技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性蛋白酶HuPro 及其基因和应用。
背景技术
蛋白酶是一类催化多肽或蛋白质水解的酶的统称。按水解底物的部位可分为内 肽酶和外肽酶，前者水解蛋白质中间部分的肽键，后者则自蛋白质的氨基或羧基末 端逐步降解氨基酸残基。
中性蛋白酶有着广泛的应用，例如：造纸，酿造，纺织，饲料等领域。但是， 不同的工业应用，对蛋白酶的性质的需求是不同的，如：饲料工业需要嗜酸的蛋白 酶，能源、纺织工业需要中碱性的中性蛋白酶。目前工业应用的中性蛋白酶，主要 来自Trichoderma和Penicillium spp.，这些酶的最适pH在5.0左右，最适温度在50-60 度之间，而中性、热稳定性好的酶则有更好的优势：耐热可以提高反应速率，降低 底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。
本发明的中性蛋白酶具有以下性质：最适pH8.0，在pH5.0～10.0范围内具有50% 以上的酶活力，最适温度65℃，良好的热稳定性，在65℃处理1个小时酶活几乎没 有损失，并且具有很高耐蛋白质变性剂和有机溶剂等特性。热稳定性优良并在中性 和碱性范围内具有较高酶活力的特性使其在洗涤、纺织、食品工业应用上具有很大 的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的耐热中性蛋白酶。
本发明的再一目的是提供编码上述耐热中性蛋白酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述耐热中性蛋白酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述耐热中性蛋白酶的应用。
本发明从腐质霉(Humicola sp.L8)中分离得到一种新的耐高温中性蛋白酶HuPro。
本发明提供了一种中性蛋白酶HuPro，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
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其中，该酶包括535个氨基酸和一个终止密码子，N-端15个氨基酸为信号肽， 因此，成熟的中性蛋白酶HuPro的理论分子量为56.3kDa
因此，成熟的中性蛋白酶HuPro的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示
aprasvdtihsdaapilsssnaeivpnsyiikfkkhvnddkvqahhawiqeihsdreaqradlrkrglvddvfrglkhtykigs
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本发明的HuPro同时具有好的热稳定性，常温下，在中性和碱性的范围内均具 有高活性。本发明的中性蛋白酶，其最适pH值为8.0，在pH5.0～10.0的范围内维 持50%以上的酶活性；最适温度为65℃，在65℃和70℃具有良好的热稳定性。
本发明提供了编码上述耐热中性蛋白酶的基因hupro。具体地，该基因的序列如 SEQ ID NO.2所示：
atgagaggccttttcgctctctctctcgcggcctgcgtcgctgctgcgccgcgcgccagcgtcgacaccatccacagtgatgccg
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成熟中性蛋白酶HuPro编码基因序列如SEQ ID NO.4所示
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本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了中性蛋白酶基因HuPro，发现其没有内含 子，cDNA全序列分析结果表明，中性蛋白酶HuPro的结构基因CelH61全长1608bp。 成熟蛋白理论分子量为56.3kDa，将中性蛋白酶基因hupro序列及推导出的氨基酸序 列在GenBank中进行BLAST比对，确定HuPro是一种新的中性丝氨酸蛋白酶。
本发明还提供了包含上述中性蛋白酶基因hupro的重组载体，命名为pPIC- hupro。将本发明的中性蛋白酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使 其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方 案，优选为将本发明的中性蛋白酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制 性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组 酵母表达质粒pPIC9-hupro。
本发明还提供了包含上述耐热中性蛋白酶基因hupro的重组菌株，优选所述菌株 为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/hupro。
本发明还提供了一种制备耐高温中性蛋白酶HuPro的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组中性蛋白酶表达；
3)回收并纯化所表达的中性蛋白酶HuPro。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞， 优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株 GS115/hupro。
本发明还提供了上述耐高温中性蛋白酶HuPro的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 并适合于在洗涤、纺织工业中应用新的中性蛋白酶。本发明的中性蛋白酶最适pH为 8.0，在pH5.0～10.0都有较高的酶活性。其耐热特性，可使其在需求高温环境的工 业生产上应用。
附图说明
图1重组中性蛋白酶HuPro的最适pH。
图2重组中性蛋白酶HuPro的pH稳定性。
图3重组中性蛋白酶HuPro的最适温度。
图4重组中性蛋白酶HuPro的热稳定性。
图5重组中性蛋白酶HuPro蛋白酶抑制剂和有机溶剂抗性。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：本发明从腐质霉(Humicola sp.L8)中到分离得到一种新的中性 中性蛋白酶HuPro。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公 司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
（1）Humicola sp.L8培养基为马铃薯培养基：1000mL 200g土豆煮汁，10g葡 萄糖，25g琼脂，pH5.5。
（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。
（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004%Biotin， 1%甘油(V/V)。
（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同， pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆 实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和 产品说明书进行。
实施例1 腐质霉Humicola sp.L8中性蛋白酶编码基因HuPro的克隆
提取Humicola sp.L8基因组DNA：
将PDB（200g/L土豆煮汁，葡萄糖20g/L）液体培养5天的培养物离心收集菌 体放入研钵中加入液氮研磨5min,然后利用真菌提取试剂盒提取其基因组DNA， 加入适量TE溶解，置于-20℃备用。
根据真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因的保守(GHGTHV和GTSMASPH)序列设计合 成了简并引物P1，P2
P1:5′-GGCCAYGGNACNCAYGT-3′；
P2:5′-RTGNGGNSWNGCCATNSWNGTNCC-3′)。
以Humicola sp.L8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5 min；然后94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保 温10min。得到一约519bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体连接后送博迈 德公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物： 设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2 的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度 在60～65℃。并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3(上游特异性引物)、dsp1、dsp2、 dsp3(下游特异性引物)见表1。
表1.中性蛋白酶CelH61 TAIL-PCR特异性引物
通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德 公司测序。拼接后HuPro中性蛋白酶基因全长1608bp，编码535个氨基酸和一个终 止密码子，前段15个氨基酸为信号肽序列，无内含子。预测该基因所编码的成熟蛋 白的理论分子量为56.3kDa。
实施例2 重组中性蛋白酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码中性蛋白酶的基因 celH61双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟中性蛋白酶的基因片段（不包含信号肽 序列）与表达载体pPIC9连接，获得含有Humicola sp.L8中性蛋白酶基因hupro的 重组质粒pPIC-hupro并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/hupro。
以同样的方法构建完整基因序列（含信号肽序列）的表达载体，并转化赤酵母 菌株。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm 振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm 振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定微晶中性蛋白酶的活力。重组中性蛋 白酶的表达量为22.6U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组中性蛋白酶在毕赤酵母中得 到了表达。重组中性蛋白酶的比活为98.6U/mg。
实施例3 重组中性蛋白酶的活性分析
丝氨酸蛋白酶测定方法采用福林-酚试剂法测定。适当稀释的酶液1ml，加入 2%酪素1ml（pH 8.0），于65℃水浴中反应15分钟，如后加入10%的三氯乙酸（TCA） 2ml，离心取上清1ml，加入0.4mol/L的碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，37℃ 水浴中显色15分钟，在680nm波长比色，测定光密度。在65℃，pH 8.0的条件下 每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
实施例4 重组中性蛋白酶HuPro的性质测定
1、重组中性蛋白酶HuPro的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将实施例3纯化的重组中性蛋白酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适 pH。底物酪素用不同pH的缓冲液中65℃下进行中性蛋白酶活力测定。结果(图1) 表明，重组酶CelH61的最适pH为8.0，在pH5.0～10.0有50%以上的相对酶活性。 中性蛋白酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH8.0缓冲液体 系中65℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。在pH5.0～11.0，处理后酶活保持基 本不变，有很好的稳定性（图2）。
2、中性蛋白酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
中性蛋白酶的最适温度的测定为在缓冲液(pH8.0)体系下在不同温度下进行酶促 反应。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为65℃。耐温性测定为中性蛋 白酶在不同温度下处理不同时间，再在65℃下进行酶活性测定。酶的热稳定性性试 验表明(图4)，HuPro有良好的热稳定性，在65℃下温育1h，酶活保持不变，70℃ 时其半衰期为30min。
3、不同蛋白酶抑制剂对HuPro酶活的影响测定如下：
在酶促反应体系中加入不同的蛋白酶抑制剂EDTA，DTT，和PMSF，研究其对 酶活性的影响，各种物质终浓度为10mmol/L。在65℃、pH8.0条件下测定酶活性。 结果表明，EDTA和DTT对重组中性蛋白酶的活力没有明显变化（图5）。但是PMSF 几乎可以完全抑制其活力。说明HuPro是一种丝氨酸蛋白酶而不是金属蛋白酶。
4、HuPro底物特异性测定如下：
底物特异性测定方法：反应加入1ml的不同底物，分别为2%酪素（casein），2% 的bovine serum albumin(BSA),2%bovine hemoglobin(BHb),2%gelatin,和2%pure milk.在65℃、pH8.0条件下测定酶活性。经测定表明（表1），HuPro对各种底物均有 酶活性，其中对酪素酶活力最高，其次为milk>BHb>BSA>gelatin.
表1 中性蛋白酶HuPro的底物特异性