技术领域
本发明涉及来源于水稻的胚乳特异性表达启动子及其应用。
背景技术
植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺形状的改良（如提高作物产量，增 强抗病、抗虫、抗除草剂特性，改良品质等），而且使植物成为生物医药和工业产品的 生物反应器（Daniell et al.,Trends Plant Sci.2001,6:219-226;Giddings et al.,Nature Biotech.2000,18:1151-1156；Hood and Jilka,Curr.Opin.Biotechnol. 1999,10:382-386;Hood and Woodard,Plants as Factories for Protein Production, 2002，pp.119-135.Netherlands:Kluwer Academic）。对于绝大多数禾本科作物，由 于其产量高、生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转 基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫 苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球 蛋白(Glycinin)、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白 (Ferritin)、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉过敏 症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平累积（Goto et al.,Nature Biotech.1999， 17:282-286;Katsube et al.,Plant Physiol.1999,120:1063-1073;Qu et al., Planta2005,222:225-233;Takagi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.2005,102: 17525-17530;Ye et al.,Science2000,287:303-305;Zheng et al.,Plant Physiol. 1995,109:777-786）。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用（外源基因的理 想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等）的限制因子。
植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。 基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动 转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控 制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。
目前广泛应用的启动子(包括CaMV35S、ubiquitin1、Actin1)尽管其表达效率高， 然而由于其表达不受时空限制，它在几乎所有组织中都能使外源基因表达，在进行种 子中外源基因过量表达过程中，会驱动基因在种子外的其它组织中表达，既消耗生物 能源，同时会导致一些可能对生物生长发育产生不利影响的代谢产物的合成。且上述 启动子的表达强度尚无法满足转基因产业化的需要。若选择胚乳特异性高强度表达启 动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生理 活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供水稻的胚乳特异性表达启动子。
本发明所提供的胚乳特异性表达启动子，名称为SSP-1，来源于稻属水稻（Oryza sativa），是如下a）、b）或c）的DNA分子：
a）核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
b）与a）限定的核苷酸序列具有70%或70%以上的同一性，且具有启动子功能的 DNA分子；
c）在高严谨条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA 分子。
其中，SEQ ID No.1由2416个核苷酸组成。
上述70%或70%以上的同一性，可为75%、80%、85%、90%、95%以上的同一性。
所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液（0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2， 7%SDS）中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液（0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH7.2，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段），65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I (20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5%SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液 II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1%SDS)，65℃洗膜30min。
本申请使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用 肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用 百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
SEQ ID No.1的第2295-2300位核苷酸为SSP-1的TATA盒核心区。将启动子除TATA 盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等发生变化，一般不会使启动子活性完全 丧失，因此也可根据需要将启动子的调控元件改变。本领域普通技术人员可以很容易 地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进 行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70%或者 更高同源性的核苷酸，只要保持了种子特异性表达靶基因的启动子活性，均是衍生于 本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
下述B1）至B4）中的任一种所述的含有SSP-1的生物材料也属于本发明的保护范 围：
B1）含有SSP-1的表达盒；
B2）含有SSP-1的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；
B3）含有SSP-1的重组微生物、或含有B1）所述表达盒的重组微生物、或含有B2） 所述重组载体的重组微生物；
B4）含有SSP-1的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞 系、或含有B2）所述重组载体的转基因植物细胞系；
所述含有SSP-1的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA，该DNA 不但包括启动所述目的基因的SSP-1，还可包括终止所述目的基因转录的终止子。进 一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂 碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌 豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I985) Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol. Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev., 5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151； Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。所述含有SSP-1的表达盒中，SSP-1的下游连接结构基因，或调节 基因，或结构基因或调节基因的反义基因，或者能够干扰内源基因表达的小干扰RNA 的编码基因，或者能够干扰内源基因表达的shRNA的编码基因。
所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、病毒或运载体所构建的重组载体，所述 重组表达载体可为重组植物表达载体，所述重组植物表达载体含有上述表达盒并且能 够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够或者至少方 便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。
在本发明的一个实施方式中，所述的含有SSP-1的重组载体具体可为用SEQ ID No.1所示的启动子SSP-1替换pGPTV-35S-HPT的Sal I和Hind III酶识别位点之间 片段得到的重组表达载体，命名为pGPTV-SSP-1-GUS。所述重组微生物具体可为细菌, 酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia), 根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属 （Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。所述 的转基因植物细胞系不包括植物的繁殖材料。
本发明中，上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直 接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞 或组织或器官，得到转基因植物细胞或组织或器官及由此分化、再生的完整植株及其 无性系或其后代。
实验证明，SSP-1可启动外源基因在种子植物的种子中特异表达，可用于培育在 胚乳中特异性表达外源基因的转基因种子植物。
本发明还提供了一种利用SSP-1培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将外源基因表达盒导入受体种子植物 中，得到在胚乳中特异表达所述外源基因的转基因种子植物；所述外源基因表达盒中， SSP-1启动所述外源基因的转录。
本申请中，所述种子植物可为有胚乳种子植物（水稻、小麦、玉米、大麦、高粱、 燕麦、荞麦、油桐或蓖麻）。
当所述转基因种子植物的种子为有胚乳种子时，外源基因在所述转基因种子植物 的种子胚乳中特异表达，在胚中不表达。
上述方法中，所述外源基因表达盒中所述外源基因连接于SSP-1下游，所述外源 基因表达盒通过植物表达载体转入受体种子植物中。
上述方法中，所述外源基因表达盒中，所述植物胚乳特异性表达启动子下游还可 连接有调控基因表达的调控元件。所述调控基因表达的调控元件包括能增强外源基因 表达或调控外源基因在植物中表达部位的元件，如增强子、组成型表达、组织特异性 表达、诱导型表达的调控元件。
所述方法中，所述外源基因可为蛋白编码基因和/或非蛋白编码基因；所述蛋白编 码基因优选为品质改良基因；所述非蛋白编码基因可为正义RNA基因和/或反义RNA 基因。
上述方法中，所述转基因种子植物理解为不仅包含将所述外源基因表达盒转化 受体种子植物得到的第一代转基因种子植物及其无性系，也包括其子代及其无性 系。对于转基因种子植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将 该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因种子植 物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
实验证明，SSP-1可使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚乳（包括糊 粉层和亚糊粉层）中特异性表达。说明本发明的启动子可以启动外源基因在种子植物 的种子的胚乳中特异性表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，即单子叶植物或胚乳 型双子叶植物。
利用本发明的启动子可提高外源基因在植物种子胚乳中的表达和累积水平，可改 良种子品质、可将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、可 利用种子作为生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。 本发明的启动子及其应用为利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了 基础，具有极大的应用前景。
附图说明
图1为植物表达载体pGPTV-SSP-1-GUS的结构示意图。
图2为pGPTV-SSP-1-GUS的Sal I和Hind III双酶切鉴定电泳结果。
图3为T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的根、茎杆及叶的GUS染色结果。
图4为T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子的GUS染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的水稻Kitaake（Qu et al.,J.Exp.Bot.2008,59:2417–2424） 公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用， 不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pGPTV-35S-HPT（Expression pattern and activity of six glutelin gene promoters in transgenic rice.Qu et al.,J.Exp.Bot.2008,59: 2417–2424）公众可从中国科学院植物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相 关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、植物种子胚乳特异性表达启动子SSP-1的获得
CTAB法从水稻Kitaake叶片中提取基因组DNA，以其为模板，以P1和P2为引物， 进行PCR扩增启动子SSP-1。反应体系为：10μM正反向引物各1μl,10×Ex Buffer 2μl,基因组DNA1μl（10ng）,ExTaq(TaKaRa)0.5unit，加超纯水至20μl； 反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃1min，55℃1min30sec，72℃2min 30sec，30个循环，最后72℃，10min。PCR扩增得到2.4kb的目的条带。回收扩 增产物，直接连接到pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)上，进行测序，结果表明，扩增 得到SEQ ID No.1所示的启动子SSP-1（2416bp）。将测序检测表明含有启动子SSP-1 的重组载体命名为pMD-SSP-1。
其中，PCR的正向引物(P1)序列为：5’-GGAAGCTTTATTGTAGGAGTACAGGG-3’(下 划线所示序列为Hind III识别位点),反向引物(P2)，其序列为： 5’-GCGTCGACGGTTTTCCGGCTTGGAAAC-3’(下划线所示序列为Sal I识别位点)。
实施例2、植物种子胚乳特异性表达启动子SSP-1启动外源基因在水稻种子胚乳 中特异表达
1、含有SSP-1启动的外源基因表达盒的植物表达载体构建
用Sal I和Hind III双酶切pMD-SSP-1，回收含有启动子SSP-1的2416bp的酶 切片段，将该片段插入到pGPTV-35S-HPT的Sal I和Hind III酶识别位点之间，得到 用SEQ ID No.1所示的启动子SSP-1替换pGPTV-35S-HPT的Sal I和Hind III酶识别 位点之间片段得到的重组表达载体，命名为pGPTV-SSP-1-GUS。pGPTV-SSP-1-GUS的结 构示意图如图1所示，含有GUS基因表达盒，该GUS基因表达盒由启动子SSP-1和启 动子SSP-1启动的外源基因GUS基因（UidA）和终止子Tnos组成。pGPTV-SSP-1-GUS 的Sal I和Hind III双酶切鉴定电泳结果如图2所示，表明pGPTV-SSP-1-GUS经Sal I和Hind III双酶切得到2.4kb启动子SSP-1片段。图2中泳道1为pGPTV-SSP-1-GUS 的Sal I和Hind III双酶切产物，泳道2为DNA分子量标记。
2、转基因水稻的获得
用冻融法将pGPTV-SSP-1-GUS导入根癌农杆菌EHA105中，然后转化水稻Kitaake。 具体方法如下：吸取7μl表达载体质粒加入100μl EHAl05农杆菌感受态细胞中，轻 弹混匀后置于液氮中冷冻7min，之后转入37℃水浴中静置3min，然后加入800ulYEB 液体培养基于28℃静置恢复培养3h-5h，取400μl菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那 霉素50mg/L，利福平Rif50mg/L)，于28℃倒置培养2～3天。挑取少许农杆菌单菌 落进行目标基因的菌落PCR检测后将阳性菌落在YEB抗性平板上划线扩繁培养，利用 农杆菌侵染法转化水稻品种kitaake的愈伤组织，用潮霉素筛选抗性愈伤，并进一步 培养分化成幼苗后移栽温室。
利用潮霉素筛选方法（按照文献Hiei et al.,Plant J.1994,6:271-282所述 方法进行），获得T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株。T0代转基因植株所结的种子和由 该种子长成的植株为T1代，依此类推，T2、T3分别表示转基因植株第2代和第3代。
3、GUS染色鉴定SSP-1启动子的特异性
对8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株（编号分别为SSP-1-1、SSP-1-2、 SSP-1-3、SSP-1-4、SSP-1-5、SSP-1-6、SSP-1-7和SSP-1-8）进行组织化学染色，具 体步骤如下：将植株的叶片、根、茎杆组织及用解剖刀从中部纵切开的开花后9天、 12天、18天的灌浆期种子，用解剖刀从中部纵切开，浸泡于GUS反应液（0.1M NaPO4缓冲液，pH7.0，10mM EDTA，pH7.0，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1.0mM X-Gluc， 0.1%Triton X-100），37℃反应2小时。70％乙醇中保存、观察。解剖显微镜下照相。 结果表明，结果表明：8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的根、茎杆及叶中均未 被染成蓝色，均未观察到GUS表达（图3），开花后9天的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS 水稻植株的种子糊粉层、亚糊粉层和胚乳均变蓝，胚均未被染成蓝色，开花后12天的 8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子与开花后9天的种子相比糊粉层、亚糊 粉层、胚乳外部蓝色均更明显，胚乳中心部位蓝色清晰可见，胚均未被染成蓝色；开 花后18天的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的种子糊粉层、亚糊粉层和整个 胚乳蓝色均清晰可见，与开花后12天的种子相比，胚乳中心蓝色更深，胚均未被染成 蓝色（图4）。图4中1、2、3分别表示T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株开花后9天、 12天、18天的灌浆期种子染色结果。
上述结果表明启动子SSP-1只驱动外源基因在水稻种子胚乳中特异表达。
4、定量测定SSP-1启动子启动的GUS基因在种子中的表达量
对步骤3的8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株（编号分别为SSP-1-1、SSP-1-2、 SSP-1-3、SSP-1-4、SSP-1-5、SSP-1-6、SSP-1-7和SSP-1-8）的开花后17天的灌浆 期种子进行GUS定量分析，方法按照Jefferson等的荧光检测方法（Jefferson，Plant Mol.Biol.Report,1987,5:387–405）进行。具体为：取1粒种子，置于1.5ml eppendorf管中，用玻璃棒将种子碾碎，加入30μl抽提液（50mM磷酸钠缓冲溶液 （pH7.0），10mMβ-巯基乙醇，10mM Na2EDTA（pH8.0），0.1%SDS，0.1%Triton X-100）， 摇匀。4℃15,000rpm离心10min，取10μl上清于新管中，加入90μl保温至 37℃的反应液（1mM MUG），37℃反应60分钟，加入900μl终止液（0.2M Na2CO3）， 室温终止反应。用F-4500（日立）型荧光分光光度计在360nm激发波长和460nm吸 收波长下检测相对4-MU含量。以牛血清蛋白为对照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit 测定蛋白质含量。实验重复三次，每次每个植株测定5粒种子。
表1.8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株的GUS活性
植株编号 GUS活性（pmol4-MU min-1μg-1蛋白） SSP-1-1 17.50±2.86 SSP-1-2 10.68±2.25 SSP-1-3 44.87±5.83 SSP-1-4 5.79±0.77 SSP-1-5 15.83±2.68 SSP-1-6 22.81±2.91 SSP-1-7 14.84±2.67 SSP-1-8 5.27±1.83
注：表中数值为平均值±标准差。
结果表明，8株T0代转pGPTV-SSP-1-GUS水稻植株中，GUS活性最大值为44.87pmol 4-MU min-1μg-1蛋白，最小值为5.27pmol4-MU min-1μg-1蛋白，平均值为17.20pmol 4-MU min-1μg-1蛋白；8株水稻Kitaake植株的GUS活性均为0pmol4-MU min-1μg-1蛋白。