 g、H3BO3 0.0002 g、CuSO4 0.00012 g、(NH4)Mo7O24 0.00004 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2）在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株I，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图1）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到86%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.506（图1），显著高于传统培养基BG11（0.368）和改良的SM培养基（0.363）。
实施例3
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.34 g、KNO3 0.16 g、MgSO4·7H2O 0.13 g、Na2SO3 0.045 g、C6H5Na3O7 0.22 g、KH2PO4 0.02 g、G-P 0.02 g、CaCl2 0.07 g、EDTANaFe 0.00024 g、FeSO4 0.0018 g、ZnSO4 0.0024 g、MnCl2 0.00015 g、CoCl2 0.00005 g、H3BO3 0.00019 g、CuSO4 0.00014 g、(NH4)Mo7O24 0.00003 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2） 在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株I，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图1）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到89%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.527（图1），显著高于传统培养基BG11（0.368）和改良的SM培养基（0.363）。
实施例4
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.40 g、KNO3 0.20 g、MgSO4·7H2O 0.18 g、Na2SO3 0.06 g、C6H5Na3O7 0.30 g、KH2PO4 0.02 g、G-P 0.005 g、CaCl2 0.09 g、EDTANaFe 0.0003 g、FeSO4 0.003 g、ZnSO4 0.0045 g、MnCl2 0.00018 g、CoCl2 0.0001 g、H3BO3 0.0003 g、CuSO4 0.00018 g、(NH4)Mo7O24 0.00006 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2）在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株I，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图1）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到83%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.492（图1），显著高于传统培养基BG11（0.368）和改良的SM培养基（0.363）。
实施例5
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.32 g、KNO3 0.17 g、MgSO4·7H2O 0.07g、Na2SO3 0.032g、C6H5Na3O7 0.11 g、KH2PO4 0.02 g、G-P 0.01 g、ATP 0.005g、CaCl2 0.03 g、EDTANaFe 0.0002 g、FeSO4 0.001 g、ZnSO4 0.0015 g、MnCl2 0.00006 g、CoCl2 0.00003 g、H3BO3 0.0001 g、CuSO4 0.00006 g、(NH4)Mo7O24 0.00002 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2） 在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株II，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图2）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到87%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.554（图2），显著高于传统培养基BG11（0.370）和改良的SM培养基（0.392）。
实施例6
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.35 g、KNO3 0.10 g、MgSO4·7H2O 0.14 g、Na2SO3 0.05 g、C6H5Na3O7 0.20 g、KH2PO4 0.02 g、ATP 0.01g、CaCl2 0.06 g、EDTANaFe 0.00025 g、FeSO4 0.002 g、ZnSO4 0.0030 g、MnCl2 0.00012 g、CoCl2 0.00007 g、H3BO3 0.0002 g、CuSO4 0.00012 g、(NH4)Mo7O24 0.00004 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2） 在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株II，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图2）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到84%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.522（图2），显著高于传统培养基BG11（0.370）和改良的SM培养基（0.392）。
实施例7
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.34 g、KNO3 0.16 g、MgSO4·7H2O 0.13 g、Na2SO3 0.045 g、C6H5Na3O7 0.22 g、KH2PO4 0.02 g、G-P 0.01 g、ATP 0.005g、G-6-P 0.005g、CaCl2 0.07 g、EDTANaFe 0.00024 g、FeSO4 0.0018 g、ZnSO4 0.0024 g、MnCl2 0.00015 g、CoCl2 0.00005 g、H3BO3 0.00019 g、CuSO4 0.00014 g、(NH4)Mo7O24 0.00003 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2）在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株II，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图2）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到86%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.563（图2），显著高于传统培养基BG11（0.370）和改良的SM培养基（0.392）。
实施例8
（1）每升培养基中含有
NaNO3 0.40 g、KNO3 0.20 g、MgSO4·7H2O 0.18 g、Na2SO3 0.06 g、C6H5Na3O7 0.30 g、KH2PO4 0.02 g、G-6-P 0.005 g、CaCl2 0.09 g、EDTANaFe 0.0003 g、FeSO4 0.003 g、ZnSO4 0.0045 g、MnCl2 0.00018 g、CoCl2 0.0001 g、H3BO3 0.0003 g、CuSO4 0.00018 g、(NH4)Mo7O24 0.00006 g、3-IBA 0.002 g、6-BA 0.0003 g、Vb12 0.000025~0.00005 g。
（2）在250 mL 三角瓶中加入100 mL上述所示的培养基，接种比例为10%（即种子液体积占培养体积的10%），种子为对数生长期的红球藻藻株II，接种密度为103~104cells/mL。培养温度为(23 ±1.5)℃，培养光强1300-1500 lx，连续光照于培养房静置培养，期间每天摇动数次，每实验设置三个重复。
培养期间，每2天从培养瓶中取少量培养液用浮游植物计数框对雨生红球藻细胞计数并用分光光度计测定培养基在680nm处的光密度，确定藻细胞的生长阶段，当红球藻细胞数量或OD680稳定时即完成培养。
同时设置BG11和改良的SM为对照组（图2）。
结果：在整个培养周期中绿色游动细胞比例均可达到83%以上，平台期前的（前12天）的平均比生长速率比较中，本例的比生长速率达到0.520（图2），显著高于传统培养基BG11（0.370）和改良的SM培养基（0.392）。
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换，因此所有等同的技术方案，都落入本发明的保护范围。