技术领域
本发明涉及水稻侧根发生控制基因，具体涉及水稻侧根发生控制基因OsHK1及编码
的蛋白质。
背景技术
植物根系主要可分为直根系和须根系，水稻根系构型为须根系。须根系植物的根系由种子根、不定根和侧根组成，由于庞大的侧根，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。在高等植物中，侧根起始于主根上特定的细胞层－中柱鞘，根据其所背邻的维管组织，可将其分为两种细胞类型：在双子叶植物拟南芥中，侧根起始于临近木质部的中柱鞘细胞；在如水稻、玉米谷类作物中，侧根起始于临近原生韧皮部的中柱鞘细胞。水稻侧根的发育过程与拟南芥比较相似，首先两个临近的中柱鞘细胞进行垂周分裂，继而进行多次的垂周、平周分裂，原基逐渐膨大，并逐步穿过皮层，到最终突破表皮。水稻侧根的发育增强，对水稻生长及高产具有重要意义。如授权公告号为CN102268081的发明专利，就公开了水稻侧根控制基因OsIAA11及编码的蛋白质，该水稻侧根控制基因OsIAA11是从Osiaa11突变体中克隆的基因，具有控制水稻侧根发育的功能，可培育出侧根控制功能较好的转基因水稻。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻侧根发生控制基因OsHK1及编码的蛋白
质，该控制基因OsHK1及编码的蛋白质可以使水稻对细胞分裂素不敏感，从而选育出控制侧根发生和生长的转基因水稻。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：水稻侧根发生控制基因OsHK1，该控制基因OsHK1全长为5964bp（OsHK1基因号：LOC_Os02g50480），其中CDS长为2994bp，CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。若CDS核苷酸序列中在466bp处添加了如SEQ ID NO：3所示的44bp序列，成为突变体Oshk1-1水稻。或者CDS核苷酸序列中在2923bp处的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），成为突变体Oshk1-2水稻。
本发明的基因改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中其它的添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
水稻侧根发生控制基因OsHK1编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，当控制基因OsHK1的CDS核苷酸序列中在466bp处增加了如SEQ ID NO：3所示的44bp序列时，造成翻译提前终止，编码产物只有如SEQ ID NO：4所示的176个氨基酸，突变的氨基酸位置位于CHASE结构域。当CDS核苷酸序列中在2923bp处的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶时，氨基酸序列中975位的脯氨酸替换成了丝氨酸，该位点位于接收域。
本发明的蛋白质改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中其它的添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生产的衍生物。
与现有技术相比，本发明的优点在于水稻侧根发生控制基因OsHK1及编码的蛋白质，控制基因OsHK1全长为5964bp，其中CDS长为2994bp， CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，该控制基因OsHK1中CDS的添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体，其编码的蛋白质表现为使水稻对细胞分裂素不敏感，而细胞分裂素抑制水稻侧根的发生但促进已生成的侧根的伸长，导致突变体侧根能正常发生，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。通过利用该基因对水稻品种进行转基因改造，因此本发明提供了水稻侧根发育的分子调控机制，并为通过基因工程手段调控水稻根系结构提供了基础。
附图说明
图1为水稻细胞分裂素不敏感突变体Oshk1-1和野生型秀水63在正常条件和0.2μM 6-BA处理7天后的全株照（A）和根部照（B）；
图2为基因和编码的蛋白质的结构图和突变位点，图2中，A是基因结构和突变位点（箭头所指）；B是蛋白质结构和突变方式（箭头所指），数字代表对应功能域的氨基酸位点；
图3为功能互补实验T1代转基因水稻的表型（A）和两个回复株系（OV1和OV2）的RT-PCR检测图（B）；
图4为转基因回复载体pCAMBIA-1300的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本发明人从实验室发展的EMS（ethyl methylsulfonate）诱变的籼稻（Oryza Sativa L. ssp japonica）地方品种秀水63和日本晴突变体库中各筛选到一个水稻细胞分裂素不敏感（外源细胞分裂素不抑制侧根发生）突变体Oshk1-1（CDS核苷酸序列中在466bp处添加了44bp序列）和Oshk1-2（CDS核苷酸序列中2923bp处的C突变为T），这两个突变体是符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体。在正常条件下突变体与野生型相比无明显表型差异，但对外源施加的细胞分裂素几乎完全不敏感，在0.2μM 6-BA处理的条件下，突变体侧根能正常发生，而野生型在同样的条件则不能形成侧根（图1）。本发明人采用基因图位克隆方法分离OsHK1基因。首先创建了一个F2定位群体，由Oshk1突变体为母本，野生型籼稻Kasalath为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。并利用SSR（Simple Sequence Repeats）分子标记对OsHK1位点进行初步定位，粗定位结果表明突变体Oshk1-1和Oshk1-2是等位突变体，突变基因被定位在第2染色体上的标记RM5472和RM250之间，遗传距离分别为1.1cM和8.9cM。根据水稻基因注释信息，该区间有一个水稻细胞分裂素受体OsHK1。我们通过测序和比对发现OsHK1基因发生了突变，该基因DNA全长为5964bp，其中CDS长为2994bp。OsHK1含有四分结构域，分别为CHASE结构域（细胞分裂素结合区）、两个跨膜结构域、传递域(或称为激酶域，histidine kinase domain)和接收域（receiver domain）。突变体Oshk1-1在CDS序列的466bp处增加了44bp，根据预测该突变造成翻译提前终止，编码产物只有176个氨基酸，突变的氨基酸位置位于CHASE结构域；突变体Oshk1-2在CDS序列的2923bp处的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），引起所编码的氨基酸序列中975位的脯氨酸替换成了丝氨酸，该位点位于接收域（图2）。为了确证突变体表型是由OsHK1基因突变引起的。我们对突变体进行了转基因回复验证。将由35S启动子驱动的完整的OsHK1 CDS序列（SEQ ID NO：1）克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1300改中。将构建好的回复载体通过农杆菌介导转化突变体Oshk1-1愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。转化了外源OsHK1基因的突变体（转基因阳性株系）对外源细胞分裂素的响应和野生型一样，侧根发生受到抑制（图3A）。抽提野生型和两个转基因阳性株系的叶片的RNA，逆转录成cDNA。半定量RT-PCR结果表明，转基因阳性株系中的确超表达了OsHK1基因（图3B）。转基因回复试验确证了突变体表型是由OsHK1基因突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。结果表明，我们克隆的水稻OsHK1基因具有一定的应用价值，可以通过利用该基因对作物品种进行转基因改造。
实施例2，突变体的筛选和表型
以EMS诱变的秀水63和日本晴突变体库为突变体筛选对象，M2种子用蒸馏水冲洗干净，0.6%稀HNO3破休眠处理16hr，37℃暗处催芽至露白。将露白的种子移至尼龙纱网上，进行细胞分裂素处理。在正常水稻培养液（培养液配方为国际水稻所标准配方）中加入0.2μM 6-BA，在温度为30/22 ℃(昼/夜)左右、光照12小时条件下，培养7天，通过比较根系生长情况筛选对细胞分裂素反应异常的突变体，从秀水63和日本晴突变体库中各筛选到1个细胞分裂素不敏感的突变体（侧根能正常发生）（图1），即水稻细胞分裂素介导的侧根发生缺陷突变体Oshk1-1和Oshk1-2。
实施例3，基因定位
F2定位群体是由纯合体（Oshk1-1）和籼稻品种Kasalath杂交获得的，总共鉴定出155个细胞分裂素不敏感表型的F2个体，采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约2cm水稻幼嫩叶片，经液氮冷冻，在1.5ml的离心管中将叶片磨成粉末，提取总DNA，获得的DNA溶解于200μl无菌水中。每个SSR反应用2μl DNA样品。在OsHK1基因的定位试验中，先对30个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，然后在7%的丙烯酰胺凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性，对于30个F2个体中没有重组子的SSR引物，再扩大定位群体。
实施例4，基因预测和序列分析
根据基因定位的结果，OsHK1基因位于第2染色体上的标记RM5472和RM250之间，遗传距离分别为1.1cM和8.9cM。根据TIGR（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/）的水稻基因注释信息，对定位的染色体区段内基因进行预测分析，发现该区间有一个细胞分裂素受体OsHK1基因。用野生型和Oshk1突变体cDNA为模板对OsHK1基因进行扩增，扩增产物分别测序，测序结果进行比对分析，发现突变体Oshk1-1在CDS序列ATG后的466bp处增加了44bp，导致翻译提前终止；突变体Oshk1-2在CDS序列ATG后的2923bp处的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，引起编码的氨基酸序列中975位的脯氨酸替换成了丝氨酸（图2）。
实施例5，突变体中OsHK1基因的功能互补验证
根据OsRHL1基因的CDS序列信息，设计扩增完整ORF的引物，引物上游序列： AAAGTCGACC CACTAGCCAG ACCATCATCA，下游序列： AAATCTAGAC CACTAGCCAG ACCATCATCA。以秀水63的根部cDNA为模板，用高保真酶PrimerSTAR DNA Polymerase扩增出OsHK1基因的ORF，与 pUCm-T连接，连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。测序确定序列正确后的质粒用KpnI、XbaI双酶切后与同样经KpnI、XbaI双酶切的pCAMBIA1300改载体（图4）连接，连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。酶切检测正确的质粒通过农杆菌株系EHA105介导的水稻遗传转化体系导入到突变体Oshk1-1中，经过侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌（EHA105）介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994）报道的方法基础上进行优化。该转基因植株中分离的Oshk1-1突变体对6-BA的响应回复成野生型（图3A），说明Oshk1-1的表型确实是有OsHK1突变引起的。该水稻细胞分裂素介导的侧根发生控制基因OsHK1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；该基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。为了检测转基因阳性植株是否超表达了OsHK1基因，采用Trizol法分别提取秀水63和2个转基因回复株系叶片的总RNA（我们构建的回复载体为CaMV 35S组成型表达启动子，如果为转基因阳性植株，那么原本不表达的地上部也会超表达OsHK1基因），逆转录成cDNA。半定量反应时，各样品的cDNA模板量先通过OsActin基因的表达量调成一致（扩增条件：58℃，26个循环），再扩增目的基因。目的基因的上游引物序列为：ACCTATAAGGGCAAGCACAAT；下游引物序列为：ATCCAACGCCTTCCTTTC。目的基因长度为361bp，扩增条件为：55℃，28个循环。半定量RT-PCR结果如图3B，证明了转基因阳性株系中的确超表达了OsHK1基因。pCAMBIA1300改载体为本实验室的改造载体，是以市售的pCAMBIA-1300载体为基本骨架，在多克隆位点插入35S启动子和Nos终止子而得到的增强表达载体。
以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多突变型，即在SEQ ID NO：1中添加、取代、插入或缺失一个或几个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，与SEQ ID NO：1所示的cDNA序列至少有80%同源性的基因序列，用于构建具有水稻侧根发生控制功能的转基因水稻。SEQ ID NO：2所示的蛋白质属于细胞分裂素不敏感功能蛋白，其中进行一个或几个氨基酸替换，插入或缺失所获得的功能类似物。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变型，均应是本发明的保护范围。
<110>宁波大学
<120>水稻侧根发生控制基因OsHK1及编码的蛋白质
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2994
<212> DNA
<213>水稻侧根发生控制基因OsHK1
<220>
<221> CDS
<400> 1
atggggaagc cggaggcgag gagtgggtgg aggaacgcgg cggcggcggc gtgggtgctg 60
gtggccgtgg cgtgcgcggc gtacatgcac tggcacctgc ggcgggagac catggaccgc 120
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atgtttgaga accagcaggg atggattatg aagacgatga agcgacaggc tgcgcctcca 420
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gctgtgttga caaacccatt caggttgctt gggtcaaacc acttgggggt agttctcact 600
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<210>2
<211>997
<212>PRT
<213>水稻侧根发生控制基因OsHK1编码的蛋白质
<400>2
Met Gly Lys Pro Glu Ala Arg Ser Gly Trp Arg Asn Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Trp Val Leu Val Ala Val Ala Cys Ala Ala Tyr Met His
20 25 30
Trp His Leu Arg Arg Glu Thr Met Asp Arg Ala Glu Glu Arg Leu
35 40 45
Val Ser Met Cys Glu Glu Arg Ala Arg Met Leu Gln Glu Gln Phe
50 55 60
Gly Val Thr Val Asn His Val His Ala Leu Ala Ile Leu Ile Ser
65 70 75
Thr Phe His Phe Glu Lys Phe Pro Ser Ala Ile Asp Gln Asp Thr
80 85 90
Phe Ala Lys Tyr Thr Ala Arg Thr Ser Phe Glu Arg Pro Leu Leu
95 100 105
Asn Gly Val Ala Tyr Ala Gln Arg Ile Phe His His Glu Arg Glu
110 115 120
Met Phe Glu Asn Gln Gln Gly Trp Ile Met Lys Thr Met Lys Arg
125 130 135
Gln Ala Ala Pro Pro Gln Asp Glu Tyr Ala Pro Val Ile Phe Ser
140 145 150
Gln Asp Thr Val Ser Tyr Leu Ala Arg Ile Asp Met Met Ser Gly
155 160 165
Glu Glu Asp Arg Glu Asn Ile Leu Arg Ala Arg Ala Thr Gly Lys
170 175 180
Ala Val Leu Thr Asn Pro Phe Arg Leu Leu Gly Ser Asn His Leu
185 190 195
Gly Val Val Leu Thr Phe Ala Val Tyr Arg Pro Gly Leu Ala Ala
200 205 210
Asp Ala Ser Val Glu Glu Arg Val Glu Ala Thr Ala Gly Cys Leu
215 220 225
Val Val Val Val Ser Ser Asn Gln Ile Pro Thr Asn Arg Tyr Leu
230 235 240
Gly Gly Ala Phe Asp Val Glu Ser Leu Val Glu Asn Leu Leu Ser
245 250 255
Lys Leu Ala Gly Asn Gln Asp Ile Val Val Asn Val Tyr Asp Val
260 265 270
Thr Asn Ala Ser Glu Pro Met Ala Met Tyr Gly Pro Gln Ser Pro
275 280 285
Asp Gly Lys Val Ser Leu Phe His Val Ser Thr Leu Asp Phe Gly
290 295 300
Asp Pro Phe Arg Ala His Glu Met Arg Cys Arg Tyr Arg Gln Lys
305 310 315
Pro Pro Leu Pro Trp Ser Ala Ile Thr Asn Pro Leu Gly Thr Phe
320 325 330
Val Ile Trp Met Leu Val Gly Tyr Ile Ile Cys Ala Ala Trp Ser
335 340 345
Arg Tyr Asp Lys Val Ser Glu Asp Cys Arg Lys Met Glu Glu Leu
350 355 360
Lys Thr Gln Ala Glu Ala Ala Asp Val Ala Lys Ser Gln Phe Leu
365 370 375
Ala Thr Val Ser His Glu Ile Arg Thr Pro Met Asn Gly Val Leu
380 385 390
Val Val Gln Arg Ser Lys Ile Leu Pro Phe Asp Val Gly Met Leu
395 400 405
Asp Met Leu Leu Gly Thr Asp Leu Ser Met Thr Gln Lys Asp Tyr
410 415 420
Ala Gln Thr Ala Gln Met Cys Gly Arg Ala Leu Ile Thr Leu Ile
425 430 435
Asn Asp Val Leu Asp Arg Ala Lys Ile Glu Ala Gly Lys Leu Glu
440 445 450
Leu Glu Ala Val Pro Phe Asp Leu Arg Ser Leu Met Asp Asp Val
455 460 465
Ile Ser Leu Phe Ser Ser Lys Ser Arg Glu Lys Cys Ile Glu Leu
470 475 480
Ala Val Phe Val Cys Asp Asp Val Pro Lys Val Val Ile Gly Asp
485 490 495
Pro Trp Arg Tyr Arg Gln Ile Leu Thr Asn Leu Val Gly Asn Ala
500 505 510
Val Lys Phe Thr Glu Arg Gly His Val Phe Val Arg Val Cys Leu
515 520 525
Ala Glu Asn Ser Lys Val Glu Ala Asn Gln Val Leu Asn Gly Thr
530 535 540
Met Asn Gly Lys Asp Gly Lys Val Glu Thr Thr Ala Asn Gly Ala
545 550 555
Phe Asn Thr Leu Ser Gly Phe Gln Ala Ala Asp Glu Arg Asn Asn
560 565 570
Trp Asp Tyr Phe Lys Leu Leu Leu Ser Asp Lys Glu Pro His Met
575 580 585
Asp Glu Leu Glu Cys Asp Arg Ser Tyr Gln Asn Asp Cys Asp Cys
590 595 600
Val Thr Leu Met Ile Ser Ile Glu Asp Thr Gly Val Gly Ile Pro
605 610 615
Leu His Ala Gln Asp Arg Val Phe Thr Pro Phe Met Gln Ala Asp
620 625 630
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635 640 645
Ile Ser Lys Cys Leu Ala Glu Leu Met Gly Gly Gln Ile Ser Phe
650 655 660
Thr Ser Arg Pro Phe Val Gly Ser Thr Phe Thr Phe Ser Ala Val
665 670 675
Leu Lys Arg Ser Cys Lys Asp Thr Ser Ser Asp Ser Lys Arg Ser
680 685 690
Leu Ser Glu Ala Leu Pro Thr Ala Phe Lys Gly Met Lys Ala Ile
695 700 705
Leu Val Asp Gly Arg Pro Val Arg Gly Ala Val Thr Arg Tyr His
710 715 720
Leu Asn Arg Leu Gly Ile Val Val Lys Val Val Asn Asn Leu Ser
725 730 735
Met Gly Leu Gln Thr Leu Ala Gly Gln Asn Gly Val Lys Glu Ser
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Asn Asn Gly Gln Val His Glu Leu Pro Lys Leu Val Leu Leu Val
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Gln Gln Leu Leu Lys Val Val Met Pro Glu Arg Lys Asp Asn Gln
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Asn Arg Pro Ser Phe Leu Arg Ser Leu Leu Ile Gly Lys Asn Ile
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Leu Ile Val Asp Asp Asn Lys Val Asn Leu Arg Val Ala Ala Ala
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Ala Leu Lys Lys Tyr Gly Ala Lys Val His Cys Val Glu Ser Gly
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Lys Asp Ala Val Ser Leu Leu Gln Gln Pro His Cys Phe Asp Ala
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Cys Phe Met Asp Val Gln Met Pro Glu Met Asp Gly Phe Glu Ala
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Thr Arg Gln Ile Arg Gln Met Glu Val Lys Ala Asn Glu Glu Arg
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Lys Ala Leu Asp Leu Met Glu Gly Ser Thr Phe Val Glu Ser His
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Leu Pro Val Leu Ala Met Thr Ala Asp Val Ile Gln Ala Thr Tyr
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<212>PRT
<213>水稻突变体Oshk1-1编码的蛋白质
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